專利名稱：綿羊皮膚組織中內參基因的篩選方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及基因的篩選方法。
背景技術：
隨著對不同物種全基因組序列的揭曉，基因的定量表達水平研究在生命科學領域日趨顯得重要了。RT-PCR技術作為一種高效的定量PCR技術，可以實現對某個基因進行實時監測，監測其在不同組織、細胞、個體以及不同發育階段或經過某種特殊條件處理后的表達水平。為了去除不同樣本在RNA的產量、質量、逆轉錄效率以及移液器上可能存在的差異而獲得目標基因特異性表達的真正差異，通常選擇特定的內參基因進行標準化校正。內參基因擴增中的變化能反映RNA產量、質量和/或cDNA合成效率的變化。因此，為減少樣本間的差異選擇適當的內參基因是必要的(wong等,2005 ；Nolan等,2006 ；Vandesom等，2002)。理想的內參基因應該表達量適中，不存在假基因，在不同的細胞、組織中其無顯著性表達量差異，并且其不受任何實驗處理措施的影響而體現在表達水平與目標基因相似(陳鳳花等，2005)。放之四海而皆準的內參基因是不存在的，因此，必須在特定的實驗條件下檢測多種內參基因的穩定性，從而篩選出符合實驗特定條件的理想內參(T h e 11 i η等，1999 ;Sturzenbaum等，2001)。有研究報道，定量PCR采取單一的內參校正與標準化目標基因的表達的研究達到了 90%以上[69] (suzuki等，2000 ；vandesompel等，2002)其還闡明僅使用單個內參的方法，可能使得實驗表達數據產生二十倍甚至以上的誤差，盲目地使用一個持家基因作內參，不但可能難以發現目標基因的微小差異表達，甚至可能得出錯誤的悖論。根據Thellin等[7CI], (1999), vandesompele 等，(2002),Brinor 等，(2006)和 PeterSeta[71] (2007)等的研究表明至少要使用兩個及其以上內參基因才能對定量PCR進行準確的校正。因此，用于評估內參基因穩定性的統計分析軟件geNorm(Vandesompele等,2002)應運而生。目前，常用的內參基因有GAPDH、ACTB、18SrRNA、B2M、TBP、RPL13A等基因。目前，對于中國美利奴羊(新疆型)GAPDH基因作為皮膚組織的內參基因研究還未見報道。

發明內容
本發明提供一種綿羊皮膚組織中內參基因的篩選方法，本發明解決了目前還沒有對中國美利奴羊(新疆型)GAPDH基因作為皮膚組織內參基因篩選方法的問題。為解決上述問題，本發明采用如下技術方案綿羊皮膚組織中內參基因的篩選方法，包括以下步驟—、確定內參基因的方法以綿羊皮膚組織為試驗樣品，首先，取10_20mg皮膚組織組織液氮中徹底研磨，RNA提取試劑盒對皮膚組織樣進行總RNA提取，I %瓊脂糖凝膠電泳，O. 5 X TBE電泳緩沖液，100V, 15min來檢測RNA完整性；二、取一定量的RNA提取物，用ddH20稀釋2_10倍，用ddH20將分光光度計調零，取稀釋液進行測定RNA純度，取0D260/0D280讀數在I. 8-2. O之間的RNA樣品進行后續試驗，計算RNA終濃度(ng/ μ L) = (0D260) X (稀釋倍數η) X 40 ;三、其次，取50ng/ μ L的RNA樣品作為模板，采用cDNA合成試劑盒進行反轉錄合成cDNA，參考GenBank中綿羊相應基因的核苷酸序列，分別設計并合成18S rRNA、β -Actin、GAPDH、B2M、RPL13A、TBP 這 6 個內參基因的引物；四、再次，以反轉錄合成CDNA為模板，分別以6個內參基因為引物，采用SYBRGreen I熒光染料試劑盒，進行優化條件的實時熒光定量PCR，每個分析對象均取3次重復實驗數據的平均值，每次實驗用ddH20作為陰性對照，讀取實時熒光定量PCR儀系統檢測的每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數，即Ct值；五、最后,采用geNorm程序計算6個內參基因標準化因子Vn/n+Ι的配對差異分析從而判定最適內參基因的數目，同時，統計分析各內參基因的表達穩定度平均值，即M值，并對其進行排序，M值越小，基因表達越穩定，最終篩選出在綿羊皮膚組織中表達最穩定的 內參基因是18S rRNA、β-Actin、GAPDH三個內參基因。本發明的技術效果理想的看家基因應在各種實驗因素條件下，各種類型的組織或細胞中均恒定表達。大量的研究表明，任何一種內參基因的所謂恒定表達都僅僅是在一定類型的細胞或實驗因素作用下“有范圍”的恒定。采用傳統的一種內參基因作標準化將導致相對大的誤差；而選擇多種內參基因的幾何平均數作為標準化因子來校正目的基因的表達效果更好。大量的研究證實在同一實驗中選用2-4個內參可有效提高目標基因的定量準確性。經篩選對所有組織或細胞的內參基因，最終確定出2個甚至以上標準作為內參基因，從而得出更可信的結果，該程序對于任何基因的準確定量均具有極其重要意義。本發明在綿羊皮膚組織中同時使用β -Actin、GAPDH、18SrRNA等3個內參基因，即標準內參基因的
循環閾值計算公式為
Gt (內參基因)\8SrRNA ^ A-Actin ^ GAPDH以校正目的基因表達水平。本發明首次利用SYBR Green I特異性地與雙鏈DNA結合發出熒光的特性，以LightCycler 2. O為平臺，建立了中國美利奴羊(新疆型)皮膚組織中GAPDH基因的SYBRGreen I實時熒光定量PCR檢測方法，旨在為進一步研究中國美利奴羊(新疆型)相關基因的定量表達奠定基礎。為解決這一問題，首先選定合適的內參并檢測內參基因穩定性，最終確定出最適內參的個數，都將需要在實驗設計時考慮周全。目前，國內尚未見綿羊皮膚組織中定量PCR分析基因表達研究中關于內參基因篩選的相關報道。本研究將選擇18SrRNA、ACTB、GAPDH、B2M、TBP、RPL13A等6個內參基因，檢測其在綿羊皮膚組織中表達穩定性，旨在為后續RT-PCR最適內參基因的選擇奠定基礎。


圖I是本發明綿羊皮膚組織中總RNA提取檢測結果圖；圖中M D2000 marker ;1、
2:細型細毛羊mRNA樣品；3、4 :超細型細毛羊mRNA樣品；圖2是本發明GAPDH基因RT-PCR產物檢測結果圖；圖中M D2000 marker ;1、2、3、4 :RT-PCR 產物；
圖3是本發明GAPDH擴增曲線及標準曲線對比圖；其中a、GAPDH基因擴增曲線，b、GAPDH基因標準曲線；圖4是本發明6個內參基因中Log (起始濃度)與循環閾值Ct線性關系圖；圖5是本發明GAPDH基因熔解曲線圖；圖6是本發明19個綿羊皮膚組織樣品在6個內參基因中的循環閾值統計分析圖；圖7是本發明內參基因表達穩定性平均值圖表；
圖8是本發明最適標準化內參基因數目的確定圖表。
具體實施例方式下面用最佳的實施例對本發明做詳細的說明。I提取過程綿羊皮膚組織中內參基因的篩選方法，包括以下步驟—、確定內參基因的方法以綿羊皮膚組織為試驗樣品，首先，取10_20mg皮膚組織組織液氮中徹底研磨，RNA提取試劑盒對皮膚組織樣進行總RNA提取，I %瓊脂糖凝膠電泳，O. 5 X TBE電泳緩沖液，100V, 15min來檢測RNA完整性；二、取一定量的RNA提取物，用ddH20稀釋2_10倍，用ddH20將分光光度計調零，取稀釋液進行測定RNA純度，取0D260/0D280讀數在I. 8-2. O之間的RNA樣品進行后續試驗，計算RNA終濃度(ng/ μ L) = (0D260) X (稀釋倍數2-10) X 40 ;三、其次，取50ng/ μ L的RNA樣品作為模板，采用cDNA合成試劑盒進行反轉錄合成cDNA，參考GenBank中綿羊相應基因的核苷酸序列，分別設計并合成18S rRNA、β -Actin、GAPDH、B2M、RPL13A、TBP 這 6 個內參基因的引物；四、再次，以反轉錄合成cDNA為模板，分別以6個內參基因為引物，采用SYBRGreen I熒光染料試劑盒，進行優化條件的實時熒光定量PCR，每個分析對象均取3次重復實驗數據的平均值，每次實驗用ddH20作為陰性對照，讀取實時熒光定量PCR儀系統檢測的每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數，即Ct值；五、最后，采用geNorrm程序計算6個內參基因標準化因子Vn/n+Ι的配對差異分析從而判定最適內參基因的數目，同時，統計分析各內參基因的表達穩定度平均值，即M值，并對其進行排序，M值越小，基因表達越穩定，最終篩選出在綿羊皮膚組織中表達最穩定的內參基因是18S rRNA、β-Actin、GAPDH三個內參基因。2具體實驗過程2. I實驗材料2. I. I實驗羊來源及樣品采集本實驗所用19只中國美利奴羊(新疆型)均由新疆鞏乃斯種羊場提供，其中，9只周歲超細型細毛羊，10只周歲細型細毛羊，采集其肩胛部皮膚組織樣品液氮中凍存。2. I. 2主要儀器設備I. BIOFUGE PRIMO R型低溫離心機美國Thermo公司2. ZHJH C1112B型超凈工作臺上海智誠3. Eppendorf 移液器德國 Eppendorf 公司4. DK-8P型電熱恒溫水槽國產精宏
5. IKA MS3型圓周振蕩器上海吉延環境儀器有限公司6. Mini-6K型微型離心機北京戴美克科技有限公司7. LightCycler 2. O 突光定量 PCR 儀Roche 公司8. My Cycler 型 PCR 儀美國 Bio-Rad 公司9. PowerPac Basic 型電泳儀美國 Bio-Rad 公司10. DYCP-31CN型瓊脂糖水平電泳槽北京六一儀器廠11. NAN0DR0P 2000型分光光度計美國Thermo公司
12. GZX-9140MBE型電熱恒溫鼓風干燥箱上海博訊實業有限公司13. LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠14.摩爾Σ H20超純水機上海摩勒科學儀器廠15.微波爐國產美的公司16.電冰箱中國海爾公司2. I. 3試劑盒及普通試劑RNA抽提試劑盒、cDNA合成試劑盒(含IOXRT mix、dNTP混合液、Oligo dT15、Quant Reverse Transcriptase、RNase-free · ddH20)、SYBR Green I 突光染料試劑盒(含2. 5XReal Master Mix、20XSYBR Solution、RNase-free · ddH20)、Taq 酶(含 IOXTaqbuffer>25mmol/LMg2+) > dNTP>D2000> Marker I 等均購自 Tiangen 公司；硼酸、EDTA、瓊脂糖(Agrose H)、溴化乙錠(EB)，無水乙醇、DEPC等試劑均由北京鼎國生物有限公司提供。2. I. 4溶液與緩沖液的配制(I) I %瓊脂糖lg瓊脂糖，溶于IOOmL O. 5 X TBE，微波爐加熱溶解；(2)2%瓊脂糖2g瓊脂糖，溶于IOOmL O. 5XTBE，微波爐加熱溶解；(3)溴化乙錠 Etfc(10mg/mL) : IOOmL O. 5 X TBE 緩沖液中加入 8 μ L EtBr，完全熔
解后置棕色瓶中招箔包裹4°C保存；(4) 10XTBE 108g Tris 堿、55g 硼酸、9. 3g EDTA 溶于 IOOOmL 去離子水中。2. 2實驗方法2. 2. I內參基因引物設計參考GeneBank中綿羊相應基因的核苷酸序列,采用Primer 5. O軟件設計引物，由生工生物(上海)有限公司合成，內參基因的基本信息見表2-1。表2-1內參基因的基本信息
權利要求
1.綿羊皮膚組織中內參基因的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟 一、確定內參基因的方法以綿羊皮膚組織為試驗樣品，首先，取10-20mg皮膚組織組織液氮中徹底研磨，RNA提取試劑盒對皮膚組織樣進行總RNA提取，1%瓊脂糖凝膠電泳，O. 5 X TBE電泳緩沖液，100V, 15min來檢測RNA完整性； 二、取一定量的RNA提取物，用ddH20稀釋2-10倍，用ddH20將分光光度計調零，取稀釋液進行測定RNA純度，取0D260/0D280讀數在I. 8-2. O之間的RNA樣品進行后續試驗，計算 RNA 終濃度(ng/ μ L) = (0D260) X (稀釋倍數 2-10) X 40 ； 三、其次，取50ng/l·!L的RNA樣品作為模板，采用cDNA合成試劑盒進行反轉錄合成cDNA，參考GenBank中綿羊相應基因的核苷酸序列，分別設計并合成18S rRNA、β-Actin、GAPDH、B2M、RPL13A、TBP這6個內參基因的引物； 四、再次，以反轉錄合成cDNA為模板，分別以6個內參基因為引物，采用SYBRGreen I熒光染料試劑盒，進行優化條件的實時熒光定量PCR，每個分析對象均取3次重復實驗數據的平均值，每次實驗用ddH20作為陰性對照，讀取實時熒光定量PCR儀系統檢測的每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數，即Ct值； 五、最后，采用geNorm程序計算6個內參基因標準化因子Vn/n+Ι的配對差異分析從而判定最適內參基因的數目，同時，統計分析各內參基因的表達穩定度平均值，即M值，并對其進行排序，M值越小，基因表達越穩定，最終篩選出在綿羊皮膚組織中表達最穩定的內參基因是18S rRNA、β-Actin、GAPDH三個內參基因。
全文摘要
綿羊皮膚組織中內參基因的篩選方法，涉及生物工程技術領域。步驟確定內參基因的方法；取一定量的RNA提取物，用ddH2O稀釋2-10倍；其次，取50ng/μL的RNA樣品作為模板，采用cDNA合成試劑盒進行反轉錄合成cDNA；再次，以反轉錄合成cDNA為模板，分別以6個內參基因為引物；最后，采用geNorm程序計算6個內參基因標準化因子Vn/n+1的配對差異分析從而判定最適內參基因的數目。本發明解決了目前還沒有對中國美利奴羊(新疆型)GAPDH基因作為皮膚組織內參基因篩選方法的問題。本發明利用SYBR Green I特異性與雙鏈DNA結合發出熒光的特性，建立了中國美利奴羊(新疆型)皮膚組織中GAPDH基因的SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK102839215SQ20121033127
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月10日 優先權日2012年9月10日
發明者田可川, 黃錫霞, 田月珍, 徐新明, 狄江, 哈尼克孜·吐拉甫, 吳偉偉, 付雪峰 申請人:新疆維吾爾自治區畜牧科學院畜牧科學研究所