專利名稱：一種含有Thioredoxin蛋白融合標簽的快速克隆及表達載體的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種克隆及蛋白表達質粒載體，即一種含有Thioredoxin蛋白融合標簽的快速克隆及蛋白表達質粒載體。
背景技術：
傳統的克隆方法是通過將質粒載體同目的基因片段分別用相同的雙酶切消化后產生2-4個堿基的粘性末端，利用連接酶將互補的粘性末端進行連接，隨后轉化大腸桿菌細胞，表達純化蛋白。由于粘性末端長度比較短，后續必須通過T4DNA連接酶將載體和目的基因片段進行連接，并且在此過程中可能會有部分載體發生自連接。這種方法克隆基因大約需要兩到三天時間。為了實現不依賴于連接酶的克隆方法，就需要構建一種更加方便有效的克隆載體。而且，目前市場上的商品化載體能夠利用的融合標簽也非常有限，將載體上 設計的將目的蛋白同標簽分離的蛋白酶價格也都比較昂貴。基于上述幾方面的考慮，有必要提供一種帶有常用的融合蛋白標簽的快速克隆及蛋白表達載體。

發明內容
本發明的目的在于提供一種克隆及蛋白表達質粒載體，即一種在N端含有Thioredoxin融合蛋白標簽并且能夠將目的蛋白的基因進行快速克隆及蛋白表達的載體，從而彌補現有技術的不足。本發明的所述的質粒載體，包含有一段含有TEV酶識別位點的，用于編碼Thioredoxin蛋白的基因片段；兩側帶有BsaI酶切位點的GFP基因片段。上述的Thioredoxin蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO: I。上述的兩側帶有BsaI酶切位點的GFP基因片段，其核苷酸序列為SEQ ID NO:2。本發明的載體，還包括有轉錄啟動子、轉錄終止子、卡那霉素編碼序列和復制子片段。本發明的載體，其遺傳圖譜如圖I所示，核苷酸序列為SEQ ID NO: 3。本發明構建的質粒載體用于在大腸桿菌中高效表達重組蛋白。本發明構建的載體可以在不依賴于連接酶的情況下實現目的基因的快速高效克隆及蛋白表達。并且在載體中引入了 Thioredoxin融合蛋白標簽和TEV酶切位點，Thioredoxin融合蛋白標簽幫助增加難溶解蛋白的溶解度,利于蛋白的分離純化；TEV酶識別序列位于Thioredoxin蛋白的基因序列的下游,通過TEV酶對純化的蛋白質進行切割，可以將Thioredoxin蛋白標簽切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最經濟適用的酶，從而極大地節約了實驗成本。


圖I :本發明的質粒載體pJM-Thioredoxin的遺傳圖譜；圖2 :重組蛋白pJM-Thioredoxin的表達純化蛋白圖譜；其中M、PageRuler Prestained Protein Ladder ;1、誘導前 BL21/pJM_Thioredoxin 的總蛋白；2、誘導后經超聲裂解并離心后的上清部分；3、誘導后經超聲裂解并離心后的沉淀部分；4、親和層析流穿液；5、20mM咪唑洗滌液；6、200mM咪唑洗脫液。
具體實施例方式本發明的載體以pET_24d為出發質粒,在構建過程中，分別加入了 Thioredoxin蛋白基因，TEV酶切位點以及GFP基因。在GFP基因兩側各引入了一個BsaI單酶切位點。一方面，通過BsaI單酶切，該載體被線性化并在線性化的片段兩側各產生5'端突出的4個堿基的粘性末端，通過T4DNA Polymerase及dTTP處理后，粘性末端的堿基數各增加至10個和12個，利用該粘性末端，能夠方便快速將的目的基因克隆到該載體上并進行蛋白的表達純化。另一方面，為了更快，更方便的控制克隆質量，在克隆的酶切位點BsaI位點中間插入的GFP基因，在后續篩選陽性克隆的過程中，能夠通過觀察是否產生綠色熒光，來判斷克隆 基因是否插入到載體當中。下面對本發明的載體構建過程及應用進行詳細描述。一、表達質粒載體(pJM-Thioredoxin)的構建第一步，在pET_24d(購買自Novogen公司，編號69772_3)的多克隆位點的N端加上his-Tag-Thioredoxin 標簽及 TEV 酶切位點。首先全序列合成 his-tag-Thioredoxin-TEV,合成時在his-tag-Thioredoxin-TEV核酸序列的兩端分別加上XbaI和NcoI的酶切位點，再連接到克隆載體上(其中his-tag-Thioredoxin-TEV序列為SEQ ID NO: 1)0制備的克隆質粒用XbaI和NcoI雙酶切后得到包含有his-Tag-Thioredoxin標簽的小片段，與pET-24d經過XbaI和NcoI雙酶切處理得到的載體進行連接，通過篩選得到N端帶有his-Tag-Thioredoxin標簽及TEV酶切位點的質粒，暫時命名為pET-24d_Thioredoxin。第二步,將兩個BsaI酶切位點引入上述構建好的質粒pET-24d_Thioredoxin當中，取代其中的多克隆位點。設計引物引物合成時要求5’端經過磷酸化修飾上游引物5 ’ -GGTCTCACCGCGTCGGGTCACCACCACCACCAC-3 ’下游引物5’ -CGGTCTCATGGCGCCCTGAAAATAAAGATTCTC-3 ’以pET-24d_Thioredoxin為模板進行擴增，PCR產物回收純化后利用T4連接酶連接，篩選得到帶有BsaI酶切位點的質粒pET-24d-Thioredoxin_2BsaI。第三步，根據GFP蛋白(SEQ ID NO: 2)的基因序列，合成BsaI-GFP-BsaI的核酸序列到克隆載體上。制備的克隆載體用BsaI酶切處理后得到的包含GFP的片段，與pET-24d-Thioredoxin-2BsaI經過BsaI酶切處理后的載體進行連接，得到最終的質粒pJM-Thioredoxin。制備的質粒pJM-Thioredoxin的遺傳圖譜如圖I所示，其核苷酸序列為SEQ IDN0:3。二、本發明質粒的應用效果檢測本發明提供的質粒載體在其GFP基因外側各包含一個BsaI的酶切位點(黑體表示)，該載體經BsaI單酶切去除GFP基因后，載體被線性化，并且在線性化的片段兩側各產生5’端突出的4個堿基的粘性末端。BsaI酶切后的載體經過TADNApolymerse和dTTP處理，利用TADNApolymerse的3, —5,外切酶活性，可以去除3,端堿基直到遇到T終止，由此質粒載體被線性化并且兩端的粘性末端堿基數目增加至10個和12個。該粘性末端可以在不依賴于連接酶的情況下同互補鏈發生特異性的退火。
權利要求
1.一種克隆及蛋白表達質粒載體，其特征在于所述的質粒載體包含有 O 一段含有TEV酶識別位點的，用于編碼Thioredoxin蛋白的基因片段； 2)兩側帶有BsaI酶切位點的GFP基因片段。
2.如權利要求I所述的載體，其特征更在于所述的編碼Thioredoxin蛋白的基因的核苷酸序列為SEQ ID NO: I。
3.如權利要求I所述的載體，其特征更在于所述的兩側帶有BsaI酶切位點的GFP基因片段，其核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
4.如權利要求I所述的載體，其特征更在于所述的質粒載體還包括有轉錄啟動子、轉錄終止子、卡那霉素編碼序列和復制子片段。
5.權利要求I所述的載體，其遺傳圖譜如圖I所示。
6.權利要求I所述的載體，其核苷酸序列為SEQID N0:3。
7.權利要求I所述的載體用于在原核菌中表達重組蛋白。
全文摘要
本發明涉及一種克隆及蛋白表達質粒載體，包含有一段含有TEV酶識別位點的，用于編碼Thioredoxin蛋白的基因片段和兩側帶有BsaI酶切位點的GFP基因片段。本發明構建的載體可以在不依賴于連接酶的情況下實現目的基因的快速高效克隆及蛋白表達。并且在載體中引入了Thioredoxin融合蛋白標簽和TEV酶切位點，Thioredoxin融合蛋白標簽幫助增加難溶解蛋白的溶解度，利于蛋白的分離純化；TEV酶識別序列位于Thioredoxin蛋白的基因序列的下游，通過TEV酶對純化的蛋白質進行切割，可以將Thioredoxin蛋白標簽切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最經濟適用的酶，從而極大地節約了實驗成本。
文檔編號C12N15/70GK102827862SQ20121033668
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月12日 優先權日2012年9月12日
發明者鄒培建, 蓋園明, 張潔, 秦剛 申請人:天津工業生物技術研究所