專利名稱：一種雜合肽囊素佐劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子免疫學技術領域，具體涉及一種雜合肽囊素佐劑及其制備方法和應用。
背景技術：
Lys-His-Gly-NH2三肽是一種可以誘導B淋巴細胞分化的激素樣物質，它不僅可以通過誘導干細胞的分化和作用于B淋巴細胞對機體免疫球蛋白的多樣化性產生影響，而且還可以促進機體的IgM向IgG的方向發生變轉，因其最早是從雞法氏囊中提取的，所以稱之為囊素三肽。1991年，Aydhya等發現囊素不僅僅存在于禽類法氏囊中，還存在于哺乳動 物的骨髓和膽管上皮細胞中。在哺乳動物中分離的囊素是以前囊素狀態出現的，它是一種序列為 Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg 的 14 妝結構。從序列上我們可以看出其第9位、第10位和第11位這三個連續的氨基酸正好是囊素三肽的序列。Aydhya的研究還證實了此14肽的前囊素與囊素三肽有著相似的生物學活性。因此，我們可以推斷融合狀態的前囊素并不影響三肽生物活性的發揮。近年來國外對有免疫活性的多肽的序列和結構有詳細的研究，其中有一種叫做加加尼翁(Gagnon’s peptide)的四肽,其氨基酸序列為Lys-Asn-Pro_Tyr。這個四肽序列被證實也是B細胞刺激物，可以增加雞新城疫疫苗等抗體效價。為了研究重組疫苗免疫佐劑，本研究利用分子生物學的方法設計了 14個囊素三肽和2個加加尼翁四肽的雜合序列，并在序列的末端增加了 6個組氨酸的標簽序列，最終序列長度為197bp，我們命名其為雜合肽囊素N197。通過合成N197的雜合多肽序列以及體外和體內動物實驗來驗證基因工程免疫增強劑雜合多肽的免疫活性。

發明內容
(一)本發明要解決的技術問題是提供一種可廣泛用于疫苗制備，生產成本低，免疫佐劑效果好的新型雜合肽囊素免疫佐劑及其制備方法和應用。(二)本發明的技術方案是I雜合肽囊素N197的設計合成14個囊素三肽的氨基酸序列(Lys-HiS-Gly-NH2)和2個加加尼翁活性四肽的氨基酸序列(Lys-Asn-Pro-Tyr)所對應的密碼子共有150bp的核苷酸。另外，在核酸序列的前面添加一個起始密碼子的序列(3bp)和一個限制性內切酶EcoRI的酶切位點(6bp)。在序列的末端加上6個組氨酸的序列(18bp)，一個終止密碼子(3bp)，另外加上三個限制性內切酶(Xho I1Sal I1Pst I)的核酸序列(17bp)。這樣設計好的雜合肽囊素核酸序列共包括197個核苷酸(N197序列)。2含有雜合肽囊素N197序列原核表達載體的構建與鑒定把合成好的雜合肽囊素N197序列與線性化后的PET32a(Novagen公司商品化產品)原核表達載體進行連接，連接產物轉化大腸桿菌宿主后，用酶切鑒定的方法篩選含N197的PET32a載體的宿主菌。3雜合肽囊素在大腸桿菌中的誘導表達以終濃度為ImM的IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)對含雜合肽囊素序列的宿主菌進行誘導表達，同時以含PET32a空載體質粒的BL-21菌同樣誘導處理后樣品為陰性對照。以SDS-PAGE電泳結果來分析雜合肽囊素在大腸桿菌中的表達水平。4重組大腸桿菌雜合肽囊素N197的純化利用SDS-PAGE電泳來對雜合肽囊素N197的表達條帶進行分離，并通過切膠回收的方法對重組雜合肽囊素N197進行分離、純化，并可以進一步利用SDS-PAGE電泳對切膠回收的雜合肽囊素N197的純度進行分析。 5純化后的重組雜合肽囊素N197的體外免疫活性測定(碧云天生物公司的CCK8試劑盒)取雞外周血，并分離出淋巴細胞，在LPS的作用下，測定純化后的重組雜合肽囊素N197在體外促進B淋巴細胞增殖的免疫活性，并設立相應的陰性對照和空白對照。6重組雜合肽囊素N197體外免疫佐劑活性的測定把I日齡的SPF級白色來航雞在SPF飼養至10日齡后分為A，B，C和D等4組，每組3只雞。其中A組為商品化的雞傳染性法氏囊病滅活疫苗免疫組(采用市售商品化雞傳染性法氏囊病的滅活苗在雞頸部皮下注射200 μ I) ；Β組為聯合免疫組(用商品化的雞傳染性法氏囊病滅活疫苗頸部皮下注射加200 μ I切膠回收的O. 14mg/ml的N197) ；C組為陽性攻毒組(不免疫，進行攻毒);D組為空白對照組(不免疫，不攻毒)。對各組中需要免疫的雞只按上述方案進行免疫，在24日齡時加強免疫一次，疫苗接種劑量及各組免疫增強劑的添加情況同第一次免疫。7雜合肽囊素N197對商品化雞IBD疫苗免疫抗體水平的影響在第二次免疫13日后，即雞群37日齡時對雞群進行翅靜脈采血。具體方法如下
(I)固定雞只，使雞的翅膀上翻(注意勿使雞翅膀折傷或脫臼)；(2)在雞翅中部選取翅靜脈比較清楚的位置用70%酒精棉球消毒并使血管得以擴張;(3)用Iml的一次性無菌注射器在消毒部位采血約Iml/只；(4)將采集的雞血在室溫放置Ih后于4°C冰箱過夜。次日，以2000rpm，4°C離心IOmin并小心吸取上清；(5)采用瓊擴實驗方法測定血清中雞IBD抗體的水平和效價。中間孔加入標準雞傳染性法氏囊病瓊擴抗原，周圍的孔中分別加入采集的免疫雞群及對照組實驗雞只的抗血清。8雜合肽囊素N197對攻毒后雞法氏囊的保護作用分析雞群采血后立即對其進行攻毒，每只雞采用滴眼的方式滴加90 μ I雞IBDV的強毒株BC6/85的病毒液(約1000 EID5tlX攻毒6天后，處死所有雞群并對其進行剖檢。主要取雞的脾臟和法氏囊組織稱重后立即放入10%的福爾馬林溶液進行固定后進行病理切片分析。(三)本發明其有益效果是目前，畜禽疫苗所使用的佐劑主要還是礦物油類佐劑為主，雖然油佐劑的免疫效果得到了認可，但是其的主要缺陷在于其具有一定的毒副作用(引起局部炎癥等等)。本研究制備的雜合肽囊素N197作為疫苗佐劑主要有如下幾方面的有益效果I雜合肽囊素N197是一種高效、低廉，安全的畜禽疫苗佐劑囊素三肽作為疫苗佐劑的免疫促進作用已被廣泛證實，但是由于天然提取的囊素三肽工藝復雜，得率較低，成本昂貴，所以用天然提取的囊素工作畜禽用佐劑幾乎沒有可能性。而本研究采用大腸桿菌系統在體外表達雜合肽囊素N197，此方法獲得的重組蛋白的效率很高，且大腸桿菌系統生產外源蛋白的成本比較低，因此，雜合肽囊素N197是一種高效，低廉的免疫佐劑。另外，由于囊素三肽和加加尼翁活性四肽是家禽等生物體內本身存在的一種小肽，且多肽在自然環境中易降解，因此，把多個囊素三肽和加加尼翁活性四肽的密碼子串聯后，在體外表達的重組雜合肽囊素N197對畜禽來說應該是一種比較安全的免疫佐劑。2重組雜合肽囊素N197是一種具有廣譜促免疫作用的免疫佐劑 該佐劑能提高多種畜禽疫苗的免疫效果，這直接減少了畜禽患病的機會，間接增加了養殖戶的收入和經濟效應。同時，該新型佐劑的應用可望提高傳統疫苗的免疫效果，降低畜禽重大傳染病的防治成本。3重組雜合肽囊素N197是一種綠色、環保的免疫佐劑該免疫佐劑可降低畜禽疫苗抗原的使用量，從而減少了因大量繁殖病毒對疫苗生產區域的環境和疫苗使用場所周圍環境的污染程度，降低企業的生產成本，是一種綠色、環保免疫佐劑。此外，重組雜合肽囊素N197屬于重組多肽佐劑，其在自然界中可以被降解，不會對環境和其他生物造成生物危害。
四

圖I :含雜合肽囊素N197核酸序列的PET32a重組載體的酶切鑒定圖A:N197 ;M:DNA分子量標準；1:含雜合肽囊素N197核酸序列的PET32a重組載體的酶切鑒定；圖2 :含雜合肽囊素N197核酸序列的PET32a表達載體在大腸桿菌中的誘導表達。A :雜合肽囊素N197 ;1_2:誘導4h時的PET32a_N197轉化菌；M:蛋白分子量標準；3:誘導4h時的PET32a空質粒轉化菌圖3 :雜合肽囊素N197的純化A:純化后的雜合肽囊素N197;M:蛋白質分子量標準；I:切膠回收的重組雜合肽囊素N197的印跡
五具體實施例方式I雜合肽囊素N197的設計合成14個囊素三肽的氨基酸序列(Lys-His-Gly-NH2)和2個活性四肽的氨基酸序列(Lys-Asn-Pro-Tyr)所對應的密碼子共有150bp的核苷酸。另外在核酸序列的前面添加一個起始密碼子的序列(3bp)和一個限制性內切酶EcoR I的酶切位點(6bp)。在序列的末端加上6個組氨酸的序列(18bp)，一個終止密碼子(3bp)，另外加上三個限制性內切酶(XhoI，Sal I1Pst I)的核酸序列(17bp)。這樣設計好的雜合肽基因共包括197個核苷酸。具體序列如下
5 ' -GAATTCATGAAACACGGTAAACATGGCAAACACGGTAAACACGGCAAACACGGCAAACACGGTAAACACGGTAAACATGGCAAACACGGCAAGCACGGTAAGCACGGTAAACACGGCAAACATGGCAAACACGGTAAAAATCCGTACAAGAACCCGTATCATCACCACCATCACCATTAAGTCGACTCGAGCTGCAG-3 ^N197序列設計好之后，送南京金斯瑞公司進行序列的合成。2含有雜合肽囊素N197序列原核表達載體的構建2. I雜合肽囊素N197序列的準備取金斯瑞公司提供的含N197雜合肽基因的克隆載體PUC57-N197的轉化菌(穿刺菌)溶解于普通的LB培養基中，再用接種環蘸取TOC57-N197的轉化菌的菌液，在含有終濃度為50μ g/ml氨芐青霉素(Amp)的普通LB瓊脂平板上，以四區劃線的方式進行轉接，接著
置于37°C培養箱，培養12-16h，以獲得含N197雜合肽基因的克隆載體roC57_N197的轉化菌的單菌落。次日從PUC57-N197的轉化菌劃線平板上挑取單個菌落至I支含3ml液體LB培養基的試管中，37°C培養12-16h后取I. 2ml菌液用普通質粒小提試劑盒提取質粒。提取的PUC57-N197質粒用EcoR I和Sal I進行酶切，酶切體系如下
提取的 PUC57-N19740μ1
IO^Buffer H16μ1
EcoR I3·2μ1
Sal I3.2μ1
(IdH2O97.6μ1
總體積160μ1以上酶切體系在37°C作用2h后，用2%的瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PUC57-N197是否正確。如鑒定為正確的含有N197核酸片段的質粒，則可以對該質粒進行大量酶切，并在紫外燈下割取分子量在197bp左右的目標條帶，并對其中的核酸進行回收。2. 2PET32a表達載體的線性化及其回收按如下體系的組成對原核表達載體PET32a進行酶切(EcoR I、Sal I)、回收。
PET32a20 il
IOxButTer H8μ1
hcoR Ii .6μ1
Sail1.6μ1
ddH2048.8μ1
總體積80μ12. 3重組雜合肽囊素Ν197原核表達載體(PET32a_N197)的構建把分別經過EcoR I和Sal I兩個酶酶切的PET32a回收溶液和N197進行連接，構建含N197序列原核表達載體PET32a，具體連接體系如下_切回收的N1973μ1
PET32aI μ!
IOxiigase BufferΙμ
14DNA ligaseUd
ddH^O4μ1
總體積10μ1以上各組分在O. 25ml的離心管中混勻并稍加離心，放入4°C恒溫體系中連接過夜。
2. 4雜合肽囊素N197序列與表達載體PET32a的連接產物的轉化將10 μ I Ν197回收片段與PET32a載體的連接產物加入一支200 μ I BL-21感受態細胞的菌液中，輕輕混勻后冰浴30min。將冰浴后的連接產物在42°C，熱應激90s后輕輕放置冰水中冰浴5min。接著在轉化體系中加入800 μ I的LB培養基，37°C，170rpm振蕩培養50min。取200 μ I轉化菌液均勻涂布于含有50 μ g/ml終濃度的Amp的普通LB瓊脂平板上，37°C培養12-16h后觀察菌落的生長情況。在涂有轉化菌液的平板上挑取I個大小適中，形態飽滿的轉化菌落至含3ml液體普通LB培養基(含50 μ g/ml濃度的Amp)的試管中，37°C培養過夜。在每個試管中取I. 5ml的菌液至Eppendorf管中，使用普通質粒小提試劑盒提取質粒。2. 5含雜合肽囊素N197序列的PET32a表達載體的鑒定把提取的轉化菌的質粒用EcoR I和Sal I酶切，酶切體系如下
轉化的質粒8μ1
IOxBuffer H2μ1
I0.5μ1
Sal I0.5μ1
CidH2O9μ1
總體積20μ1以上各組分在O. 25ml的離心管中混勻并稍加離心后于37°C恒溫水浴2. 5h左右，取酶切后的質粒溶液在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，100V電壓，電泳20min左右，在UVPBiospectrum 600下觀察有無分子量大小分別為200bp和5900bp左右的兩條核酸條帶,轉化質粒中能酶切出這兩種分子量核酸的質粒即可鑒定為重組N197的PET32a表達質粒。2. 6雜合肽囊素N197序列在大腸桿菌中的誘導表達把本章2. 2中含有陽性重組N197的PET32a表達載體的大腸桿菌在氨節青霉素平板上四區劃線，37°C培養至肉眼可見大小適度的單菌落后停止培養。從劃線平板上挑取2個菌落接種到3ml含氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB液體培養基中，37°C振搖過夜。次日取2%過夜培養物接種到4ml含氨芐青霉素的普通LB液體培養基中，37°C劇烈振搖培養，約2-2. 5h后達到對數生長中期(菌液OD6tltl值為O. 5-0. 6左右)，加入終濃度為ImM的IPTG進行誘導表達。以PET32a空載體質粒的BL-21菌同樣誘導處理后為陰性對照。2個誘導菌和空載體PET32a菌在IPTG誘導4h時各取500 μ I樣品，誘導菌室溫12000rpm離心30s。收各管的菌體沉淀加入40 μ I的ddH20重懸細菌沉淀，100°C處理IOmin后進行SDS-PAGE。2. 7重組大腸桿菌雜合肽囊素N197的純化從劃線平板上挑取單菌落接種到3mlLB液體培養基(含終濃度為50 μ g/ml的氨芐青霉素)，37°C振搖過夜。次日，取2%過夜培養物接種到IOml含氨芐青霉素的普通LB液體培養基中，37°C劇烈振搖培養，約2-2. 5h后達到對數生長中期(菌液0D600值為O. 5-0. 6左右)，加入終濃度為ImM的IPTG進行誘導表達。在誘導4h時，所有的誘導菌經12000rpm，離心30s，其沉淀用800 μ I的ddH20重懸后加入200 μ I的SDS-PAGE的loading buffer中，在100°C煮沸IOmin后進行SDS-PAGE。剩余的樣品于_20°C保存。SDS-PAGE結束后把膠用ddH20稍漂洗后去掉泡沫，用O. 25M的KCl溶液(4°C預冷)浸泡膠，雜合肽囊素N197的印跡會立即顯現出來，此時用干凈的刀片把含有雜合肽囊素N197的凝膠切割下來并浸泡在ddH20中約Imin后，用注射器針筒壓碎凝膠，使凝膠顆粒大 小約為O. 然后在碎的凝膠中加入PBS或ddH20,過夜后12000rpm,離心15min,取上清即為含有很純雜合肽囊素N197的切膠回收溶液。取40 μ I的雜合肽囊素N197的切膠回收溶液，加10 μ I loading buffer，在100°C煮沸IOmin后進行SDS-PAGE。通過電泳來確定雜合肽囊素N197的純度。2. 8雜合肽囊素N197對商品化雞傳染性法氏囊疫苗的免疫增強劑效應把I日齡的SPF級白色來航雞在SPF飼養至10日齡后分為A，B，C和D等4組，每組3只雞。其中A組為商品化的雞傳染性法氏囊病滅活疫苗免疫組(采用市售商品化雞傳染性法氏囊病的滅活苗在雞頸部皮下注射200 μ I) ；Β組為聯合免疫組(用商品化的雞傳染性法氏囊病滅活疫苗頸部皮下注射加200 μ I切膠回收的O. 14mg/ml的N197) ；C組為陽性攻毒組(不免疫，進行攻毒);D組為空白對照組(不免疫，不攻毒)。對各組中需要免疫的雞只按上述方案進行免疫，在24日齡時加強免疫一次，疫苗接種劑量及各組免疫增強劑的添加情況同第一次免疫。2. 8. I雜合肽囊素N197對商品化雞IBD疫苗免疫抗體水平的影響在第二次免疫13日后，即雞群37日齡時對雞群進行翅靜脈采血。具體方法如下(I)固定雞只，使雞的翅膀上翻(注意勿使雞翅膀折傷或脫臼)；(2)在雞翅中部選取翅靜脈比較清楚的位置，用70%酒精棉球消毒并使血管得以擴張；(3)用Iml的一次性無菌注射器在消毒部位采血約Iml/只；(4)將采集的雞血在室溫放置Ih后于4°C冰箱過夜。次日，以2000rpm，4°C離心IOmin并小心吸取上清；(5)采用瓊擴實驗方法測定血清中雞IBD抗體的水平和效價。中間孔加入標準雞傳染性法氏囊病瓊擴抗原，周圍的孔中分別加入采集的免疫雞群及對照組實驗雞只的抗血清。2. 8. 2雜合肽囊素N197對攻毒后雞法氏囊的保護作用分析雞群采血后立即對其進行攻毒，每只雞采用滴眼的方式滴加90 μ I雞IBDV的強毒株BC6/85的病毒液(約1000EID5(i)。攻毒6天后，處死所有雞群并對其進行剖檢。主要取雞的脾臟和法氏囊組織稱重后立即放入10%的福爾馬林溶液進行固定后進行病理切片分析。
權利要求
1.一種雜合肽囊素N197佐劑，其特征是由14個囊素三肽的氨基酸序列Lys-His-Gly-NH2和2個活性四肽的氨基酸序列Lys-Asn-Pro-Tyr及6個組氨酸組成的雜合多肽序列。
2.權利要求I所述的雜合肽囊素N197佐劑的制備方法，其特征是由以下步驟組成 ①雜合肽囊素N197的設計合成 14個囊素三肽的氨基酸Lys-His-Gly-NH2和2個活性四肽的氨基酸Lys-Asn-Pro-Tyr所對應的核酸序列,共150bp的核苷酸，同時在該核酸序列的N段添加一個起始密碼子的序列3bp和一個限制性內切酶EcoR I的酶切位點6bp，另外在該序列的C端加上6個組氨酸的密碼子序列18bp，一個終止密碼子3bp和三個限制性內切酶Xho I，Sal I1Pst I的核酸序列17bp，這樣設計好的雜合肽囊素基因共197個核苷酸，具體序列如下5 z -GAATTCATGAAACACGGTAAACATGGCAAACACGGTAAACACGGCAAACACGGCAAACACGGTAAACACGGTAAACATGGCAAACACGGCAAGCACGGTAAGCACGGTAAACACGGCAAACATGGCAAACACGGTAAAAATCCGTACAAGAACCCGTATCATCACCACCATCACCATTAAGTCGACTCGAGCTGCAG-3 ,； ②重組雜合肽囊素N197的原核表達載體PET32a-N197的構建及其重組菌 雜合肽囊素N197核酸序列與線性化的PET32a (Novagen公司商品化產品)原核表達載體進行連接，獲得了重組雜合肽囊素N197的原核表達載體PET32a-N197，該載體轉化大腸桿菌BL-21宿主后獲得了含PET32a-N197載體的重組菌，該重組菌表達重組雜合肽囊素N197的量可高達20% ；
3.權利要求I所述重組雜合肽囊素N197佐劑在制備法氏囊疫苗或新城疫疫苗或豬瘟疫苗或禽流感疫苗或馬立克氏病疫苗等畜禽疫苗制備中的應用。
4.權利要求I所述重組雜合肽囊素N197獨立使用時，對畜禽免疫力的增強作用。
全文摘要
本發明屬于分子免疫學技術領域，具體涉及一種雜合肽囊素佐劑及其制備方法和應用。主要技術方法如下先設計出14個囊素三肽的氨基酸序列(Lys-His-Gly-NH2)和2個活性四肽的氨基酸序列(Lys-Asn-Pro-Tyr)密碼子為主體的雜合肽囊素N197的核酸序列。接著構建了重組表達載體PET32a-N197，將其轉入BL-21(DE3)大腸桿菌后，雜合肽囊素N197獲得了高效表達。純化后的雜合肽囊素N197具有顯著的免疫佐劑的特性。本發明中的雜合肽囊素N197具有高效的佐劑特性，且利用大腸桿菌系統可以在體外對其進行大規模的生產，其生產成本低，生產效率高，生物活性好，非常適合企業化生產，具有很好的作為畜禽免疫佐劑的應用前景。
文檔編號C12N15/70GK102796200SQ20121029558
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月17日 優先權日2012年8月17日
發明者沈萍萍, 蔡梅紅 申請人:南京大學