專利名稱：非限制性構建無縫質粒表達載體的方法
技術領域：
本發明專利涉及一種非限制性構建無縫質粒表達載體的方法，重組質粒構建的方法，屬于基因工程或分子生物學技術領域。
背景技術：
在構建重組質粒實驗過程中，經常需要兩個基因片段融合并確保得到的質粒能正確表達所需要的氨基酸序列。對于此類的質粒構建，經常遇到所使用的質粒載體中無合適的酶切位點，導致常規的內切酶處理-連接酶連接的方法不適用。目前構建這一類重組質粒的主要方法有PCR定點突變產生酶切位點法，細菌體內同源重組法，平齊末端連接法，PCR與T4DNA聚合酶結合產生粘性末端連接法，In-Fusion法等。通過DNA突變產生酶切位點的方法是利用氨基酸編碼序列的簡并性產生酶切位點同時又保證氨基酸序列正確，該方法非常繁瑣從而限制了其廣泛使用。體內同源重組法是利用位于目的片段兩端與受體質 粒同源的序列在細菌細胞內與受體質粒發生同源重組而得到所需的質粒；這一方法雖然簡單，但效率低，不能確保成功。平齊末端連接法的缺點為連接效率低，且重組質粒有50%的幾率含有反向連接的目的片段。PCR與T4DNA聚合酶結合產生粘性末端連接法簡單易行，但要求在目的片段末端12個堿基中不含四種堿基中的其中一種。In-Fusion法的缺點為構建重組質粒成功率與序列有關。近年來，Bitinaite等人發現了一種新的構建重組質粒的方法，即利用USER (Uracil-Specific Excision Reagent)酶產生粘性末端，將多個DNA片段“無縫”連接，然后插入載體中。這一方法的缺點是需要特定的載體PNEB206A。

發明內容
本發明的目的在于提供了一種非限制性構建無縫質粒表達載體的方法，該方法實現了將目的DNA片段插入任何質粒載體或置換質粒載體的任何部位，在構建融合基因后確保融合基因開放閱讀框的正確性；構建過程操作簡單，構建重組質粒的效率高技術解決方案本發明是利用化學合成兩對含有dU的PCR引物，用于分別放大目的DNA片段和質粒載體，然后使用USER酶酶切放大的目的DNA片段和質粒載體PCR產物使其末端產生互補的粘性末端，再將其產物的混合物轉入感受態E. coli細胞，利用細胞內的重組機制產生所要的質粒。方法步驟如下(I)依據目的片段的DNA序列和載體質粒的DNA序列，寫出重組質粒的DNA序列；⑵PCR弓丨物設計設計兩對含有dU的PCR引物；a.第一對引物用于擴增目的DNA片段設計方法是根據重組質粒DNA序列在插入目的DNA片段與質粒載體之間5'端和3'端靠近接縫處各找一長度為6-11個堿基序列作為5'粘性末端搭接區和3'粘性末端搭接區；5'粘性末端搭接區和3'粘性末端搭接區是第一個堿基為A，最后一個堿基為T的DNA序列；設計正向引物使其5'端的DNA序列與5'粘性末端搭接區一致，正向引物對應粘性末端搭接區3' T的位置用dU替換，正向引物其它部分的DNA序列需跨入目的片段部位DNA序列至少10個堿基，與其一致；設計反向引物使其5'端的DNA序列與3'粘性末端搭接區反向互補，反向引物對應粘性末端搭接區5' A互補的位置的T用dU替換，反向引物其余部分的DNA序列需跨入目的片段部位DNA序列至少10個堿基，與其反向互補；b.第二對引物是用來擴增質粒載體正向引物設計方法是使其5'端的DNA序列與3，粘性末端搭接區一致，正向引物對應粘性末端搭接區3' T的位置用dU替換，正向引物其它部分的DNA序列需跨入質粒載體部位DNA序列至少10個堿基，與其一致；設計反向引物使其5'端的DNA序列與5'粘性末端搭接區反向互補，反向引物對應粘性末端搭接區5' A互補的位置的T用dU替換，反向引物其余部分的DNA序列需跨入質粒載體部位DNA序列至少10個堿基，與其反向互補；(3)PCR擴增使用上述設計的兩對引物，分別以含有目的DNA片段的質粒和載體 質粒作為模板，采用高保真度DNA聚合酶進行PCR擴增分別得到目的片段DNA和質粒載體DNA ；PCR產物用I μ I (20個酶活單位)Dpn I酶37°C水浴l_2h以去除模板DNA ；(4)用USER酶處理PCR產物取I μ I (10個酶活單位)USER酶加入步驟(3) Dpn I酶處理后的產物(無需純化)中，37°C水浴l_2h后6-11個堿基的DNA片段會自動脫落，產生目的DNA片段和質粒載體相匹配的粘性末端；(5)酶切產物轉化感受態細胞將酶切后目的DNA片段6 μ I與質粒載體2 μ I混合轉化大腸桿菌DH5CI感受態細胞，將轉化的細胞涂到含抗生素的培養基平板上篩選陽性菌落。(6)用菌落PCR方法鑒定陽性菌落，挑取陽性克隆子送測序中心測序。本發明具有不受內切酶位點限制且無需酶連接，將目的DNA片段插入任何質粒載體或置換質粒載體的任何部位，無需額外加入任何堿基；在構建融合基因后確保融合基因開放閱讀框的正確性；構建重組質粒成功率與序列無關；構建過程操作簡單，構建重組質粒的效率高，最大程度上增加了質粒構建的靈活性、隨意性及應用的廣泛性。


圖I是目的DNA片段電泳圖。M為IOObp Marker，I為空白對照，2_4為擴增片段；圖2是質粒載體電泳圖。M為Ikb Marker, 1-2為擴增片段；圖3是重組質粒電泳圖。M為Ikb Marker, 1-2為重組質粒；圖4是鑒定陽性克隆子電泳圖。M為DL3000Marker，l_6為擴增出的目的片段HIVgp41。
具體實施例方式實例I :目的構建在大腸桿菌中表達HIV_lgp41保守片段與BLS融合基因的載體，要求保持開放閱讀框正確。材料載體質粒pl531攜帶有HIV-I外殼蛋白基因gp41、質粒pET-28a_BLS是大腸桿菌表達載體攜帶有BLS編碼蛋白基因(以上兩質粒均來自本實驗室質粒庫)、高保真度 DNA 聚合酶(Pfu)、dNTP、10XBuffer、Dpn I、DNA Marker (以上試劑均購自 TaKaRaBiotechnology), USER 酶(購自 New England Bio Labs),大腸桿菌 DH5 α 用 CaCl2 法自制感受態。方法以pET-28a_BLS為基礎，使用載體質粒pl531攜帶的HIV-1外殼蛋白基因gp41替代pET-28a-BLS質粒中編碼蛋白BLS前27個氨基酸的81個堿基。替代的結果將產生一個具有正確閱讀框的HIV-I外殼蛋白gp41基因與編碼蛋白BLS基因的融合蛋白基因。為了獲得正確的氨基酸序列，目的基因片段必須與質粒載體在接縫處銜接，不能引入其它序列。在pET-28a-BLS質粒的BLS基因和gp41目的基因片段中，都未能找到可利用的酶切位點以實現這一基因融合。I、引物的設計根據目的基因片段和載體質粒的DNA序列，寫出重組質粒的DNA序列；5’端接縫 I載體序列ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGT目的序列GAGTGGGAGAGAGAAATTGACAATTACACAAAC重組序列ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGG￡GAGTGGGAGAGAGAAATTGACAATTACACAAAC5’粘性末端搭接區3’端接縫I載體序列TCCTTTAAAATCGCATTCATTCAGGCCC目的序列TTTTTACTGTGCTTTCTATAGTGAATAGA重組序列TTTTTACTGTGCTTTCTATAGTGAATAGATCCTTTAAAATCGCATTCATTCAGGCCC3’粘性末端搭接區所設計引物序列如下01(gpl60-f) AGCAAATGGGUGAGTGGGAGAGA02(gpl60-r) AAAGGATCUATTCACTATAGAAA03 (pET-28a-f) AGATCCTTUAAAATCGCATTCAT04 (pET-28a-r) ACCCATTTGCUGTCCACCAGTCA在兩個接縫附近分別選AGCAAATGGGT和AGATCCTTT作為5 '粘性末端搭接區和3'粘性末端搭接區。由此設計的引物01和02用于通過PCR放大目的DNA片段。其中引物01的5'端DNA序列與5'粘性末端搭接區一致，01引物對應粘性末端搭接區3' T的位置在化學合成時用dU替換，OI引物其余部分的DNA序列與目的DNA片段一致；引物02的5'端DNA序列與3'粘性末端彳合接區反向互補，02引物對應粘性末端彳合接區5' A互補的位置的T在化學合成時用dU替換，02引物其余部分的DNA序列與目的DNA片段反向互補。設計的引物03和04用于通過PCR放大質粒載體，引物03的5'端的DNA序列與3'粘性末端搭接區一致，03引物對應粘性末端搭接區3' T的位置在化學合成時用dU替換，03引物其余部分的DNA序列與質粒載體一致；引物04的5'端DNA序列與5'粘性末端搭接區反向互補，04引物對應粘性末端搭接區5' A互補的位置的T在化學合成時用dU替換，04引物其余部分的DNA序列與質粒載體反向互補。粘性末端搭接區堿基數通常為6-11個。2、PCR擴增PCR的體積是25 μ I。兩個PCR管中的底物分別是攜帶gp41基因的質粒pl531 (01/02做引物)和載體質粒pET-28a-BLS (03/04做引物)。先使用40°C退火溫度放大10個循環，然后取I μ I產物為模板，在60°C退火溫度放大25個循環。A、目的DNA片段PCR反應體系和程序為目的DNA片段的PCR反應體系(25 μ I體系):
IOx擴增緩沖液2.5 μ
dNTP MIX(IOmM)0.5 μ
引物 01(10 μΜ)I μ
引物 02(10 μΜ)I μ
質粒 pi531I μ
高保真酶(Pfu)I μ (2.5個酶活單位)
備2018 μ 目的DNA片段的PCR反應程序(先用退火溫度為40°C擴增10個循環)
95 °C 5min ^95 °C I min_ >40°Cl min_ 72 °C 45 s ^
10 cycly72 °C IOmin擴增結束后取1μ I反應產物為模板，用退火溫度為60°C，25個循環進行PCR擴增。反應體系和反應條件如下PCR反應體系(25 μ I體系):
IOx擴增緩沖液2.5 μ
dNTP MIX(IOmM) 0.5 μ 引物 01(10 μΜ)I μ
引物 02(10 μΜ)I μ
PCR反應產物I μ
高保真酶(Pfo)I μ (2.5個酶活單位)
ddH2018 μ PCR反應程序95 °C 5 min^95°C I min— 600CI min— 72 45 sn25 cycly
72 10 minB、質粒載體PCR反應體系和程序為質粒載體的PCR反應體系(25 μ I體系)
IOx擴增緩沖液2.5 μ
dNTP MIX(IOmM)0.5 μ
引物 03(10 μΜ)I μ
引物 04(10 μΜ)I μ
pET-28a-BLS 質粒I μ
高保真酶(Pfu)I μ (2.5個酶活單位)
ddH2018 μ 質粒載體的PCR反應程序(先用退火溫度為40°C擴增10個循環)
95 V 5 min ^95 °C I min—^OOl min_> 72°C Smin^
10 cycly 72 °C IOmin擴增結束后取1μ I反應產物為模板，用退火溫度為60°C，25個循環進行PCR擴增。反應體系和反應條件如下PCR反應體系(25 μ I體系):
IOx擴增緩沖液2.5 μ
dNTP MIX(10 mM) 0.5 μ 引物 03(10 μΜ)I μ
引物 04(10 μΜ)I μ
PCR反應產物I μ
高保真酶(Pfu)I μ (2.5個酶活單位)
ddH2018 μ PCR反應程序95 °C 5 min ^95 °C I ιη η-^ Ο min—^72°C 5min ^
25cycly72 0C IOminPCR擴增結束后，分別取p 1531質粒和pET_28a_BLS質粒的PCR反應產物17μ I加入I μ I (20個酶活單位)Dpn I酶和2 μ 110XBuffer37°C水浴2h除去模板DNA。3、用USER酶處理PCR產物取I μ I (10個酶活單位)USER酶加入上述步驟Dpn I酶處理后的產物(無需純化)中，37°C水浴2h后6-11個堿基的DNA片段會自動脫落，產生目的DNA片段和質粒載體相匹配的粘性末端；4、酶切產物轉化感受態細胞將酶切后目的DNA片段6 μ I與質粒載體2 μ I混合轉化大腸桿菌DH5CI感受態細胞，將轉化的細胞涂到含卡那霉素的培養基平板上篩選陽性菌落。 5、用菌落PCR方法鑒定陽性菌落，挑取陽性克隆子送測序中心測序。結果由于目的DNA片段采用了非限制性構建無縫質粒表達載體的構建方法，其片段中無限制性酶切位點，所以不能使用酶切的方法鑒定結果。先采用菌落PCR的方法進行結果初篩，將得到的陽性克隆子送山東省農業科學院甘心技術研究中心測序，序列均正確。實例2 目的構建在大腸桿菌中表達豬型布魯氏菌S2的外殼蛋白Omp31抗原決定簇與BLS融合基因的載體，要求保持開放閱讀框正確。材料載體質粒pET28a攜帶有豬型布魯氏菌S2的外殼蛋白Omp31抗原決定簇基因、質粒pET-28a-BLS是大腸桿菌表達載體攜帶有BLS編碼蛋白基因(以上兩質粒均來自本實驗室質粒庫)、高保真度DNA聚合酶(Pfu)、dNTP、10XBuffer、Dpn I、DNAMarker (以上試劑均購自 TaKaRa Biotechnology)，USER 酶(購自 New England Bio Labs),大腸桿菌DH5a用CaClJi自制感受態。方法以pET-28a_BLS為基礎，使用載體質粒pET28a攜帶的豬型布魯氏菌S2的外殼蛋白0mp31抗原決定簇基因替代pET-28a-BLS質粒中編碼蛋白BLS前27個氨基酸的81個堿基。替代的結果將產生一個具有正確閱讀框的豬型布魯氏菌S2的外殼蛋白0mp31抗原決定簇基因與編碼蛋白BLS基因的融合蛋白基因。為了獲得正確的氨基酸序列，目的基因片段必須與質粒載體在接縫處銜接，不能引入其它序列。在pET-28a-BLS質粒的BLS基因和pET28a攜帶的0mp31抗原決定簇基因片段中，都未能找到可利用的酶切位點以實現這一基因融合。I、引物的設計根據目的基因片段和載體質粒的DNA序列，寫出重組質粒的DNA序列。5’端接縫I載體序列ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGT目的序列TATGCCATCAACAACAACTGGACGCT
重組序列ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGITATGCCATCAACAACAACTGGACGCT5’粘性末端搭接區3’端接縫I載體序列TCCTTTAAAATCGCATTCATTCAGGCCC目的序列TTGACAATAGCTTCCTTGAGAGCAAGGTC重組序列TTGACAATAGCTTCCTTGAGAGCAAGGTCTCCTTTAAAATCGCATTCATTCAGGCCC3’柏性末端搭接區 所設計引物序列如下01(omp31-f) AGCAAATGGGUTATGCCATCAACAAC02(omp31-r) :AAGGAGACCUTGCTCTCAAGGAAGC03 (pET28a-BLS-f) AGGTCTCCTUTAAAATCGCATTCAT04 (pET28a-BLS-r) ACCCATTTGCUGTCCACCAGTCA在兩個接縫附近分別選AGCAAATGGGT和AGGTCTCCTT做為5'粘性末端搭接區和3'粘性末端搭接區。由此設計的引物01和02用于通過PCR放大目的DNA片段；其中引物01的5'端DNA序列與5'粘性末端搭接區一致，01引物對應粘性末端搭接區3' T的位置在化學合成時用dU替換，01引物其余部分的DNA序列與目的DNA片段一致；引物02的5'端DNA序列與3'粘性末端彳合接區反向互補，02引物對應粘性末端彳合接區5' A互補的位置的T在化學合成時用dU替換，02引物其余部分的DNA序列與目的DNA片段反向互補。設計的引物03和04用于通過PCR放大質粒載體，引物03的5'端的DNA序列與3'粘性末端搭接區一致，03引物對應粘性末端搭接區3' T的位置在化學合成時用dU替換，03引物其余部分的DNA序列與質粒載體一致；引物04的5'端DNA序列與5'粘性末端搭接區反向互補，04引物對應粘性末端搭接區5' A互補的位置的T在化學合成時用dU替換，04引物其余部分的DNA序列與質粒載體反向互補。粘性末端搭接區堿基數通常為6-11個。2,PCR擴增PCR的體積是25 μ I。兩個PCR管中的底物分別是攜帶0mp31抗原決定簇基因的質粒pET28a (01/02做引物)和載體質粒pET-28a-BLS (03/04做引物)。先使用40°C退火溫度放大10個循環，然后取I μ I產物為模板，在60°C退火溫度放大25個循環。A、目的DNA片段PCR反應體系和程序為目的DNA片段的PCR反應體系(25 μ I體系):
IOx擴增緩沖液2.5 μ
dNTP MIX(10 mM)0.5 μ
引物 01(10 μΜ)I μ
引物 02(10 μΜ)I μ
pET28a 質粒Ιμ
高保真酶(Pfu)I μ (2.5個酶活單位)

ddH2018 μ
目的DNA片段的PCR反應程序(先用退火溫度為40°C擴增10個循環)
95 0C 5 min ^950C I min— >400CI min— 72°C 45 10 cycly 72 °C IOmin擴增結束后取1μ I反應產物為模板，用退火溫度為60°C，25個循環進行PCR擴增。反應體系和反應條件如下 PCR反應體系(25 μ I體系)
IOx擴增緩沖液2.5 μ
dNTP MIX(IOmM) 0.5 μ
引物 01(10 μΜ)I μ
引物 02(10 μΜ)I μ
PCR反應產物I μ
高保真酶(PfU)I μ (2.5個酶活單位)
(IdH2O18 μ PCR反應程序
95 0C 5 min ^95°C I min__ 60°Cl min_^ 72°C 45 25 cycly
72 °C IOminB、質粒載體PCR反應體系和程序為質粒載體的PCR反應體系(25 μ I體系)
IOx擴增緩沖液2.5 μ
dNTP MIX(IOmM)0.5 μ
引物 03(10 μΜ)I μ
引物 04(10 μΜ)I μ
pET-28a-BLS 質粒I μ
高保真酶(Pfli)I μ (2.5個酶活單位)
ddH2018 μ
質粒載體的PCR反應程序(先用退火溫度為40°C擴增10個循環)
95 0C 5 min ^95 °C I min_ >40。。I min__^ 72 0C Smin-^
10 cycly 72 0C 10 min擴增結束后取1μ I反應產物為模板，用退火溫度為60°C，25個循環進行PCR擴增。反應體系和反應條件如下PCR反應體系(25 μ I體系)
IOx擴增緩沖液2.5 μ
dNTP MIX(IOmM) 0.5 μ
引物 03(10 μΜ)I μ
引物 04(10 μΜ)I μ
PCR反應產物I μ
高保真酶(Pfu)I μ (2.5個酶活單位)
MH2O18 μ PCR反應程序
95 °C 5 min ^ .95 °C I min__ .60 °C I min 72 V 5min_^
25 cycly 72 0C IOminPCR擴增結束后，分別取含0mp31抗原決定簇基因質粒pET28a和pET_28a_BLS質粒的PCR反應產物17 μ I加入I μ I (20個酶活單位)Dpn I酶和2 μ 110XBuffer37°C水浴2h除去模板DNA。3、用USER酶處理PCR產物取I μ 1(10個酶活單位)USER酶加入上述步驟Dpn I酶處理后的產物(無需純化)中，37°C水浴2h后6-11個堿基的DNA片段會自動脫落，產生目的DNA片段和質粒載體相匹配的粘性末端；4、酶切產物轉化感受態細胞將酶切后目的DNA片段6 μ I與質粒載體2 μ I混合轉化大腸桿菌DH5CI感受態細胞，將轉化的細胞涂到含卡那霉素的培養基平板上篩選陽性菌落。5、用菌落PCR方法鑒定陽性菌落，挑取陽性克隆子送測序中心測序。結果由于目的DNA片段采用了非限制性構建無縫質粒表達載體的構建方法，其片段中無限制性酶切位點，所以不能使用酶切的方法鑒定結果。先采用菌落PCR的方法進行結果初篩，將得到的陽性克隆子送山東省農業科學院甘心技術研究中心測序，序列均正確。
實例3:目的用HIV-I毒株WITO的相應區替代真核表達載體pl531所攜帶的HIV-1SF162外殼蛋白基因(Env)中的C3-C5編碼區，要求開放閱讀框正確。材料載體質粒P1531-WIT0攜帶有HIV-1WIT0外殼蛋白基因、基礎質粒P1531-SF162攜帶有編碼SF162的外殼蛋白基因(以上兩質粒均來自本實驗室質粒庫)、高保真度 DNA 聚合酶(Pfu)、dNTP、10XBuffer、Dpn I、DNA Marker (以上試劑均購自 TaKaRaBiotechnology), USER 酶(購自 New England Bio Labs),大腸桿菌 DH5 α 用 CaCl2 法自制感受態。方法基礎載體質粒攜帶有HIV-1SF162外殼蛋白基因(Env)。在將要構建的重組質粒中，基礎載體質粒中SF162外殼蛋白基因的C3-C5區用另一 HIV-I毒株WITO的相應區替代。替代的結果將產生一具有正確閱讀框的HIV-I融合蛋白外殼基因。為了獲得正確的氨基酸序列，目的基因片段必須與質粒載體在接縫處銜接。在基礎質粒載體的Env基因C3-C5區和WITO的目的基因片段中，都未能找到可利用的酶切位點以實現這一基因融合。 I、引物的設計根據目的基因片段和載體質粒的DNA序列，寫出重組質粒的DNA序列。5，端接縫I目的片段 GCCATAATAGGAGATATAAGAAAA初始載體GTATACATATAGGACCGGGGAGAGCAITTTATACAACAGGT重組質粒GTATACATATAGGACCGGGGAGAGCATTTTATACAACAGGIGCCATAATAGGAGATATAAGAAAA5’粘性末端搭接區3’端接縫I目的片段-CAGTAGCCAGAACGAAACCTTCAGACCTGGAGGAGGAAATATGAAG初始載體GACAATTGGAGAAGTGAATTAT 目的質粒-CAGTAGCCAGAACGAAACCTTCAGACCTGGAGGAGGAAATATGAAGGACAATIGGAGAAGTGAATTAT3’粘性末端搭接區所設計引物序列如下OI (WITO-f) 5，-ATACAACAGGUGCCATAATAGGAG02 (WITO-r) 5，-AATTGTCCTUCATATTTCCTCCTCC03(pl531-f)5’ -AAGGACAATUGGAGAAGTGAATTAT04(pl531-r)5’ -ACCTGTTGTAUAAAATGCTCTCCC在兩個接縫附近分別選ATACAACAGGT和AAGGACAATT做為5'粘性末端搭接區和3'粘性末端搭接區。由此設計的引物01和02用于通過PCR放大目的DNA片段；其中引物01的5'端DNA序列與5'粘性末端搭接區一致，01引物對應粘性末端搭接區3' T的位置在化學合成時用dU替換，01引物其余部分的DNA序列與目的DNA片段一致；引物02的5'端DNA序列與3'粘性末端彳合接區反向互補，02引物對應粘性末端彳合接區5' A互補的位置的T在化學合成時用dU替換，02引物其余部分的DNA序列與目的DNA片段反向互補。設計的引物03和04用于通過PCR放大質粒載體，引物03的5'端的DNA序列與3'粘性末端搭接區一致，03引物對應粘性末端搭接3' T的位置在化學合成時用dU替換，03引物其余部分的DNA序列與質粒載體一致；引物04的5'端DNA序列與5'粘性末端搭接區反向互補，04引物對應粘性末端搭接區5' A互補的位置的T在化學合成時用dU替換，04引物其余部分的DNA序列與質粒載體反向互補。粘性末端搭接區堿基數通常為6-11個。2、PCR擴增 0 的體積是25 4 1。兩個？0 管中的底物分別是攜帶!11￥-1111'0外殼蛋白基因質粒pl531-WIT0(01/02做引物)和基礎質粒pl531-SF162攜帶編碼HIV-I SF162的外殼蛋白基因(03/04做引物)。先使用40°C退火溫度放大10個循環，然后取1μ I產物為模板，在60°C退火溫度放大25個循環。A、目的DNA片段PCR反應體系和程序為目的DNA片段的PCR反應體系(25 μ I體系)
IOx擴增緩沖液2.5 μ
dNTP MIX(IOmM)0.5 μ
引物 01(10 μΜ)I μ
引物 02(10 μΜ)I μ
ρ1531-WITO 質粒I μ
高保真酶(Pftl)I μ (2.5個酶活單位)
ddH2018 μ 目的DNA片段的PCR反應程序(先用退火溫度為40°C擴增10個循環)
95 0C 5 min^95 0C I min—>.400CI min— 72°C 45s ^
10 cycly72 °C 10 min擴增結束后取1μ I反應產物為模板，用退火溫度為60°C，25個循環進行PCR擴增。反應體系和反應條件如下PCR反應體系(25 μ I體系)IOx擴增緩沖液2.5 μ
dNTP MIX(IOmM)0.5 μ 引物 01(10 μΜ) I μ 引物 02(10 μΜ) I μ PCR反應產物 I μ 高保真酶(Pfu) I μ (2.5個酶活單位)
ddH2018 μ PCR反應程序
95 0C 5 min ^95 0C I min >60。。I min__ 72 0C 45s，
25 cycly
72 °C IOminB、質粒載體PCR反應體系和程序為質粒載體的PCR反應體系(25 μ I體系)
IOx擴增緩沖液2.5 μ
dNTP MIX(IOmM)0.5 μ
引物 03(10 μΜ)I μ
引物 04(10 μΜ)I μ
質粒 pl531-SF162I μ
高保真酶(Pfu)Ιμ (2.5個酶活單位)
ddH2018 μ 質粒載體的PCR反應程序(先用退火溫度為40°C擴增10個循環)
95 °C 5 min^95 0C I min— 40°C I min— 72。。Smir^
10 cycly72 V 10 min擴增結束后取1μ I反應產物為模板，用退火溫度為60°C，25個循環進行PCR擴增。反應體系和反應條件如下PCR反應體系(25 μ I體系)IOx擴增緩沖液2.5 μ
dNTP MIX(IOmM)0.5 μ
引物 03(10 μΜ)I μ
引物 04(10 μΜ)I μ
PCR反應產物I μ
高保真酶(Pfb)I μ (2.5個酶活單位)
dcfflbO18 μ PCR反應程序
95 O 5 min ^.95 °C I min_^60。。I min_^ 720C 5min_^
25 cycly 72 0C IOmin PCR擴增結束后，分別取pl531-WIT0質粒和質粒pl531_SF162的PCR反應產物17 μ I加入I μ I (20個酶活單位)Dpn I酶和2 μ 110XBuffer37°C水浴2h除去模板DNA。3、用USER酶處理PCR產物取I μ 1(10個酶活單位)USER酶加入上述步驟Dpn I酶處理后的產物(無需純化)中，37°C水浴2h后6-11個堿基的DNA片段會自動脫落，產生目的DNA片段和質粒載體相匹配的粘性末端；4、酶切產物轉化感受態細胞將酶切后目的DNA片段6 μ I與質粒載體2 μ I混合轉化大腸桿菌DH5CI感受態細胞，將轉化的細胞涂到含氨芐青霉素的培養基平板上篩選陽性菌落。5、用菌落PCR方法鑒定陽性菌落、挑取克隆子送測序中心測序。結果由于目的基因片段采用了非限制性構建無縫質粒表達載體的構建方法，其片段中無限制性酶切位點，所以不能使用酶切的方法鑒定結果。先采用菌落PCR的方法進行結果初篩，將得到的陽性克隆子送山東省農業科學院甘心技術研究中心測序，序列均正確。
權利要求
1.非限制性構建無縫質粒表達載體的方法，包括如下步驟 (1)依據目的片段的DNA序列和載體質粒的DNA序列，寫出重組質粒的DNA序列； (2)PCR引物設計設計兩對含有dU的PCR引物； a.第一對引物用于擴增目的DNA片段 設計方法是根據重組質粒DNA序列在插入目的DNA片段與質粒載體之間5'端和3'端靠近接縫處各找一長度為6-11個堿基序列作為5'粘性末端搭接區和3'粘性末端搭接區；5'粘性末端搭接區和3/粘性末端搭接區是第一個堿基為A，最后一個堿基為T的DNA序列；設計正向引物使其5'端的DNA序列與5'粘性末端搭接區一致，正向引物對應粘性末端搭接區3/ T的位置用dU替換，正向引物其它部分的DNA序列需跨入目的片段部位DNA序列至少10個堿基，與其一致；設計反向引物使其5'端的DNA序列與3'粘性末端搭接區反向互補，反向引物對應粘性末端搭接區5' A互補的位置的T用dU替換，反向引物其余部分的DNA序列需跨入目的片段部位DNA序列至少10個堿基，與其反向互補； b.第二對引物是用來擴增質粒載體 正向引物設計方法是使其5'端的DNA序列與3'粘性末端搭接區一致，正向引物對應粘性末端搭接區3' T的位置用dU替換，正向引物其它部分的DNA序列需跨入質粒載體部位DNA序列至少10個堿基，與其一致；設計反向引物使其5'端的DNA序列與5'粘性末端搭接區反向互補，反向引物對應粘性末端搭接區5' A互補的位置的T用dU替換，反向引物其余部分的DNA序列需跨入質粒載體部位DNA序列至少10個堿基，與其反向互補； (3)PCR擴增使用上述設計的兩對引物，分別以含有目的DNA片段的質粒和載體質粒作為模板，采用高保真度DNA聚合酶進行PCR擴增分別得到目的片段DNA和質粒載體DNA ；PCR產物用20個酶活單位的Dpn I酶37°C水浴l_2h以去除模板DNA ； (4)用USER酶處理步驟(3)產物取10個酶活單位的USER酶加入步驟(3)Dpn I酶處理后無需純化的產物中，37°C水浴l_2h后6-11個堿基的DNA片段會自動脫落，產生目的DNA片段和質粒載體相匹配的粘性末端； (5)將步驟(4)得到的具有粘性末端的目的DNA片段和質粒載體的混合物按體積比3 I的比例混合轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，將轉化的細胞涂到含抗生素的培養基平板上篩選陽性菌落； (6)用菌落PCR方法鑒定陽性菌落，挑取陽性克隆子送測序中心測序。
2.根據權利要求I所述的非限制性構建無縫質粒表達載體的方法，其特征在于，將目的DNA片段插入任何質粒載體或置換質粒載體的任何部位構建重組質粒。
全文摘要
本發明涉及一種非限制性構建無縫質粒表達載體的方法，屬于基因工程或分子生物學技術領域。在構建重組質粒實驗過程中，經常遇到需要將兩個基因片段融合并確保得到的質粒能正確表達所需要的氨基酸序列，但因所使用的載體中無合適的酶切位點，導致常規的內切酶處理-連接酶連接的方法不適用。本發明通過USER酶的使用，分別在目的片段與載體兩端產生粘性末端，可以將目的基因片段非限制性的插入或置換任何載體的任何部位，無需額外加入任何堿基；同時確保融合基因開放閱讀框的正確性。本發明的優勢為構建重組質粒時不受到載體質粒和目的基因片段酶切位點的限制，為非限制性載體構建，并且獲得陽性重組子的效率高。
文檔編號C12N15/66GK102925471SQ20121029474
公開日2013年2月13日 申請日期2012年8月10日 優先權日2012年8月10日
發明者王建英, 王晶妍, 陳敏潔 申請人:內蒙古科技大學