專利名稱：表達雞毒支原體TM1蛋白的重組新城疫LaSota弱毒疫苗株的制作方法
技術領域：
本發明涉及重組病毒疫苗領域，更具體地，本發明涉及一種表達雞毒支原體TMl蛋白的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，更具體地，重組新城疫LaSota弱毒疫苗是rLa-tPA-TMl。本發明還公開了制備所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和該重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備預防雞毒支原體引起的疾病和新城疫的雙價疫苗中的應用。
背景技術：
雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum, MG)可引起感染雞的慢性呼吸道病,氣囊炎和竇炎，是當前影響養禽業生產的常見疾病之一。發病雞多表現呼吸困難、咳嗽和口羅音，常見有眶下竇炎、氣囊炎等。本病流行于世界各國，隨著現代養雞規模不斷加大、飼養方式改變和飼養密度日益提高，該病發病率越來越高，所有日齡的雞均可感染，3周內雛雞更 為易感[1]。主要影響雛雞生長、使成年雞產蛋減少。冀錫霖[2]等在1986年所作的流行病學調查表明我國20個省、市的雞群中雞毒支原體陽性感染率接近80%。MG污染雞場很難根除，導致種蛋孵化率低，雛禽品質差，而且世代相傳，危害性日益突出，受到養雞業者的普遍關注OMG可以通過疫苗接種進行預防。目前國內采用弱毒苗和滅活疫苗進行預防接種。江蘇省農科院獸醫研究所邵國青研究員[5]對MG弱毒疫苗進行過系統研究，曾對SC株的免疫原性進行評估，研究結果顯示免疫10天后攻毒保護率達80 %。由于有的毒株其致病力極弱，需反復免疫，保護效果不佳；而有的弱毒疫苗株仍具有一定毒力，特別對于火雞，它可以引起商品火雞感染發病[6]。MG弱毒常常發生置換和傳播，因此可能會加重MG控制和清除的難度m。弱毒疫苗的應用在一定程度上控制了 MG的流行，但在使用過程中存在一定的問題。幾十年前許多禽病工作者已經開始著手滅活疫苗研究，但效果不佳。Yoder等[8]報道了以MG油乳劑滅活苗對15 30日齡雞免疫接種能有效地抵抗強毒株攻擊，但用于10日齡以前的雛雞，免疫效果不理想，無法誘導保護性抗體。宋勤葉等[9]用MG油乳劑滅活苗接種蛋雞，結果表明無論在試驗攻毒前還是在攻毒后接種，只能有效地降低MG經蛋傳播的比率。寧宜寶等[1°]通過高速離心或是中空纖維濾器濃縮雞毒支原體作為滅活疫苗使用，研究發現5倍濃縮的疫苗可以使雞產生良好的免疫力，免疫力隨著抗原濃度的提高而提高，不濃縮的原液培養物所制備的疫苗幾乎不能誘導雞產生免疫保護力。濃縮抗原在提高免疫原性的同時大大增加了疫苗成本，使得原本昂貴的滅活疫苗價格更上一層樓。在生產實踐中，很多雞場應用抗生素來治療和控制MG的感染和擴散。藥物治療不能完全清除支原體的感染，并存在藥物殘留的弊端，阻礙禽類產品出口。因此，研究廉價、安全、高效的雞毒支原體疫苗具有積極的現實意義。因此，目前用于防治MG的滅活疫苗和弱毒疫苗均存在不同程度的不足。而且MG培養困難，不同區域分離的毒株抗原性差異較大，常規疫苗在防治MG上已經力不從心，因此利用先進技術手段開發新型疫苗已經迫在眉睫，而MG基因工程疫苗的研制一直處于初級階段。新城疫病毒(NDV)載體系統是近年進展迅速的活病毒載體系統，作為外源基因的表達載體具有非凡的優勢。NDV可同時誘導體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫，是所有疫苗形式中最為理想的免疫方式；經過多年的臨床應用檢驗，NDV遺傳相對穩定，毒株間發生重組及毒力返強可能性極小，使用安全、方便；NDV具有高滴度的雞胚生長特性，生產成本低廉，便于規模化生產。NDV基因組全長15186核苷酸，與其它副粘病毒一樣，包括核蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基質蛋白(M)，融合蛋白(F)，凝集素神經氨酸酶蛋白(HN)，和大聚合酶蛋白(L)六個獨立轉錄編碼單元。負鏈RNA病毒的反向遺傳操作(Reverse genetic)是通過操作病毒基因組cDNA制造新病毒的過程，其基本過程是①組裝完整的病毒基因組(或重組型基因組)cDNA克隆，5’末端精確地綴于T7啟動子后，3’末端精確綴于自我剪切的核酸酶序列和T7轉錄終止信號之前，構成基因組cDNA轉錄模板；②以基因組cDNA轉錄模板與啟動病毒復制必須的 轉錄相關功能結構蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表達質粒(T7啟動子)一起，共轉染整合表達T7聚合酶的病毒復制許可細胞24-72小時后收獲培養上清，過濾后繼續敏感細胞傳代或接種雞胚尿囊腔救獲(rescue)病毒。對基因組cDNA進行突變、缺失或外源基因插入修飾后，通過反向遺傳操作系統(reverse genetic system,RGS系統)可獲得相應的突變或重組的負鏈RNA病毒。申請人:之前獲得授權的中國專利“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統及其應用” (ZL200510097997. 8, CN1293195C,申請日2005年9月2日)已經建立了一種新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遺傳操作系統,并且成功救獲了野生型病毒株，并且為進一步開展新城疫病毒活載體疫苗研制及NDV病毒相關基礎研究奠定了堅實的基礎。

發明內容
MG其基因組中的一個開放閱讀框TM-I表達一個29kDa的多肽。本發明利用NDV疫苗株LaSota作為載體表達MG結構蛋白的經密碼子人工優化后的TM-I基因，拯救重組病毒并進行免疫試驗，結果發現可以誘導雛雞產生保護性抗體，由此探索了活載體疫苗控制MG流行的可行性。更具體地，本發明以NDV弱毒LaSota疫苗株為表達載體，以MG疫苗株作為基因供體，利用反向遺傳操作技術，成功拯救表達MG tPA-TMl蛋白的重組新城疫病毒。重組病毒在SPF雛雞上進行免疫評價，ELISA抗體檢測結果證明重組疫苗免疫可以誘導產生顯著的抗體反應，此重組疫苗將MG的預防與NDV的免疫合二為一，一次免疫防治兩種疫病，在不增加防疫成本的情況下完成另一嚴重威脅禽類養殖的重要疫病的防控，重組活載體二聯疫苗rLa-tPA-TMl可以作為預防NDV和MG的二聯活疫苗使用。因此，本發明的一個目的是提供一種表達編碼雞毒支原體TMl蛋白的基因的重組新城疫LaSota弱毒疫苗(即表達雞毒支原體TMl蛋白的新城疫LaSota弱毒疫苗)。在一個實施方案中，所述雞毒支原體TMl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。在另一個實施方案中，所述編碼雞毒支原體TMl蛋白的基因的序列是密碼子優化后的序列，優選如SEQ ID No. 2所示(SEQ ID No. 5是雞毒支原體TMl基因的天然序列)。
在另一個實施方案中，在所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗中，在TMl蛋白編碼基因的3'端引入人組織型纖溶酶原激活因子(tPA)序列作為信號肽，優選所述tPA序列如SEQ ID No. 3 所示。在另一個實施方案中，所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗為rLa_tPA_TMl。本發明還有一個目的是提供本發明的重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備預防雞毒支原體引起的疾病和新城疫的雙價疫苗中的應用。本發明還有一個目的是提供一種生產本發明的重組新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，該方法包括(I)構建轉錄質粒，該轉錄質粒包括其中插入編碼雞毒支原體TMl蛋白的基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗的基因組cDNA序列；
(2)構建一個或多個轉錄輔助質粒，該輔助質粒包括編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；(3)將所述轉錄質粒和轉錄輔助質粒共轉染所述新城疫LaSota弱毒疫苗復制許可的宿主細胞，培養轉染后的宿主細胞；(4)收獲上清液，過濾后繼續敏感細胞傳代或接種雞胚尿囊腔救獲重組病毒株。在一個實施方案中，所述轉錄質粒是pBRN-FL-tPA-TMl，其序列如SEQ ID No. 4所
/Jn ο在另一個實施方案中，所述轉錄輔助質粒是質粒pBSNP、pBSP和pBSL。在另一個實施方案中，所述宿主細胞是穩定表達T7聚合酶的細胞系，如BHK-21。本發明還有一個目的是提供根據本發明的方法制備的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，優選為 rLa-tPA-TMl。應當理解，上述實施方案中的技術特征可以任意組合，并且該組合對于本領域技術人員是顯而易見的。本發明在新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遺傳操作系統的基礎上，以Genebank 數據庫雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum, MG) TMl 基因序列(FJ536195)為模板，對其密碼子進行手動優化并在基因3'端引入人組織型纖溶酶原激活因子(tissueplasminogen activator, tPA)(序列號E00896)序列作為信號肽，將tPA-TMl基因克隆到載體pBRN-FL-PmeI上，構建了表達tPA-TMl基因重組新城疫病毒全長cDNA克隆pBRN-FL-tPA-TMl。利用磷酸鈣轉染法，在輔助質粒pBSNP、pBSP和pBSL的共同作用下，成功拯救出重組病毒rLa-tPA-TMl (在本文中有時表示為rLa_tPATMl)。RT-PCR檢測證實重組病毒接種的雞胚尿囊液中含有tPA-TMl基因，western blot和IFA檢測結果均表明tPA-TMl基因在新城疫載體中得到了正確的表達，重組病毒在SPF雛雞上進行了免疫評估實驗，為進一步研制預防雞毒支原體的重組基因工程活載體疫苗奠定了基礎。


圖I.重組病毒感染性克隆構建示意圖； 圖2.重組病毒RT-PCR鑒定(M，核酸分子量標準；I，重組病毒)；圖3.重組病毒感染BHK細胞IFA檢測結果；
圖4. western blot檢測重組病毒中外源蛋白的表達；圖5.重組病毒生長動力學曲線；圖6.免疫組和對照組NDV特異HI抗體檢測；圖7.免疫組和對照組MG特異ELISA抗體水平；和圖8.雛雞剖檢氣囊病理變化圖(rLa-tPA-TMl免疫組攻毒保護，氣囊清亮，與空白SPF對照組無差異；rLaSota免疫攻毒對照組氣囊增厚，有大量干酪樣滲出物)。
具體實施例方式下文將參考實施例詳細描述本發明，所述實施例僅是意圖舉例說明本發明，而不是意圖限制本發明的范圍。本發明的范圍由后附的權利要求具體限定。 實施例I表達編碼雞毒支原體TMl蛋白的基因的重組新城疫LaSota弱毒疫苗的構建和生物學活性I材料與方法I. I細胞、病毒、血清、雞胚及實驗動物Vero-E6細胞(非洲綠猴腎細胞ATCC No. CRL-1586)、BHK-21細胞(乳倉鼠腎細胞ATCCCCL-10)和CEF細胞(雞胚成纖維細胞)由哈爾濱獸醫研究所人畜共患病研究室保存；攻毒用MG毒株由江蘇省農業科學院邵國青研究員惠贈；重組新城疫病毒rLaSota是通過反向遺傳操作技術拯救的不含外源基因的重組LaSota病毒，其由本發明人根據ZL200510097997. 8制備并保存；穩定表達T7聚合酶的重組痘病毒vTF7_3(ATCC，VR-2153)購于ATCC ;雞抗MG高免血清由發明人制備并保存，鼠抗NDV-HN和抗NDV-HI單抗購自SantaCruz ;9 10日齡SPF雞胚和SPF雛雞由哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供；3周齡BALB/c小鼠(均為雌性)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有的動物試驗均在P2級負壓隔離器內進行。I. 2主要試劑和儀器限制性內切酶,DNAMarker,高保真DNA 聚合酶(Primer Star HS DNAPolymerase)均購自TaKaRa公司；預染蛋白Marker,購自Fermentas公司；膠回收試劑盒購自上海華舜生物技術有限公司；質粒中提試劑盒購自QIAGEN公司；磷酸鈣轉染試劑盒，TRIzol LSReagent,鼠源反轉錄酶(M-MLV)試劑盒均購自Invitrogen公司；胎牛血清,Opti-MEM均購自Gbico公司；FITC標記的兔抗雞IgG抗體、TRITC標記的山羊抗鼠IgG抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG和HRP標記兔抗雞IgG均購自Sigma公司；熒光顯微鏡購自ZEISS公司。I. 3合成基因設計根據Genebank 數據庫雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum,MG) TMl 基因序列(FJ536195)，對其進行密碼子優并在基因3'端引入人組織型纖溶酶原激活因子(tissueplasminogen activator, tPA) (GenBank Accession No. E00896)序列作為信號妝，并在tPA-TMl基因的Y端插入Pme I酶切位點和基因終止序列(GE :TTAAGAAAAAA)和基因起始序列(GS ACGGGTAGAA)，在tPA-TMl基因的Y端插入Pme I酶切位點，作為整體，由上海捷瑞生物工程技術有限公司合成。I. 4表達TM-I基因的重組病毒全長cDNA克隆的構建
用Pme I處理以上合成的質粒，回收基因片段，并與同樣經Pme I處理的載體pBRN-FL-Pmel (參考文獻葛金英，溫志遠，王永，等。表達綠色熒光蛋白重組新城疫病毒LaSota疫苗株的構建[J].微生物學報，2006，46 (4) :547 551)連接，構建了表達tPA-TMl基因的重組新城疫病毒全長cDNA克隆，命名為pBRN-FL-tPA-TMl。I. 5重組病毒的拯救將BHK-21細胞接種于6孔細胞板中，當細胞生長達50% 80%單層時，接種痘病毒vTF-3，感作lh。重組質粒pBRN-FL-tPA-TMl及輔助質粒pBSNP、pBSP、pBSL[3,4](輔助質粒pBSNP、pBSP、pBSL還參見申請人之前獲得授權的中國專利“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統及其應用” (ZL200510097997. 8，CN1293195C,申請日2005年9月2日))，共轉染BHK-21細胞,具體操作步驟參照磷酸|丐轉染試劑盒(Calcium Phosphate TransfectionSystem)說明書進行。轉染8 12h后，用ImL含10 % DMSO的PBS溶液休克2. 5min，然后每孔加入阿拉伯糖苷(10 μ g/mL)，37°C孵育24h后換成0pti_MEM，并加入阿拉伯糖苷和TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮，購自NEB公司)(I μ g/mL)。37°C繼續孵育72h后，收獲培 養物上清，接種于9 10日齡SPF雞胚尿囊腔中。5天后，取尿囊液進行新城疫病毒的血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)。重組病毒命名為rLa-tPA-TMl，收獲HA和HI均呈陽性結果的尿囊液，分裝后_70°C凍存。I. 6間接免疫熒光(IFA)檢測外源蛋白的表達重組病毒按照M. O. I為O. 01的量感染生長于24孔板中的BHK-21細胞，24h后用3%多聚甲醛固定細胞，以雞抗MG高免血清和鼠抗NDV-HN單抗為一抗，以SPF雞陰性血清為陰性對照；以熒光素(TRITC)標記的山羊抗鼠IgG和熒光素(FITC)標記的兔抗雞IgG(Sigma)為二抗,共聚焦法進行IFA檢測。I. 7Western blot鑒定外源基因的表達取收獲的尿囊液，過量感染BHK-21細胞，72h后收集細胞，裂解細胞產物進行SDS-PAGE,再轉印至NC(硝酸纖維素)膜上。NC膜用含3% BSA的PBS溶液于4°C封閉過夜。分別以I : 100稀釋的鼠抗NDV-HN單抗和I : 100倍稀釋的雞抗MG高免血清為一抗，以I : 2000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG和兔抗雞IgG(Sigma)為二抗；DAB顯色，待出現特異性條帶后，立即用雙蒸水終止反應。I. 8重組病毒生物學特性試驗取F3代重組病毒按照O. I. E標準進行EID5tl (半數感染量)，MDT (平均致死時間)，IVPI (靜脈內致病指數)和ICPI (腦內致病指數)檢測。確定重組病毒的毒力特征。取F3代重組病毒按IO2EID5tl的劑量接種9 11日齡SPF雞胚，間隔1此隨機取樣，測定每時間點的病毒滴度，繪制重組病毒的復制動力學曲線。2.結果2. I重組病毒的構建與拯救根據Genebank數據庫信息和成基因tPA-TMl，并在tPA-TMl基因末端插入酶切位點和基因調控序列。用Pme I處理合成基因片段，插入同樣經Pme I處理的載體pBRN-FL-Pme I，獲得表達犬瘟熱病毒結構基因重組新城疫病毒全長cDNA克隆pBRN-FL-tPA-TMl (圖 I)。將pBRN-FL-tPA-TMl 與輔助質粒 pBSNP、pBSP、pBSL 共轉染 BHK-21 細胞，獲得血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)陽性的重組病毒rLa-tPA-TMl。以特異性引物(上游引物 NDV3135-PF 5 ' -TCACACGGAATCTGCACCGAG-3 '，下游引物 NDV-TM1-PR 5' -TCTCAACCGTTTAAACatctaGgtC-3')對重組病毒進行RT-PCR檢測，電泳結果所獲PCR產物接近2000bp (圖2)，與預期1950bp的目的片段相符，證明重組病毒內含有tPA-TMl基因。2. 2IFA檢測結果拯救的重組病毒rLa-tPA-TMl以M. O. I.為O. 01感染BHK細胞，同時設定rLaSota接種細胞作為陰性對照。接種細胞37°C培養24h后共聚焦法進行間接免疫熒光檢測，結果顯示重組病毒組呈現MG相應蛋白和NDV蛋白的共表達，rLaSota對照細胞僅呈現針對NDV抗體的陽性結果(圖3)。
2. 3Western blot 檢測結果蛋白樣品經電泳轉印后，重組病毒rLa-tPA-TMl接種的細胞樣品以雞抗MG和雞抗NDV高免血清為一抗進行Western blot檢測。結果相比較LaSota對照細胞樣品，rLa-tPA-TMl接種的細胞樣品在75kDa處出現特異性條帶，與相應外源蛋白預期大小相符。以雞抗NDV為一抗的Western blot檢測結果中，兩個樣品泳道上均出現NDV特異性條帶(圖4)。Western blot檢測結果說明tPA-TMl蛋白在重組病毒中得到了正確表達，并具有良好的反應原性。2. 4重組病毒生物學特性檢測重組病毒MDT均大于90h，ICPI和IVPI均為0，呈典型的NDV弱毒特征。F3代重組病毒致病力指標具體結果見表I。表I重組病毒致病力指標
毒株~EID50(IoglO) MDT(小時) ~ICPI~IVPI
rLaSota8.60^ 120OO
rLa-tPA-TMl8 69139.6OO將F3代重組病毒按102EID50的劑量接種9 11日齡SPF雞胚，間隔12h隨機取樣，測定重組病毒的復制動力學曲線(圖5)。結果重組病毒保持了其親本毒株的生長復制特性，與其親本株具有相似的生長動力學曲線。 實施例2重組病毒免疫試驗及血清抗體檢測I.材料與方法I. I 材料同以上實施例I。I. 2 方法將重組病毒原液稀釋至IO6EID5tl劑量接種3日齡SPF雛雞20只，接種后的SPF雛雞置于負壓隔離器內飼養，間隔一周采集翅靜脈血，分離血清，檢測抗NDV的HI抗體和MG特異ELISA抗體。以LaSota接種組作為對照。免疫接種三周后，取MG強毒株經氣管途徑接種攻毒，每只雞接種0. 5ml。觀察雛雞的呼吸道癥狀，并在14天后采集翅靜脈血，然后進行剖檢，觀察氣囊病變情況，并進行評分記錄。2 結果將重組病毒原液按IO6EID5tl劑量接種3日齡SPF雛雞20只，接種后的SPF雛雞置于負壓隔離器內飼養，間隔一周采集翅靜脈血，分離血清，檢測抗NDV特異的HI抗體(圖6)和MG特異ELISA抗體。結果rLa-tPA-TMl免疫SPF雛雞可以誘導產生針對NDV和MG的顯著抗體反應(圖7)?？贵w隨著免疫時間而持續上升，在免疫后3周進行MG攻毒實驗，攻毒后2周進行剖檢。按照氣囊病變程度進行打分，結果，rLa-tPA-TMl免疫組雛雞氣囊大部分保持透明而清亮，保護率高達85%以上；而rLaSota免疫組雛雞絕大部分均發生氣囊病變，個別雛雞的氣囊甚至布滿干酪樣滲出物，氣囊壁顯著增厚，呈灰白色，20只雞中只有3只雞氣囊尚屬正常(圖8)。氣囊評分的詳細結果見表2。 表2.重組病毒免疫SPF雛雞攻毒MG結果
權利要求
1.一種表達編碼雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum,MG)TMl蛋白的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，優選編碼所述TMl蛋白的基因被插入在新城疫LaSota弱毒疫苗基因組中的P和M基因之間。
2.根據權利要求I的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，其中所述雞毒支原體TMl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
3.根據權利要求I或2的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，其中所述編碼雞毒支原體TMl蛋白的基因序列是密碼子優化后的序列，優選如SEQ ID No. 2所示。
4.根據權利要求1-3中任何一項的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，其中在TMl蛋白編碼基因的3'端引入人組織型纖溶酶原激活因子(tPA)序列作為信號肽，優選所述tPA序列如SEQ ID No. 3 所示。
5.根據權利要求1-4中任何一項的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，其為rLa_tPA_TMl。
6.根據權利要求1-5中任何一項的重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備預防雞毒支原體引起的疾病和新城疫的雙價疫苗中的應用。
7.一種生產權利要求1-5中任何一項的重組新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，該方法包括 (1)構建轉錄質粒，該轉錄質粒包括其中插入編碼雞毒支原體TMl蛋白的基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗的基因組cDNA序列； (2)構建一個或多個轉錄輔助質粒，該輔助質粒包括編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列； (3)將所述轉錄質粒和轉錄輔助質粒共轉染所述新城疫LaSota弱毒疫苗復制許可的宿主細胞，培養轉染后的宿主細胞； (4)收獲上清液，過濾后繼續敏感細胞傳代或接種雞胚尿囊腔救獲重組病毒株。
8.根據權利要求7的方法，其中所述轉錄質粒是pBRN-FL-tPA-TMl，其序列如SEQIDNo. 4所示。
9.根據權利要求7的方法，其中所述轉錄輔助質粒是質粒pBSNP、pBSP和pBSL。
10.根據權利要求7-9中任何一項的方法，其中所述宿主細胞是穩定表達T7聚合酶的細胞系。
全文摘要
本發明涉及一種表達雞毒支原體TM1蛋白的重組新城疫LaSota弱毒疫苗，更具體地，重組新城疫LaSota弱毒疫苗是rLa-tPA-TM1。本發明還公開了制備所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和該重組新城疫LaSota弱毒疫苗在制備預防雞毒支原體引起的疾病和新城疫的雙價疫苗中的應用。
文檔編號A61K39/295GK102961743SQ20121055876
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者步志高, 陳化蘭, 葛金英, 邵國青 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所