專利名稱：一種快速鑒定辣椒疫霉對丁吡嗎啉抗藥性的方法及專用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及辣椒疫霉纖維素合酶相關基因CesA3核苷酸點突變的鑒定及其在殺菌劑丁吡嗎啉抗性監測中的應用，具體公開ー種快速鑒定辣椒疫霉CesA3基因的核苷酸點突變及其對丁吡嗎啉抗藥性的分子檢測方法及專用引物。屬于分子生物學技術領域。
背景技術：
辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)是ー種重要的植物病原卵菌，由辣
椒疫霉侵染辣椒引起的辣椒疫病，是ー種世界性分布的毀滅性病害，在我國普遍發生，且有逐年加重趨勢。在氣候適宜的的條件下，短期內就可爆發，蔓延速度極快，一般發病可引起30%產量損失，嚴重情況下可導致辣椒絕收。辣椒疫霉還可以侵染茄科、豆科、葫蘆科等多種作物，引起產量損失。目前，在農業措施、抗病育種、生物防治、植物檢疫和化學防治等諸多防治措施中，化學防治仍是控制植物病原卵菌病害的主要手段，在卵菌的病害防治中發揮著不可替代的作用。以甲霜靈為代表的苯酰胺類殺菌劑，成為卵菌病害化學防治的里程碑，然而，目前病原卵菌對該類殺菌劑已普遍產生抗藥性，因此在生產實踐中苯酰胺類殺菌劑的使用受到限制。丁卩比嗎啉(pyrimorph)是2003年由中國農業大學創制的新型殺菌劑,在中國已獲批臨時登記，用于辣椒疫病和番茄晚疫病等卵菌病害的防治。丁吡嗎啉的作用機制目前還不明確，但研究顯示該藥劑與CAA類殺菌劑具有交互抗藥性，因此，推測丁吡嗎啉與CAA類殺菌劑具有相似的作用機制。已有研究表明，與纖維素合成相關的蛋白酶cesA3是CAA類殺菌劑的作用靶標(朱書生等，2007 ；Blum etal. ,2010) 迄今，尚未發現辣椒疫霉對丁吡嗎啉敏感性下降的報道。然而，毎年近20，OOOkg丁吡嗎啉用于田間生產，且逐年增多。而且在室內條件下通過自然篩選和藥劑馴化的方式獲得了對丁吡嗎啉產生高抗性水平的辣椒疫霉菌株，并且抗性菌株的生存適合度較高，表明具有較高的抗性風險。因此，在使用丁吡嗎啉防治卵菌病害的過程中需要注意避免抗藥性的產生，加強檢測和早期預警病原菌對丁吡嗎啉的抗性發生發展情況，這有助于指導丁吡嗎啉的科學使用，延緩其抗藥性的發生和發展，延長藥劑的使用壽命。可以用于病原菌抗藥性檢測的常規方法包括菌絲生長測定法、菌絲干重測定法，孢子萌發測定法、瓊脂展布法和抑菌圈測定法等。但是這些方法都需要通過離體條件下分離培養獲得病原菌的純培養物，測定藥劑對病原菌的EC5tl，借助已建立的敏感基線，比較敏感和抗性菌株的差異，試驗需要多個處理，多次重復，因此檢測周期長、工作量大、消耗的人力資源和材料較多。而且上述常規方法檢測靈敏度低，抗藥性菌株的突變頻率在I %以上才能被檢測到。由于病原菌的繁殖、傳播速度一般都很快，在自然界存在的數量有很大，因此經過幾次藥劑選擇后,抗藥性病原菌亞群體可能會成為致病病原群體的主體,造成病害大流行。隨著分子生物學技術的飛速發展及其應用范圍的不斷擴展，限制性酶切PCR、等位特異PCR分子技術開始在病原菌抗藥性檢測中應用。與傳統的檢測方法比較，不但節省了檢測時間(一般不超過4h)、提高了工作效率，而且提高了檢測的靈敏度，檢測頻率在10_5 10_4，更適用于檢測低頻率的抗藥性基因，因此也被作為田間抗藥性早期診斷的理想方法。可以預測，分子檢測技術將在病害的可持續管理系統中發揮愈來愈重要的作用。

發明內容
本發明的ー個目的是提供一種檢測或輔助檢測辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的方法及其專用引物對。本發明所提供的檢測或輔助檢測辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的方法，包括如下步驟以待測辣椒疫霉的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示引物對進行PCR擴增，若PCR擴增產物為168 bp的片段，則所述待測辣椒疫霉中CesA3基因存在或候選存在突變位點；所述突變位點指辣椒疫霉中CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3365位核苷酸為A。所述CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3365位核苷酸也就是SEQ ID NO 5中自5’末端起第3365位核苷酸。上述過程中，所述PCR擴增中，退火溫度為58°C。本發明所提供的檢測或輔助檢測辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的引物對，由SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示DNA分子組成。本發明的另ー個目的是提供辣椒疫霉中CesA3基因或蛋白的突變位點。本發明所提供的辣椒疫霉中CesA3基因的一個突變位點，為辣椒疫霉中CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3365位核苷酸為A。所述CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3365位核苷酸也就是SEQ ID NO :5中自5’末端起第3365位核苷酸。本發明所提供的辣椒疫霉中CesA3蛋白的一個突變位點，為辣椒疫霉中CesA3蛋白的自N端起第1077位氨基酸為賴氨酸。所述CesA3蛋白的自N端起第1077位氨基酸也就是SEQ ID NO :4中自N端起第1077位氨基酸。上述任一所述突變位點在鑒定辣椒疫霉抗藥性中的應用也屬于本發明的保護范圍；所述抗藥性為抗丁吡嗎啉。上述應用中，存在所述突變位點的辣椒疫霉具有或候選具有抗藥性。SEQ ID NO :4所示蛋白或SEQ ID NO :5所示基因也屬于本發明的保護范圍。本發明所提供的檢測辣椒疫霉對丁吡嗎啉產生抗藥性的點突變的方法，有助于快速、靈敏地檢測田間辣椒疫霉對丁吡嗎啉的抗藥性發生發展動態，為抗藥性的治理提供技術支持，便于及時調整病害防治策略，以延緩和控制抗藥性的進ー步發展。


圖I為抗丁吡嗎啉的辣椒疫霉菌株及敏感菌株的cesA3基因DNA序列比較發現與抗性相關的ー個突變位點。Hd3和Hdll為敏感親本菌株，R3-2，R3-3，Rll-I為抗性菌株。圖2為采用特異性引物對擴增對丁吡嗎啉敏感和抗性的辣椒疫霉菌株。引物對CF1077(SEQ ID NO I)+R1077 (SEQ ID NO :3)用于檢測對丁吡嗎啉的敏感和抗性的辣椒疫霉菌株，引物對R1077B(SEQ ID NO 2)+R1077 (SEQ ID NO :3)用于檢測辣椒疫霉對丁吡嗎啉的抗性菌株。其中Hd3，Hdll為辣椒疫霉敏感親本菌株；R3-2，R3-3，Rll-I為抗性菌株。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。文中“抗性菌株”均指對殺菌劑丁吡嗎啉抗性的辣椒疫霉菌；“敏感菌株”均指對殺菌劑丁吡嗎啉敏感的辣椒疫霉菌。下述實施例中使用的辣椒疫霉菌株為抗性菌株R3-2，R3-3，和Rll-I ;敏感菌株Hd3 和 HdlI。上述各個菌株均經過菌落生長測定法進行抗藥性驗證。上述菌株Hd3、Hdll、R3-2、R3_3和Rll-I采自中國河北地區。經過現有的形態學和分子生物學方法鑒定為辣椒疫霉。上述各個菌株均經過菌絲生長測定法進行抗藥性驗證。實施例I、辣椒疫霉對丁吡嗎啉的敏感性測定三株辣椒疫霉抗性突變體，菌株編號分別為R3-2，R3-3，和Rll-I ;兩株辣椒疫霉敏感親本菌株，菌株編號分別為Hd3和HdlI。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基馬鈴薯200g，瓊脂粉13g，葡萄糖18g，蒸餾水定容至1L，121°C濕熱滅菌20分鐘。I、實驗步驟如下I)將丁吡嗎啉用ニ甲基亞砜(DMSO)配成IO4U g/ml的母液。對于辣椒疫霉敏感菌株的敏感性測定，將丁吡嗎啉逐級稀釋成187. 5 ii g/mL, 375 u g/mL, 750 u g/mL,
1.5 X IO3 u g/mL, 3 X IO3 u g/mL, 4 X IO3 u g/mL的濃度梯度；對于辣椒疫霉疫霉抗性菌株的敏感性測定，將供試藥劑丁吡嗎啉逐級稀釋成312. 5 u g/mL, 625 u g/mL, I. 25 X IO3U g/mL,
2.5 X IO3 u g/mL, 5 X IO3 u g/mL, I X IO4 u g/mL 的濃度梯度。2)對于辣椒疫霉敏感菌株的測定，用移液槍吸取藥液60 U I加入已滅菌的冷卻至45°C的60ml PDA培養基中，使溶劑含量為1%。，混勻，將帶藥的培養基倒入直徑為9cm的培養皿中，設只加60 ill DMSO的處理為空白對照，每個比例藥劑設3次重復；對于辣椒疫霉抗性菌株的測定，用移液槍吸取藥液600 ill加入已滅菌的冷卻至45°C的60ml PDA培養基中，使溶劑含量為1%，混勻，將帶藥的培養基倒入直徑為9cm的培養皿中，設只加600 ii 1DMS0的處理為空白對照,每個比例藥劑設3次重復。3)辣椒疫霉在PDA平板上培養5天后，沿菌落邊緣用打孔器打取直徑為0. 5cm的菌餅，菌絲面向下接種于步驟2)中的帶藥和對照培養基中，置于28°C培養箱中黒暗培養，4d后測量菌落直徑。4)十字交叉法測量菌落直徑，根據菌落平均直徑值計算出各復配比例對供試菌株的菌絲生長的抑制率。然后將抑制率轉化成機率值(Y)，藥劑濃度轉換成以10為底的對數值(X)，在Microsoft Excel中作回歸直線，分別求出供試辣椒疫霉菌株的毒力回歸曲線方程Y = a+bX,以及相關系數r和有效抑制中濃度EC5tl值，并計算抗性倍數。
抗性倍數=抗性菌株的平均EC5tl/敏感親本菌株的平均EC5tl2、結果表15株辣椒疫霉菌株對丁吡嗎啉的敏感性
權利要求
1.一種檢測或輔助檢測辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的方法，包括如下步驟 以待測辣椒疫霉的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示引物對進行PCR擴增，若PCR擴增產物為168bp的片段，則所述待測辣椒疫霉中CesA3基因存在或候選存在突變位點； 所述突變位點指辣椒疫霉中CesA3基因的自5’末端起第3365位核苷酸為A。
(所述CesA3基因的自5’末端起第3365位核苷酸也就是SEQ ID NO :5中自5’末端起第3365位核苷酸)。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述PCR擴增中，退火溫度為58°C。
3.—種檢測或輔助檢測辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點的引物對，由SEQ IDNO :2和SEQ ID NO 3所示DNA分子組成。
4.辣椒疫霉中CesA3基因的一個突變位點，為辣椒疫霉中CesA3基因的自5’末端起第3365位核苷酸為A。
5.辣椒疫霉中CesA3蛋白的一個突變位點，為辣椒疫霉中CesA3蛋白的自N端起第1077位氨基酸為賴氨酸。
6.權利要求4或5所述突變位點在鑒定辣椒疫霉抗藥性中的應用；所述抗藥性為抗丁吡嗎啉。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于具有所述突變位點的辣椒疫霉具有或候選具有抗藥性。
8.SEQ ID NO 4所示蛋白。
9.SEQ ID NO 5所示基因。
全文摘要
本發明涉及辣椒疫霉纖維素合酶相關基因CesA3核苷酸點突變的鑒定及其在殺菌劑丁吡嗎啉抗性監測中的應用，具體公開了一種鑒定辣椒疫霉CesA3基因3365位核苷酸突變對丁吡嗎啉產生抗藥性的分子檢測方法及專用引物。該特異性引物對，由SEQ ID N02和SEQ ID NO3所示的DNA分子組成。本發明提供的檢測辣椒疫霉對殺菌劑丁吡嗎啉抗藥性的分子診斷方法，靈敏度高、穩定性好、檢測周期短，可以用于高通量地監測田間辣椒疫霉對殺菌劑丁吡嗎啉的抗性發生、發展情況，實現抗性病害的早期預警，對及時有效地控制抗藥性病害的發展具有重要意義。
文檔編號C12N15/11GK102851363SQ201210294998
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月20日 優先權日2012年8月20日
發明者劉西莉, 龐智黎, 陳磊, 邵菁芃, 李健強, 覃兆海, 劉鵬飛 申請人:中國農業大學