專利名稱：一種低血清高效培養雞毒支原體弱毒株培養基及其制備方法
技術領域：
本發明屬于獸醫生物學技術領域，涉及一種低血清高效培養雞毒支原體弱毒株培養基及其制備方法。
背景技術：
雞毒支原體主要引起雞、火雞的慢性呼吸道疾病，是一種嚴重危害養禽生產的病原體，其主要危害是該病在規?；u場中經常緩慢流行，導致產蛋雞產量下降，肉雞和生長雞的發育受阻、飼料報酬降低；由于感染雞群的免疫抑制引起其它疫病的繼發或伴發，給養雞業造成的主要損失是發病雞群的死淘率明顯上升。雞毒支原體活疫苗和滅活疫苗聯合使用可以減少雞毒支原體水平傳播和垂直傳播，但優質疫苗的前提需要有一種好的培養基來支撐。培養基是人工合成各種營養物質供微生物生長的基質。目前培養雞毒支原體主要應用改良Frey氏或其他支原體培養基。其制苗添加的血清量普遍為10_30%之間。以上述傳統培養雞毒支原體培養基所需血清量比本發明血清量高5%_25%，過量的血清制備的疫苗無疑給雞只增加異源體對雞體的過敏應激反應，最終影響疫苗的免疫效力。

發明內容
本發明所要解決的問題是提供一種低血清高效培養雞毒支原體弱毒株培養基及其制備方法，用以降低培養雞毒支原體所需血清用量，提高雞毒支原體抗原效價。本發明另一目的是提供該雞毒支原體弱毒株培養基的制備方法。本發明所述問題是以下述技術方案解決的:
一種低血清高效培養雞毒支原體弱毒株培養基及其制備方法，所述低血清高效培養雞毒支原體弱毒株培養基按如下工藝配制:基礎培養基:(1)MEM6-7g
(2)酵母浸出粉2-4g
(3)胰蛋白胨6-8g
(4)葡萄糖6-8g
(5)質量濃度為1%的酚紅溶液l-2ml
(6)Na2HPO4 12H20l-2g
(7)KH2PO40.05-0.09g(8 ) NaCl 2-3g
(9)蒸餾水1000ml在116°C滅菌30min，待冷卻后，在無菌條件下加入下列輔助培養基成分，制成供培養雞毒支原體培養基。輔助培養基:
(10)豬血清40-5 0ml
(11)質量濃度為20%新鮮酵母浸出液80-90ml
(12)質量濃度為3%谷氨酰胺(過濾除菌)90-100ml
(13)質量濃度為10%精氨酸溶液20ml
(14)青霉素0.002-0.015mg/ml用lmol/L氫氧化鈉溶液調整PH至7.6-7.8。本發明還提供了該雞毒支原體培養基的制備方法，其特征在于制備步驟如下:I制備基礎培養基:取上述(I)- (8)成分逐一溶入IOOOml蒸餾水，高壓滅菌后備用。2制備輔助培養基:取上述(9)- (14)混和、攪拌，即得輔助培養基。3將基礎培養基和輔助培養基混和，調pH至7.6-7.8，分裝備用。本發明的低血清高效培養雞毒支原體弱毒株培養基運用微生物學、無機、有機分析化學的技術原理，對不同的氮源、碳源、蛋白質、無機鹽和膽固醇等諸多營養組分的組合進行了篩選，對培養基的PH值、滲透壓等進行分析，研究出了適合低血清高效培養雞毒支原體弱毒株的培養基。該培養基的配方中除基本成份外，在培養基中還添加了新鮮酵母浸出液、谷氨酰胺、精氨酸，上述成分的添加能明顯提高雞毒支原體的活菌滴度；未添加前的活菌滴度為109CCU/ml，添加后活菌滴度為10nCCU/ml。而本發明最大的優勢在于豬血清用量僅為5%左右，大大減輕了異源體血清對雞體的過敏應激反應，為我們的養殖事業保駕護航。
具體實施例方式實施例1
本發明培養基的制備基礎培養基:
(1)MEM3.1g
(2)酵母浸出粉1.3g
(3)胰蛋白胨3.3g
(4)葡萄糖3.3g
(5)質量濃度為1%的酚紅溶液0.75ml
(6)Na2HPO4 12H200.6g
(7)KH2PO40.04g
(8)NaCl1.15g·
(9)蒸餾水500ml在116°C滅菌30min，待冷卻后，在無菌條件下加入下列輔助培養基成分，制成供培養雞毒支原體培養基。輔助培養基:
(10)豬血清25ml
(11)質量濃度為20%新鮮酵母浸出液45ml
(12)質量濃度為3%谷氨酰胺(過濾除菌)50ml(13 )質量濃度為10%精氨酸溶液 IOml
(14)青霉素 0.008mg/ml將基礎培養基(I)- (8)成分逐一溶入500ml蒸餾水中高壓滅菌，冷卻后添加輔助培養基，lmol/L氫氧化鈉溶液調整pH至7.7，制得低血清高效雞毒支原體培養基。實施例2本發明培養基的制備基礎培養基:(I ) MEM5.1g
(2)酵母浸出粉2.2g
(3)胰蛋白胨5.4g
(4)葡萄糖5.4g
(5)質量濃度為1%的酚紅溶液1.2ml
(6)Na2HPO4 12H200.96g
(7)KH2PO40.04g
(8)NaCl1.84g
(9)蒸餾水800ml在116°C滅菌30min，待冷卻后，在無菌條件下加入下列輔助培養基成分，制成供培養雞毒支原體弱毒株培養基。輔助培養基:
(10)豬血清40ml
(11)質量濃度為20%新鮮酵母浸出液72ml (12)質量濃度為3%谷氨酰胺(過濾除菌)80ml
(13)質量濃度為10%精氨酸溶液16ml
(14)靑苒尜0.012mg/ml將基礎培養基(I)- (8)成分逐一溶入800ml蒸餾水中高壓滅菌，冷卻后添加輔助培養基，lmol/L氫氧化鈉溶液調整pH至7.7，制得低血清高效雞毒支原體培養基。實施例3應用雞毒支原體(F36)分別通過本發明支原體培養基、改良Frey氏培養基、支原體培養基對雞毒支原體(F36)進行比較培養試驗:I本發明培養基的制備基礎培養基:
(I ) MEM6.3g
(2)酵母浸出粉2.7g
(3)胰蛋白胨6.7g
(4)葡萄糖6.7g
(5)質量濃度為1%的酚紅溶液1.5ml
(6)Na2HPO4.12H201.2g
(7)KH2PO40.08g
(8)NaCl2.3g
(9)蒸餾水1000ml
在116°C滅菌30min，待冷卻后，在無菌條件下加入下列輔助培養基成分，制成供培養雞毒支原體培養基。輔助培養基:
(10)豬血清50ml
(11)質量濃度為20%新鮮酵母浸出液90ml
(12)質量濃度為3%谷氨酰胺(過濾除菌)IOOml
(13)質量濃度為10%精氨酸溶液20ml
(14)青霉素0.015mg/ml將基礎培養基(I) - (8)成分逐一溶入IOOOml蒸餾水中高壓滅菌，冷卻后添加輔助培養基，lmol/L氫氧化鈉溶液調整pH至7.7，制得低血清高效雞毒支原體培養基。2配制改良Frey氏培養基基礎液
NaCl5g
KCl0.4g
MgS04.7H200.2g
Na2HPO4.12H,Ol.6g
KH2PO4Olg
葡萄糖IOg
乳蛋白水解物5g溶于1000ml去離子水中，115°C 20分鐘滅菌。培養基
基礎液〗00ml
豬血清13ml
25%酵母浸出液IOml
青霉素10萬單位
1/80醋酸鉈Iml以IN NaOH 調 pH 值至 .103支原體培養基配制“支原體培養基”
PPLO 肉湯21.0g
葡萄糖5.0g10%的精氨酸溶液10.0ml
10倍濃縮MEM培養液10.0ml
1%醋酸鉈溶液1Oml
25%酵母浸出液1OOml
8萬單位/ml青霉素10.0ml
豬(馬)血清1OOmI用去離子水定容至1000ml，用氫氧化鈉溶液(2M)調整pH值至7.8,0.22微米濾過除囷備用。4雞毒支原體培養將購自中國獸醫藥品監察所的雞毒支原體弱毒菌株(F36株)，分別接種本發明的低血清高效培養雞毒支原體弱毒株培養基、改良Frey氏培養基和支原體培養基3種培養基，種子繼代復壯后，分別按10% (V/V)的比例接種，37°C培養，當培養液的顏色變黃、pH由
7.7降至6.5時，無菌取出培養物。5活菌滴度(CXU)測定每個菌株取15只無菌試管,每管裝4.5ml含雞毒支原體培養基,在第I管加入
0.5ml生長良好的培養物，混合均勻后，吸取0.5ml加入第2根管，如此進行10倍系列稀釋至最末I管，同時設未加菌液的雞毒支原體培養基作為陰性對照。試驗管設三個重復。之后，將試管放置37°C恒溫箱中靜止培養，每日觀察I次，主要觀察培養基的顏色變化，連續觀察時間為10天，最后發生顏色變化的試管稀釋度即為該培養物的CCU滴度。此試驗共進行了 3次。6 結果6.1雞毒支原體弱毒菌株F36株接種3種培養基3次生長試驗(XU (顏色變化單位)測定結果見表I表I雞毒支原體弱毒菌株F36株接種3種培養基3次生長試驗CCU測定結果
權利要求
1.一種低血清高效培養雞毒支原體弱毒株培養基及其制備方法，其特征是培養基包括:基礎培養基:(I ) MEM6-7g(2)酵母浸出粉2-4g(3)胰蛋白胨6-8g(4)葡萄糖6-8g(5)質量濃度為1%的酚紅溶液l-2ml(6)Na2HPO4 12H20l-2g(7)KH2PO40.05-0.09g(8)NaCI2-3g(9)蒸餾水1000ml在116°C滅菌30min，待冷卻后，在無菌條件下加入下列輔助培養基成分，制成供培養雞毒支原體弱毒株培養基。輔助培養基:(10)豬血清40-50ml(11)質量濃度為20%新鮮酵母浸出液80-90ml(12)質量濃度為3%谷氨酰胺(過濾除菌)90-100ml(13)質量濃度為10%精氨酸溶液20ml(14)青霉素O 002-0.015mg/ml用lmol/L氫氧化鈉溶液調整PH至7.6-7.8。
2.如權利要求1所述的低血清高效培養雞毒支原體弱毒株培養基，其特征是每IOOOml培養基中加豬血清40-50ml。
3.如權利要求1所述的一種低血清高效培養雞毒支原體弱毒株培養基及其制備方法，包括如下步驟:Cl)制備基礎培養基:取上述(I) - (8)成分逐一溶入IOOOml蒸餾水，高壓滅菌后備用；(2)制備輔助培養基:取上述(9)- (14)混和、攪拌，即得輔助培養基將高壓滅菌冷卻后的基礎培養基和輔助培養基混和，調PH至7.6-7.8，分裝備用。
4.如權利要求1所述的一種低血清高效培養雞毒支原體弱毒株培養基及其制備方法適用于雞毒支原體所有活疫苗抗原的制備。
全文摘要
本發明涉及低血清高效培養雞毒支原體弱毒株培養基及其制備方法，屬于獸醫生物學技術領域。包括(1)基礎培養基；(2)輔助培養基，主要有MEM、酵母浸出粉、胰蛋白胨，葡萄糖，無機鹽等組成，該培養基能夠既保證半成品生長滴度高而且穩定。用本發明方法制備的半成品菌液效價高達1011CCU/ml；同時該培養基采用降低豬血清培養雞毒支原體，減輕了異源體豬血清對雞體的過敏應激反應，既考慮到動物的生物安全，又提高了抗原效價，而且降低了生產成本。
文檔編號C12R1/35GK103074246SQ20121031707
公開日2013年5月1日 申請日期2012年8月31日 優先權日2012年8月31日
發明者不公告發明人 申請人:南京天邦生物科技有限公司