專利名稱：虹鱒腸炎紅嘴病的pcr檢測方法及檢測用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及腸炎紅嘴病的PCR檢測方法及檢測用引物。
背景技術：
虹鱒腸炎紅嘴病(Enteric redmouth disease,ERM)又稱為腸性紅嘴病、鮭鱒魚血點病，由魯氏耶爾森氏菌感染引起，主要經ロ傳染。由于皮下出血導致嘴及咽喉發紅，外部癥狀表現為下頜發紅或潰爛，體色變黑，鰭基充血，兩側眼球外突，活動遲緩，食欲下降或絕食，肌肉、體內脂肪及消化道出血，有時消化道積黃色液體，腎臟及脾臟微腫。該病主要在虹鱒養殖區流行，危害體長為7. 5厘米以下的魚體，對虹鱒養殖產業造成了嚴重經濟損失。該病易與虹鱒弧菌病、疥瘡病混淆。目前對該病的檢測主要是根據其臨床癥狀來推測，準確率相對較低，容易導致誤診。對病原菌則主要是采用傳統的生理生化鑒定方法， 耗時耗カ且準確率不高，因此有必要研究ー種針對該病原的快速、靈敏、可操作性強的檢測方法，以便用于ERM的早期診斷。
發明內容
本發明是要解決現有的虹鱒腸炎紅嘴病的檢測存在耗時耗カ且準確率不高的問題，而提供虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測方法及檢測用引物。虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測用引物的上游引物YR-F的核苷酸序列為TGGAGGGGGATAACTACT,下游引物 YR-R 的核苷酸序列ACAITTCACAACACGAGC。虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測方法，按以下步驟進行一、提取虹鱒腸炎紅嘴病的病原魯氏耶爾森氏菌的總DNA作為模板，根據Genbank數據庫中Y.ruckeri 16S rRNA基因序列(登錄號AB681666. 1)，利用Primer Primier 5設計ー對特異性引物，進行PCR擴增，獲得擴增產物；ニ、PCR擴增產物經凝膠成像系統觀察，若在946bp處有目的片段，則確定結果為陽性，若在946bp處沒有目的片段，則確定結果為陰性，即完成虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測；其中步驟一中特異性引物的上游引物YR-F的核苷酸序列5’-TGGAGGGGGATAACTACT-3’ ；下游引物 YR-R 的核苷酸序列5 ’-ACAITTCACAACACGAGC-3 ’。本發明設計的特異性引物YR-F/YR-R可有效擴增魯氏菌16S rRNA基因片段，其檢測精度達到IOpg的模板DNA，且檢測成本相對較低。本發明虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測方法操作簡單，可迅速診斷虹鱒紅嘴病，準確度高、靈敏且低濃度下敏感性很好。本發明虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測方法從樣品采集、細菌培養到菌落PCR鑒定所需時間不超過24h，結合病魚臨床病癥，可迅速準確的診斷虹鱒魚腸炎紅嘴病。
圖I為實施例中魯氏耶爾森氏菌16S rRNA基因PCR擴增結果的電泳圖，其中M :DL2000marker,泳道I :以魯氏菌基因組DNA為模板，泳道2 :陰性對照；圖2為對照實驗中PCR特異性試驗結果的電泳圖，其中M DL2000marker,泳道I 泳道4:分別以魯氏耶爾森氏菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和遲緩愛德華氏菌基因組DNA為模板進行PCR擴增；圖3為PCR敏感性試驗結果的電泳圖，其中M DL2000marker,泳道I 泳道6，模板濃度依次為100ng、10ng、lng、100pg、10pg、lpg,泳道7 :陰性對照。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測用引物的上游引物YR-F的核苷酸序列為TGGAGGGGGATAACTACT，下游引物YR-R的核苷酸序列 ACATTTCACAACACGAGC。
具體實施方式
ニ 采用具體實施方式
一中所述引物進行虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測方法，按以下步驟進行一、提取虹鱒腸炎紅嘴病的病原魯氏耶爾森氏菌的總DNA作為模板，根據Genbank數據庫中Y. ruckeri 16S rRNA基因序列(登錄號AB681666. I),利用Primer Primier 5設計ー對特異性引物，進行PCR擴增，獲得擴增產物；ニ、PCR擴增產物經凝膠成像系統觀察，若在946bp處有目的片段，則確定結果為陽性，若在946bp處沒有目的片段，則確定結果為陰性，即完成虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測；其中步驟一中特異性引物的上游引物YR-F的核苷酸序列5’ -TGGAGGGGGATAACTACT-3’ ；下游引物 YR-R 的核苷酸序列5’ -ACAITTCACAACACGAGC-3’。本實施方式中確定結果為陽性即虹鱒患有腸炎紅嘴病；確定結果為陰性即虹鱒患有的不是腸炎紅嘴病。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同是步驟一中PCR擴增的反應體系為25 ii L反應體系，由下列成分組成
成分用量
模板I |iL
IOpM 引物 YR-FI^iL
IOjiM 引物 YR-RI^iL
IOx PCRbuffer2.5|iL
IOmM 的 dNTP0.5|iL
25mM 的 MgCl2l.5|iL
5U/[iL Taq DNApolymerase0.2|iL
ddH2017.3|iLPCR擴增條件為95°C預變性5!^11，94で變性308，55で退火308，72で延伸60s，共30個循環，再72°C延伸10min，4°C結束反應。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。本實施方式中魯氏耶爾森氏菌(Yersinia ruckeri) ATCC 29473,它為購買得到。本實施方式中Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR試劑購自寶生物工程有限公司；細菌基因組DNA試劑盒購自天根生化科技有限公司(試劑盒貨號DP302-02) ;PCR儀為美國Biorad公司的SlOOO型號。實施例虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測方法，按以下步驟進行一、提取虹鱒腸炎紅嘴病的病原魯氏耶爾森氏菌的總DNA作為模板，根據Genbank數據庫中Y.ruckeri 16S rRNA基因序列(登錄號AB681666. 1)，利用Primer Primier 5設計ー對特異性引物，進行PCR擴增，獲得擴增產物；ニ、PCR擴增產物經凝膠成像系統觀察，若在946bp處有目的片段，則確定結果為陽性，若在946bp處沒有目的片段，則確定結果為陰性，即完成虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測；
其中步驟一中特異性引物的上游引物YR-F的核苷酸序列5’-TGGAGGGGGATAACTACT-3’ ；下游引物 YR-R 的核苷酸序列5 ’-ACAITTCACAACACGAGC-3 ’。本實施例中確定結果為陽性即虹鱒患有腸炎紅嘴病；確定結果為陰性即虹鱒患有的不是腸炎紅嘴病。本實施例中PCR擴增的反應體系為25 ii L反應體系，由下列成分組成
成分用量
模板I pL
IOpM 引物 YR-FI^L
IO1IM 引物 YR-RI^L
IOx PCRbuffer2.5|iL
IOmM 的 dNTP0.5|iL
25mM 的 MgCl21.5|iL
5l.J/[iL Taq DNA polymerase0.2|iL
ddH20] 7.3 |iLPCR擴增條件為95°C預變性5!^11，94で變性308，55で退火308，72で延伸60s，共30個循環，再72°C延伸10min，4°C結束反應。本實施例中魯氏耶爾森氏菌(Yersinia ruckeri) ATCC 29473,它為購買得到。結果在預期的946bp處有目的片段擴增(如圖I)。對照實驗分別以魯氏耶爾森氏菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和遲緩愛德華氏菌的基因組DNA為模板，利用YR-F/YR-R引物進行PCR擴增。本實施例中嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila) ATCC7966,它為購買得到；溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)ATCC9071 ;它為購買得到；遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda) ATCC 23685，它為購買得到。
對照實驗結果僅魯氏耶爾森氏菌能在預期的946bp處有目的片段擴増，而其他三株細菌均未擴增出任何DNA條帶(如圖2)。PCR敏感性試驗結果將魯氏耶爾森氏菌基因組DNA模板分別稀釋至IOOng/ii L、IOng/ii L、lng/ii L、IOOpg/ u L，IOpg/ ii L和lpg/ u L的濃度，并分別取I u L作模板進行PCR擴增。結果表明，本方法可檢測到IOpg的魯氏菌基因組DNA模板(如圖3)，可見本方法在低濃度下敏感性很好。菌落PCR試驗結果鑒于以基因組DNA為模板需要先挑取單菌落置于TSB液體培養基中振搖過夜，并用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，步驟相對繁瑣，因此選用菌落PCR作為定性檢測魯氏耶爾森氏菌的方法。 將魯氏耶爾森氏菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌分別劃線培養，用滅菌牙簽從單菌落上挑取少量菌體作為模板，利用YR-F/YR-R引物進行PCR擴增，并與常規PCR結果進行比較。結果表明，菌落PCR和常規PCR方法均能有效擴增魯氏菌16SrRNA基因的目的條帶，而其他菌株檢測結果為陰性。
權利要求
1.虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測用引物，其特征在于虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測用引物的上游引物YR-F的核苷酸序列為TGGAGGGGGATAACTACT，下游引物YR-R的核苷酸序列ACATTTCACAACACGAGC。
2.如權利要求I所述虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測用引物進行虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測方法，其特征在于虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測方法，按以下步驟進行一、提取虹鱒腸炎紅嘴病的病原魯氏耶爾森氏菌的總DNA作為模板，根據Genbank數據庫中Y. ruckeril6SrRNA基因序列(登錄號AB681666. I),利用Primer Primier 5設ii^一對特異性引物,進行PCR擴增，獲得擴增產物；二、PCR擴增產物經凝膠成像系統觀察，若在946bp處有目的片段，則確定結果為陽性，若在946bp處沒有目的片段，則確定結果為陰性，即完成虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測； 其中步驟一中特異性引物的上游引物YR-F的核苷酸序列5’ -TGGAGGGGGATAACTACT-3’ ；下游引物 YR-R 的核苷酸序列5’ -ACAITTCACAACACGAGC-3’。
3.根據權利要求2所述的虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測方法，其特征在于步驟一中PCR擴增的反應體系為25 μ L反應體系，由下列成分組成 成分用量 模板I pL ΙΟμΜ 引物 YR-F ΙΟμΜ 引物 YR-R IOx PCRbuffer2.5μ IOinM 的 dNTP0.5μ 25mM 的 MgCl2Ι.5μ 5U/pL Taq DNA polymerase0.2μ ddH2017 μ L PCR擴增條件為95°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，Il C延伸60s，共30個循環，再72°C延伸10min，4°C結束反應。
全文摘要
虹鱒腸炎紅嘴病的PCR檢測方法及檢測用引物，涉及腸炎紅嘴病的PCR檢測方法及檢測用引物。它為了解決現有的虹鱒腸炎紅嘴病的檢測存在耗時耗力且準確率不高問題。檢測用引物上游引物YR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，下游引物YR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。方法一、提取虹鱒腸炎紅嘴病的病原魯氏耶爾森氏菌的總DNA作為模板，設計引物，PCR擴增；二、擴增產物觀察，鑒定后即完成。本發明設計的特異性引物檢測精度達到10pg的模板DNA，且檢測成本相對較低；檢測方法操作簡單，可迅速診斷虹鱒紅嘴病，準確度高、靈敏且低濃度下敏感性很好，鑒定所需時間不超過24h。
文檔編號C12R1/01GK102766698SQ20121029586
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月20日 優先權日2012年8月20日
發明者盧彤巖, 李紹戊 申請人:中國水產科學研究院黑龍江水產研究所