專利名稱：轉基因玉米bt11品系的環介導等溫擴增引物、試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于食品檢驗技術方法領域，具體涉及一種食品中轉基因玉米BTll品系環介導等溫擴增(LAMP )引物、試劑盒及檢測方法。
背景技術：
玉米是世界上重要的糧食作物之一，其單位面積產量位居榜首。世界范圍內玉米害蟲高達350多種，其中以鱗翅目的玉米螟分布最廣、危害最重，是世界性的重要玉米害蟲，其嚴重影響著玉米的產量和品質。近十多年來，轉基因植物培育取得突破，推出了一批新品種，在改善農作物生產中發揮了明顯的作用，也顯露出巨大的潛力。然而，人們對轉基因玉米的安全性存在著很多的爭論。面對生物基因工程技術對我國經濟利益帶來的沖擊和國外轉基因產品對生態環境和消費者可能帶來的風險，對轉基因玉米進行檢測具有重要的 現實意義。2009年，我國已經解除了對玉米進口的限制，大批量的玉米已經涌入中國。這勢必對我國的農業安全帶來沖擊。Btll轉基因玉米品系是瑞士先正達種子有限公司研發的產品，是DNA直接轉化先天玉米品系H8540，并在選擇性培養基上培養而出的，具有抗歐洲玉米螟(ECB;0strinianubilalis)的抗性，也可以抗草甘膦除草劑。在2004年4月6日首次獲得中國農業部頒發的安全證書，是目前用于加工食品和飼料最多的品系之一。目前，轉基因玉米成分檢測方法主要為TaqMan實時熒光PCR方法和普通PCR方法。普通PCR方法由于操作繁瑣，污染環境、靈敏度低等不足已逐漸被實時熒光PCR檢測方法所取代。但是TaqMan實時熒光PCR檢測對技術要求相對較高且成本昂貴，目前急需制定在檢驗檢疫一線的基層實驗室能夠普遍適用的快速、簡便、準確的標準檢測方法。國內發布的食品轉基因玉米BTll品系特異性檢測標準有GB/T 19495. 5 一 2004《轉基因產品檢測核酸定量PCR檢測方法》、SN/T 1196-2003《玉米中轉基因成分定性PCR檢測方法》、SN/T 1201-2003《植物性飼料中轉基因成分定性PCR檢測方法》和農業部869號公告-3-2007《轉基因植物及其產品成分檢測抗蟲和耐除草劑玉米Btll及其衍生品種定性PCR方法》，這4個標準均采用實時熒光PCR方法或普通PCR方法。國外發布的轉基因玉米BTll品系特異性檢測技術是歐盟發布的官方檢測方法“Event-specific Method for the Quantification of Maize Line BtlI UsingReal-time PCR(CRLVL10/07VP) ”，該方法采用的是實時熒光PCR方法。國內外相關標準的要求由于歐盟是最為關注食品轉基因成分的地區，多年來不斷更新檢驗監管規定和檢測技術要求，因此玉米轉基因BTll品系的標準檢測方法歷來主要依據歐盟規定的方法，國內相關標準也是參考歐盟的技術文件制定的。目前，轉基因玉米BTll品系標準檢測方法的文獻依據是歐盟發布的官方方法“Event-specific Method for the Quantification of MaizeLine Btll Using Real-time PCR(CRLVL10/07VP)’’，國內的 GB/T 19495. 5 — 2004《轉基因產品檢測核酸定量PCR檢測方法》也規定了同樣的技術內容。這些方法采用的均是TaqMan實時熒光PCR方法，最低檢出限為O. 5%。隨著分子生物學理論和技術的快速發展，以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為基礎的新型鑒定技術已日益得到廣泛應用。環介導等溫擴增法(LAMP, Loop-mediated IsothermalAmplification)是在PCR基礎上創建的一種較理想的手段，其特點是①只需一恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變性；②高特異性采用六個區段，四條引物，擴增特異性高，可以根據是否擴增來判斷目標基因的存在與否；③快速、高效擴增擴增在不到Ih即可完成，且產率高；④靈敏度高擴增模板可達10拷貝或更少；⑤鑒定簡便在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物-焦磷酸鎂沉淀，可用肉眼觀察判斷擴增與否；另外，它利用恒溫和低反應溫度(63°C)，減少細胞損傷，檢測人員實際操作非常簡便。總體而言，LAMP法是一種簡便、快速、高特異的基因擴增法，不需要特殊的試劑和儀器設備，采用該方法能建立起總成本低廉的檢測體系，在轉基因食品檢測等領域具有廣闊的應用前景。目前尚未發現LAMP方法應用于食品轉基因成分檢測的標準化研究。

發明內容
本發明的技術方案為通過考察并鎖定轉基因玉米BTll品系靶基因，轉基因玉米BTll品系外源基因和玉米邊界序列(AY123624. I)中的SEQ ID NO 1序列，然后設計合成4套特異性LAMP引物，優化體系，最后確定一套特異性LAMP引物，其堿基序列如SEQ ID NO 2 7 ;進而確定了 LAMP方法的技術參數，最后室內外驗證驗證引物特異性、靈敏度、穩定性。本發明的具體技術方案如下本發明涉及一種檢測轉基因玉米BTll品系的環介導等溫擴增引物，其堿基序列為 SEQID NO :2 7，如表 I 表I轉基因玉米品系LAMP BTll弓丨物
權利要求
1.一種檢測轉基因玉米BTll品系的環介導等溫擴增引物，其特征在于，堿基序列為SEQ ID NO -.2 。
2.—種轉基因玉米BTll品系的環介導等溫擴增法檢測試劑盒，其特征在于，包括檢測引物SEQ ID NO :2 7。
3.根據權利要求2所述的轉基因玉米BTll品系的環介導等溫擴增法檢測試劑盒，其特征在于，在檢測試劑盒中每 25μ L的LAMP 反應體系包括SEQ ID NO :2 3 各 O. 2 μ M、SEQ ID NO :4 5 各 I. 6 μ Μ、SEQ ID NO :6 7 各 0· 8 μ Μ、I X ThermoPol 緩沖液、0. 8mM 甜菜堿、I. 4mM dNTP、8UBst DNA 大片段聚合酶； 其中上述 IXThermoPol 緩沖液為IOmM KCl,20mM pH 8. 8 的 Tris-HCl，IOmM(NH4) 2S04,2mM MgSO4 和 O. l%Triton X-IOO0
4.利用權利要求2所述試劑盒檢測轉基因玉米BTll品系的方法，其特征在于，檢測步驟包括 ①分別提取BTll轉基因玉米品系標準樣品和待測樣品的基因組DNA； ②分別以步驟①精提的DNA作為模板，利用環介導等溫擴增法檢測 每 25yL 的LAMP反應體系，其包括DNA 模板 200ng、SEQ ID NO :2 3 各 O. 2 μ M、SEQ IDNO :4 5 各 I. 6 μ M、SEQ ID NO :6 7 各 0· 8 μ Μ、I X ThermoPol 緩沖液、0. 8mM 甜菜堿、I. 4mMdNTP、8U Bst DNA大片段聚合酶、蒸餾水余量； 其中上述 IXThermoPol 緩沖液為IOmM KCl,20mM pH 8. 8 的 Tris-HCl，IOmM(NH4) 2S04,2mM MgSO4 和 O. l%Triton X-IOO ； 反應條件為63°C恒溫反應60min，80°C下保溫5min ； ③環介導等溫擴增法的檢測結果以肉眼、濁度法或顯色法進行判斷。
5.根據權利要求4所述的檢測轉基因玉米BTll品系的方法，其特征在于，所述步驟③中的濁度法利用LAMP實時濁度儀完成。
6.根據權利要求4所述的檢測轉基因玉米BTll品系的方法，其特征在于，所述步驟③中的顯色法使用熒光染料SYBR Green I。
全文摘要
本發明公開一種轉基因玉米BT11品系的環介導等溫擴增引物、試劑盒及其應用，所述的LAMP檢測所用的引物，其堿基序列如SEQIDNO2~7；采用LAMP檢測技術，結合濁度法或顯色法，建立了適用于食品中轉基因玉米BT11品系特異性檢測標準方法，本發明所述方法操作簡單，不依賴昂貴儀器，檢測時間在1小時左右，方法靈敏度達到0.5%，檢測效率達到傳統PCR方法或熒光定量PCR方法，能夠應用于檢驗檢疫實際工作，尤其適用于大量樣品快速初篩和各種基層實驗室食品品質監控，適合作為行業推薦性標準應用推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102827939SQ201210330429
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月7日 優先權日2012年9月7日
發明者徐君怡, 曹際娟, 鄭秋月, 趙昕 申請人:徐君怡, 曹際娟, 鄭秋月, 趙昕