專利名稱：茶樹油粕的活性混合提取物的制備方法及提取物和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于果蔬保鮮技術和農藥技術領域，具體涉及一種茶樹油柏活性混合提取物的制備方法以及制備得到的提取物及其作為殺菌劑和保鮮劑在果蔬保鮮和采后病害防治中的應用。
背景技術：
果蔬采后貯藏過程中因微生物病害引起的腐爛所造成的損失是十分巨大的，據資料報道，發達國家的果蔬在采收后因腐爛而造成的損失在15 24%左右，發展中國家由于缺乏冷藏設備及衛生條件較差，果蔬采后病害導致的損失可高達20 50%。目前國內外應用于采后果蔬保鮮的化學防腐劑主要有施保功、撲海因(抑菌脲)、特克多、多菌靈、甲基托布津、仲丁胺等。然而，長期使用化學殺菌劑極易導致病菌產生抗藥
性，并導致這些殺菌劑的使用劑量不得不不斷加大，從而也引發了食品安全、環境污染和有害生物抗藥性等一系列嚴重問題。人們越來越擔心食物鏈中化學殺菌劑殘留對人類健康的影響，要求降低果蔬產品化學殺菌劑的使用量，許多生產上常用的殺菌劑已被許多國家明令禁止在果蔬保鮮中使用。因此，迫切要求研究者尋找新的保鮮藥劑用于水果蔬菜的采后保鮮及控制采后果蔬的微生物病害。為了解決上述問題，人們加大了生物農藥的開發力度，植物源農藥作為生物農藥的重要組成部分而倍受重視，國內外均有植物源農藥的研發報道。然而以往很多植物源農藥的研發均采用中草藥或珍稀名貴等優稀植物，這些原材料的缺乏給大量規模生產應用帶來很大限制。在果蔬保鮮方面，有報道茶皂素與抑霉唑和咪鮮胺按比例混合可抑制柑橘青綠霉菌菌絲生長和孢子萌發，申請號為200810220328.9的中國專利申請公開了茶皂素及其合劑在水果防腐保鮮方面的應用，是采用茶皂素粗提物以及純品在防治水果采后病原真菌方面的應用，這些文獻中述及的茶皂素是從山茶科植物種子中直接提取出來的一種粗品或純
品O我國現有油茶栽培面積約3. 67 X IO6 hm2，每年的茶籽產量在65萬噸左右，約生產15萬噸茶樹油以及產生50萬噸的茶樹油柏，我國潛在的可利用茶樹油柏資源十分豐富。茶樹油柏又稱茶餅、枯餅、茶柏，是油茶籽榨油后剩余物。目前，一少部分茶樹油柏作肥料使用，長期以來也被水產養殖業用于魚塘和蝦塘的清塘消毒。但多數均棄去，利用率很低，因此資源浪費嚴重。但未見直接采用茶樹油柏的提取物在果蔬采后病害防控方面的研發應用報道。

發明內容
本發明的一個目的是克服現有茶樹油柏應用的技術不足，提供一種茶樹油柏的活性混合提取物的制備方法。采用適宜的溶劑，利用現有茶樹油壓榨提取過程中產生的大量茶樹油柏廢渣作為原料，提取獲得具有對果蔬采后病原菌防治效果的活性混合物。本發明的另一個目的是提供上述制備方法制備得到的活性混合提取物。
本發明還有一個目的是提供所述活性混合提取物的應用。特別是在作為殺菌劑和保鮮劑在果蔬保鮮和采后病害防治中的應用。本發明的目的通過以下技術方案予以實現
提供一種茶樹油柏的活性混合提取物的制備方法，是將茶樹油柏粉碎磨粉后往其中加入溶劑，浸提，過濾，萃取去除濾液中多余的油脂，得到的濾液即為茶樹油柏提取液，然后將茶樹油柏提取液濃縮干燥得到茶樹油柏活性混合提取物。所述茶樹油柏為山茶樹果實種仁榨油后的廢渣，也可以是曬干、陰干或烘干后的
干廢渣。所述粉碎磨粉是將曬干、陰干或烘干后的茶樹油柏粉碎至30 100目。所述溶劑為水或者體積比濃度為75%的乙醇水溶液。所述茶樹油柏活性混合提取物是采用水或75%的乙醇水溶液浸提干燥粉碎后的茶樹油柏細粉，得到的茶樹油柏提取液；或者將茶樹油柏提取液濃縮得到的濃縮提取液；或者將茶樹油柏濃縮提取液干燥得到的固體活性混合提取物。本發明基于對茶樹油柏的研究分析，結合提取溶劑和萃取溶劑的篩選試驗，總結大量實驗分析結果，發現采用常規的其他萃取劑對提取物進行萃取，萃取部分很少，且很難分液。經過綜合對比，本發明所述萃取去除濾液中多余的油脂優選采用石油醚作為萃取溶齊U，進一步地，優選按照濾液石油醚的體積比為I :1 3的比例確定石油醚的加入量，萃取時間優選為24小時，操作簡便，萃取得率高。具體地，本發明所述茶樹油柏活性混合提取物的制備方法包括以下步驟
(1)將茶樹油柏干燥后磨粉過篩得茶樹油柏細粉；
(2)往步驟(I)所得茶樹油柏細粉中加入溶劑，浸提后過濾得濾液；
(3)往步驟(2)所得的濾液經萃取去除濾液中多余的油脂得茶樹油柏提取液；
(4)將步驟(3)所得茶樹油柏提取液經旋轉濃縮得茶樹油柏濃縮提取液；(5)將步驟
(4)所得茶樹油柏濃縮提取液進一步冰浴濃縮，恒溫(優選
100 120°C)烘箱干燥得茶樹油柏固體提取物。步驟(I)所述過篩為過30 100目篩。步驟(2)所述溶劑為水或75%乙醇，加入的量按照茶樹油柏細粉溶劑的重量體積比(g/ml)為I :5 7的比例確定。步驟(2)所述浸提的時間為12 24小時，優選24小時；浸提溫度為85°C 95°C，優選95°C。步驟(3)所述油脂萃取劑為石油醚，加入量按照濾液石油醚的體積比為I :1 3的比例確定。步驟(4)所述旋轉濃縮或干燥參照常規方法。其中，步驟(3)、(4)、(5)所得的產物都為本發明終產物，包括采用茶樹油柏提取得到的提取液、濃縮提取液或干燥得到的固體提取物。優選干燥得到的固體提取物。所述終產物具有新的應用價值，可以應用作為殺菌劑或果蔬保鮮劑。本發明從茶樹油柏中提取得到的提取物，經過長期大量的反復試驗證明茶樹油廢渣活性混合提取物對多種果蔬采后微生物病害的病原菌具有抑制作用，尤其是對香蕉、芒果或番木瓜等水果，對其炭疽病、柑桔青綠霉菌、荔枝霜疫霉病等水果采后病菌具有明顯的離體抑菌效果，而且在活體條件下，能防治香蕉、芒果、柑桔等水果的采后病害，對果蔬的無害保鮮具有良好的作用。因此，從茶樹油柏中得到的混合提取物可作為植物源抑菌劑或果蔬保鮮劑使用。本發明的有益效果是
(I)本發明提供了一種新的植物源殺菌劑或果蔬保鮮劑，為抗菌和蔬果保鮮技術領域提供新的技術成果。本發明克服了目前茶樹油柏利用的局限性和資源浪費問題，將茶樹油柏應用于水果防腐保鮮技術領域，所述水果涉及人們日常食用的多種水果，通過實驗總結得出茶樹油柏的混合提取物對香蕉炭疽病菌、芒果炭疽病菌、番木瓜炭疽病菌、柑橘青霉病菌、荔枝霜疫霉病菌等多種病原真菌的抑制作用。(2)現有技術關于茶皂素及茶皂素與化學殺菌劑的合劑在幾種水果保鮮上的應用，所述的茶皂素是從山茶科植物種子中提取出來，包括粗品或純品。茶皂素的獲得需要消耗山茶科植物種子，資源消耗較多；而且無論是粗品還是純品，都需要擯棄其他絕大部分組成成分的活性功能。本發明成功利用種子榨油后產生的廢渣(茶樹油柏)，所述活性混合提
取物是利用廢渣采用水或乙醇浸提濃縮后的產物。首先，本發明不消耗原始資源，利用的是廢棄物茶樹油柏，變廢為寶，而且解決了長期以來困擾茶樹產品生產廠家茶樹油柏的處置問題，不僅如此，本發明還獲得了意想不到的顯著效果，本發明所述茶樹油柏的活性混合提取物應用于果蔬防腐保鮮領域對所試采后病原真菌的抑制作用優于茶皂素提取物和茶皂素純品，而本發明混合提取物的制備方法簡單易行，成本低，不需要進一步提純，收到了雙重的有益效果。(3)本發明采用水和乙醇水溶液作為提取溶劑成功獲得有很好防腐保鮮作用的茶樹油柏活性混合提取物，避免了大量有害有機化學試劑的應用對環境和操作人員造成的潛在危害，所述茶樹油柏的混合提取物使用安全，符合可持續農業發展的要求。(4)本發明基于創造性思維，提供了新的技術途徑，采用適當的方法處理廢棄的茶樹油柏制備有益的抗菌保鮮劑，變廢為寶，著實解決了長期以來茶樹油加工企業處置廢渣的難題，為推廣茶樹油的生產加工應用掃平障礙。( 5 )本發明方法簡單易行，原料易得且成本很低，具有優良的推廣價值。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步詳細說明本發明。本發明的技術方案是通過大量的實施例總結得出，但實施例中選取的水果是一些常見的代表性水果，相同或相似的實施例不能一一贅述，但本發明并不因此局限于此。實施例I茶樹油柏提取物的制備
茶樹油柏來自廣東省肇慶市某茶樹油生產廠家(也可以采用其他廠家榨油產生的茶樹油柏，并不因此限定本發明)，其他試劑均為市購常規產品。為了便于說明，本實施例采用的茶樹油柏來自制備茶樹油的南山茶種仁。將茶樹油柏干燥后用粉碎機粉碎磨成粉狀，過100目篩，快速分離，得茶樹油柏細粉；往500 g茶樹油柏細粉中加入3500 mL純凈水，在85°C下過夜浸提茶樹油柏細粉，過濾或離心得到濾液800 mL，濾液中加入石油醚800 mL，萃取24小時后得到茶樹油柏提取液360mL，即為茶樹油柏提取液；也可以將茶樹油柏提取液經旋轉濃縮得到濃縮提取物180mL，即為茶樹油柏濃縮提取
液；
也可以將濃縮提取物于100 120°C恒溫干燥后得茶樹油柏固體提取物75 g，所得茶樹油柏混合提取物的為褐色粉狀顆粒物，可溶于水，溶解率在90%以上。所得茶樹油柏固體提取物低溫(I 7°C )貯存備用。將本實施例所得茶樹油柏提取液、濃縮提取物、固體提取物分別加適量水后與NYDA培養基(常規組成)混合均勻，分別制成濃度為5mL茶樹油柏提取液/mL培養基、5mL茶樹油柏濃縮提取液/mL培養基、5mg茶樹油柏固體提取物/mL培養基。采用改進的生長速率法，將帶藥培養基倒入直徑為9 cm的培養皿中，冷卻后，在培養皿中央接種5 mm香蕉炭Iil(Collectotrichun musae)(Colletotrichum gloeosporioides)>柑橘指狀青霉菌iPenicillium digitatum)或蒸枝霜疫霉菌菌片(所述菌種實驗室常規使用菌株)，以純NYDA培養基平板作為空白對照。置于28°C恒溫箱中培養，測量記錄菌落大小
(用十字交叉法測定菌落直徑)，計算抑菌率。抑菌率(％)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑X 100
實驗結果見表I所示，從表I可知，本發明茶樹油柏三種提取物都能明顯抑制所述病原菌的生長，抑菌率都達到35. 5%以上，以對香蕉炭疽病菌的效果最好。對同一病原菌來說，因為含有活體提取物的濃度高，固體提取物的效果最好。
^ I茶樹油粕不同提取產_對幾種M后病隠異菌的抑S效果
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00οο實施例2茶樹油柏提取物的制備
茶樹油柏來自廣東省肇慶市某茶樹油生產廠家(也可以采用其他廠家榨油產生的茶樹油柏，并不因此限定本發明，茶樹種類不做限定)，其他試劑均為市購常規產品。將茶樹油柏干燥后用粉碎機粉碎磨成粉狀，過50目篩，快速分離，得茶樹油柏細粉；往500 g茶樹油柏細粉中加入3000 mL純凈水，在90°C下過夜浸提茶樹油柏細粉。過濾或離心得到濾液450mL,濾液中加入石油醚900mL，萃取24小時后，得到茶樹油柏提取液300mL，經旋轉濃縮得到濃縮提取物140mL，將濃縮提取物于100 120°C恒溫干燥后得茶樹油柏固體提取物58 g，所得茶樹油柏固體提取物低溫(I 7°C)貯存備用。所得茶樹油柏混合提取物的為褐色粉狀顆粒物，可溶于水，溶解率在90%以上。實施例3茶樹油柏提取物的制備
茶樹油柏來自廣東省肇慶市某茶樹油生產廠家(也可以采用其他廠家榨油產生的茶樹油柏，并不因此限定本發明)，其他試劑均為市購常規產品。將茶樹油柏干燥后用粉碎機粉碎磨成粉狀，過30目篩，快速分離，得茶樹油柏細粉；往500 g茶樹油柏細粉中加入2500 mL純凈水，在95°C下過夜浸提茶樹油柏細粉。過濾或離心得到濾液680 mL，濾液中加入石油醚1800mL，萃取24小時后，得到茶樹油柏提取液340mL，經旋轉濃縮得到濃縮提取物160mL，將濃縮提取物于100 120°C恒溫干燥后得茶樹油柏固體提取物75 g，低溫(I TC)貯存備用。所得茶樹油柏混合提取物的為褐色粉狀顆粒物，可溶于水，溶解率在90%以上。實施例4茶樹油柏提取物的制備
茶樹油柏來自廣東省肇慶市某茶樹油生產廠家(也可以采用其他廠家榨油產生的茶樹油柏，并不因此限定本發明)，其他試劑均為市購常規產品。將茶樹油柏干燥后用粉碎機粉碎磨成粉狀，過100目篩，快速分離，得茶樹油柏細粉；往5000 g細粉中加入體積比濃度為75%的乙醇水溶液35000 mL，在90°C下浸提茶樹油柏細粉12小時。過濾或離心得到濾液4750 mL,濾液中加入石油醚5000 mL,萃取24小時后，得到茶樹油柏提取液2700mL，經旋轉濃縮得到濃縮提取物1600mL，將濃縮提取物于100 120°C恒溫干燥后得茶樹油柏固體提
取物900 g，所得茶樹油柏提取物低溫(I 7°C )貯存備用。所得茶樹油柏混合提取物的為褐色粉狀顆粒物，可溶于水，溶解率在90%以上。實施例5茶樹油柏提取物的制備
茶樹油柏來自廣東省廣寧某茶樹油生產廠家(也可以采用其他廠家榨油產生的茶樹油柏，并不因此限定本發明)，其他試劑均為市購常規產品。將茶樹油柏干燥后用粉碎機粉碎磨成粉狀，過50目篩，快速分離，得茶樹油柏細粉；1000 g細粉加入75%乙醇6000 mL，在90°C下浸提茶樹油柏細粉24小時。過濾或離心得到濾液1450 mL，濾液中加入石油醚2900mL,萃取24小時后，得到茶樹油柏提取液860mL，經旋轉濃縮得到濃縮提取物330mL，將濃縮提取物于100 120°C恒溫干燥后得茶樹油柏固體提取物150 g，所得茶樹油柏提取物低溫貯存備用。所得茶樹油柏混合提取物的為褐色粉狀顆粒物，可溶于水，溶解率在90%以上。實施例6茶樹油柏提取物的制備
茶樹油柏來自廣東省廣寧某茶樹油生產廠家(也可以采用其他廠家榨油產生的茶樹油柏，并不因此限定本發明)，其他試劑均為市購常規產品。將茶樹油柏干燥后用粉碎機粉碎磨成粉狀，過30目篩，快速分離，得茶樹油柏細粉；5000 g細粉加入75%乙醇15000 mL,在90°C下浸提茶樹油柏細粉24小時。過濾或離心得到濾液3200 mL，濾液中加入石油醚9600mL，萃取24小時后，得到茶樹油柏提取液2400mL，經旋轉濃縮得到濃縮提取物780mL，將濃縮提取物于100 120°C恒溫干燥后得茶樹油柏固體提取物340 g，所得茶樹油柏提取物低溫貯存備用。所得茶樹油柏混合提取物為褐色粉狀顆粒物，可溶于水，溶解率在90%以上。實施例7茶樹油柏不同溶劑或方法提取物對水果采后病原菌的抑制作用試驗 采用改進的生長速率法，稱取本發明不同溶劑的茶樹油柏提取物與NYDA培養基混合
均勻，分別制成濃度為0.2 mg茶樹油柏固體提取物/mL培養基、O. 5 mg茶樹油柏固體提取物/mL培養基、I mg茶樹油柏固體提取物/mL培養基、2 mg茶樹油柏固體提取物/mL培養基和5 mg茶樹油柏固體提取物/mL培養基的帶藥培養基，將帶藥培養基倒入直徑為9 cm的培養皿中，冷卻后，在培養皿中央接種5 mm香蕉炭疽病菌oiricAffi musae)>番木瓜炭疽病菌(Colle to tri chum gloeospori oi des )、柑橘指狀青霉菌 iPeni ci Ili uni或荔枝霜疫霉菌菌片(所述菌種均為實驗室常規實驗菌株)，以純NYDA培養基平板作為空白對照。置于28°C恒溫箱中培養，測量記錄菌落大小(用十字交叉法測定菌落直徑)，計算抑菌率。抑菌率(％)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑X 100
實驗結果見表2、表3、表4和表5所示。從表2中可以發現，本發明茶樹油柏的水和乙醇提取物對香蕉炭疽病菌的生長均有很強的抑制作用，以乙醇提取物的抑菌效果最強，且水和乙醇提取物對香蕉炭疽病菌的抑菌作用顯著優于純度為98%的茶皂素。從表3中可以發現，與抑制香蕉炭疽病菌的效果相比，本發明茶樹油柏提取物對番木瓜炭疽病菌的抑菌效果略有降低，但仍存在顯著的抑制作用，水和乙醇提取物的抑菌效果差異不大，5. O mg/ml的水和乙醇提取物對該病原菌的抑菌率是同濃度98%茶皂素的2倍之多。從表4中可以發現，與抑制炭疽病菌的效果相比，本發明茶樹油柏提取物在5. O mg/ml以上能明顯抑制柑橘指狀青霉病菌的生長，以乙醇提取物的抑菌效果最強，10. O mg/ml的75%乙醇提取物即可完全抑制柑橘青霉病菌的生長，而98%茶皂素的最大抑菌率在50 mg/ml時才達到58. 5%。表5顯示對荔枝霜疫霉菌的抑菌效果最強達60%以上，略差于前述幾種病原真菌，但仍優于
同濃度下的純度為98%茶皂素。
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權利要求
1.一種茶樹油柏的活性混合提取物的制備方法，其特征在于是往粉碎茶樹油柏得到的細粉中加入溶劑浸提，過濾，萃取去除濾液中多余的油脂，得到的濾液即為茶樹油柏活性提取液；或將茶樹油柏提取液濃縮得到濃縮活性提取液；或將濃縮提取液干燥得到茶樹油柏活性混合提取物； 所述茶樹油柏的活性混合提取物包括茶樹油柏活性提取液、茶樹油柏濃縮活性提取液或茶樹油柏活性混合固體提取物； 所述溶劑為水或者體積比濃度為75%的乙醇水溶液。
2.根據權利要求I所述茶樹油柏的活性混合提取物的制備方法，其特征在于所述溶劑加入的量按照茶樹油柏細粉溶劑為I g :5 7 ml的比例確定。
3.根據權利要求I所述茶樹油柏的活性混合提取物的制備方法，其特征在于所述浸提的時間為12 24小時，浸提溫度為85°C 95°C。
4.根據權利要求I所述茶樹油柏的活性混合提取物的制備方法，其特征在于所述細粉粒度為30 100目。
5.根據權利要求I所述茶樹油柏的活性混合提取物的制備方法，其特征在于所述萃取去除濾液中多余的油脂采用石油醚作為萃取溶劑。
6.根據權利要求5所述茶樹油柏的活性混合提取物的制備方法，其特征在于所述石油醚的加入量按照濾液石油醚的體積比為I :1 3的比例確定。
7.根據權利要求1、2、3、4、5或6所述茶樹油柏的活性混合提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)將茶樹油柏干燥后磨粉過篩得茶樹油柏細粉； (2)往步驟(I)所得茶樹油柏細粉中加入溶劑，浸提后過濾得濾液； (3)將步驟(2)所得的濾液中加入萃取劑，萃取去除濾液中多余的油脂得茶樹油柏提取液； (4)將步驟(3)所得茶樹油柏提取液經旋轉濃縮得茶樹油柏濃縮提取液； (5)將步驟(4)所得茶樹油柏濃縮提取液濃縮干燥得茶樹油柏固體提取 物。
8.權利要求1、2、3、4、5或6所述制備方法制備得到的茶樹油柏的活性混合提取物。
9.權利要求8所述茶樹油柏的活性混合提取物作為植物源抑菌劑或果蔬保鮮劑的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于在對香蕉、芒果或番木瓜的炭疽病、柑桔青綠霉菌、荔枝霜疫霉病抑菌防治方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種茶樹油粕的活性混合提取物的制備方法及提取物和應用。本發明采用水或乙醇作為溶劑浸提廢棄的茶樹油粕廢渣制備得到所述活性混合提取物，對多種果蔬采后微生物病害的病原菌具有抑制作用，尤其是對香蕉、芒果或番木瓜炭疽病、柑橘青霉菌和綠霉病等水果的采后病菌具有明顯的離體抑菌效果，而且在活體條件下，能防治香蕉、芒果、柑桔等水果的采后病害，對果蔬的采后無公害保鮮具有良好的作用，可作為植物源抑菌劑或果蔬保鮮劑使用。
文檔編號A23B7/153GK102870824SQ20121031775
公開日2013年1月16日 申請日期2012年8月31日 優先權日2012年8月31日
發明者孟祥春, 李俊, 張愛玉, 姜波, 畢方鋮 申請人:廣東省農業科學院果樹研究所