專利名稱：一株高效生物絮凝劑產生菌及其篩選方法以及在處理磺胺甲惡唑中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株高效生物絮凝劑產生菌，屬于生物工程、環境工程技術領域，是采用微生物純培養技術從自然環境中篩選出的高效高產量生物絮凝劑產生菌Klebsiellasp.，同時提供這種高效生物絮凝劑產生菌的篩選方法和其在處理磺胺甲惡唑中的應用。
背景技術：
藥品和個人護理品(Pharmaceuticalsand Personal Care Products, PPCPsMt為水生環境的新興污染物已經成為現今很多環境研究的中心。藥物治療和個人衛生的需要導致PPCPs源源不斷地釋放到環境中。雖然知道這些新興的污染物的存在已經幾十年了，然而僅在最近的1(Γ15年內，才研究出檢測PPCPs在環境中的痕量濃度的分析方法。盡 管PPCPs是痕量物質，但是PPCPs呈現的化學持久性和抗微生物性的協同作用，以及PPCPs給水生生物和人類帶來的無法完全定義的不利影響，都引起了人們的廣泛關注。抗生素類藥物磺胺甲惡唑屬于典型的PPCPS，其在污水處理廠中去除比例很低，被頻繁檢出。國內外都對水環境中該類藥品的處理和檢測做了廣泛研究，常用的處理方法主要有高級化學氧化法、吸附法、膜處理技術等。其中利用生物絮凝劑吸附法處理水體中的PPCPs尚未被報道，利用該方法去除水壞境中的磺胺甲惡唑較其他方法有著高效、環保、無二次污染的優勢。因此，從自然界篩選出高效生物絮凝劑產生菌，并將其制成生物菌制劑，應用于此類污染的治理將有著實際的應用價值。

發明內容
本發明的目的是從自然界篩選出高效高產量生物絮凝劑產生菌株
sp.，并將其制成生物菌制劑，為生物絮凝劑的應用提供高效的菌劑，強化去除磺胺甲惡唑的效能。一株高效生物絮凝劑產生菌，其特征在于為克雷伯氏菌MFXsp.)，于2012年06月20日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號CGMCC NO. 6243。菌株克雷伯氏菌MFX0f7￡^sie77a sp.)是從哈爾濱市太平污水處理廠二沉池活性污泥中分離得到，生物絮凝劑產生菌的分離篩選過程均在30 °C條件下進行。首先取15mL活性污泥和若干玻璃珠至已滅菌好的YP液體培養基中，搖瓶培養18 32 h。滅菌條件為112°C，高壓蒸汽滅菌30分鐘。第一個培養周期結束后，將獲得的富集菌液按10%的接種量加入到新鮮的YP液體培養基中繼續搖瓶培養18 32 h，重復上述操作3 4次。將此混合菌液涂布在YP固體培養基上，反復進行平板劃線，固體、液體交替培養，得到純菌落，轉接至絮凝劑液體培養基篩選出一株高效高產量的生物絮凝劑產生菌株WdWJa sp.。具體篩選步驟如下
(I)取15 mL哈爾濱市太平污水處理廠中的新鮮活性污泥加入100 mL YP液體基礎培養基三角瓶中，置于溫度為30 °C，轉速為150 r/min的搖床中培養18 48 h，獲得富集菌液；
(2)取15mL富集菌液加入IOOmLYP液體基礎培養基三角瓶中，重復步驟(I)的培養條件:Γ4次，獲得馴化菌液；
(3)梯度稀釋馴化菌液，稀釋梯度分別為10'10_2、10' 10' 10_5、10_6，分別取100 μ L馴化菌液加入YP固體基礎培養基平板中，涂布法涂勻，置于溫度為30°C的培養箱中，培養18^48 h，獲得單菌落；
(4)利用之字劃線、三區劃線繼續純化所獲得單菌落，YP液體基礎培養基、YP固體基礎培養基交替培養馴化，加速篩菌過程，重復多次操作獲得純菌落；
(5)將純菌落加入100mL絮凝劑液體培養基三角瓶中，置于溫度為30 °C，轉速為150r/min的搖床中培養18 h，獲得種子液；
(6)取10mL種子液置于100 mL絮凝劑液體培養基三角瓶中，置于溫度為30 °C，轉速為150 r/min的搖床中培養24 h，獲得發酵液，測其絮凝率及產率。其中YP液體基礎培養基的組成是5 g蛋白胨、10 g葡萄糖、3 g麥芽膏、3 g酵母膏，溶于1000 mL蒸餾水中；YP固體基礎培養基是在YP液體基礎培養基組份中另加有15^18g瓊脂；絮凝劑液體培養基的組成是10 g葡萄糖，5 g K2HPO4, 2 g KH2PO4,0. 2 gMg(SO4) · 7Η20，0· I g NaCl, O. 5 g 尿素，O. 5 g 酵母膏，pH 7. 2 7. 5。本發明篩選方法的步驟(2)中獲得的馴化菌液OD66tl為I. O，培養基均在112°C下滅菌30 min后使用。菌株sp.發酵生產的生物絮凝劑對藥品和個人護理品中抗生素類藥物磺胺甲惡唑有良好的去除能力，應用在城市給水及污水處理中。本發明采用微生物純培養技術從自然環境中篩選出生物絮凝劑產生菌Klebsiella sp.，實現了生物絮凝劑的制備，為生物絮凝劑的產業化提供了高效產絮菌種，提高了絮凝劑的產量及絮凝效能，解決了生物絮凝劑產量低、人工調控性差及處理底物單一的問題，這種Klebsiella sp.,是高效高產量的發酵生物絮凝劑,在處理磺胺甲惡唑中應用，可有效去除磺胺甲惡唑，降低了生產能耗，對城市污水廠中痕量污染物有良好的去除能力，達到出水水質要求。


圖I是本發明菌株對污染物去除率的影響因素(pH值)。圖2是本發明菌株對污染物去除率的影響因素(絮凝劑投加量)。圖3是本發明菌株對污染物去除率的影響因素(助凝劑投加量)。圖4是本發明菌株對污染物去除率的影響因素(溫度)。圖5是本發明菌株處理磺胺甲惡唑污水的吸附平衡時間。
具體實施例方式實施例I，一株高效生物絮凝劑產生菌，為克雷伯氏菌MFXsp.)，于2012年06月20日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號CGMCC NO. 6243。
其篩選方法為
(1)取15mL哈爾濱市太平污水處理廠中的新鮮活性污泥加入100 mL YP液體基礎培養基三角瓶中，置于溫度為30 °C，轉速為150 r/min的搖床中培養18 48 h，獲得富集菌液；
(2)取15mL富集菌液加入IOOmLYP液體基礎培養基三角瓶中，重復步驟(I)的培養條件:Γ4次，獲得馴化菌液；
(3)梯度稀釋馴化菌液，稀釋梯度分別為10'10_2、10' 10' 10_5、10_6，分別取100 μ L馴化菌液加入YP固體基礎培養基平板中，涂布法涂勻，置于溫度為30°C的培養箱中，培養18^48 h，獲得單菌落；
(4)利用之字劃線、三區劃線繼續純化所獲得單菌落，YP液體基礎培養基、YP固體基礎培養基交替培養馴化，加速篩菌過程，重復多次操作獲得純菌落；·
(5)將純菌落加入100mL絮凝劑液體培養基三角瓶中，置于溫度為30 °C，轉速為150r/min的搖床中培養18 h，獲得種子液；
(6)取10mL種子液置于100 mL絮凝劑液體培養基三角瓶中，置于溫度為30 °C，轉速為150 r/min的搖床中培養24 h，獲得發酵液，測其絮凝率及產率，絮凝率為94. 26%，此時的絮凝劑產量(干重)為4. 5 g/Lo(7)向制備好的發酵液中加入發酵液2倍體積95%的無水乙醇(無水乙醇要在4°C預冷)，攪拌后溶液中出現白色絮體，將白色絮體過濾收集。在過濾后的溶液中，再加入一倍體積95%的無水乙醇，再次提取白色絮體物質。在收集到的絮體中加入少量蒸餾水，使之溶解均勻，于室溫放置20 h，之后放入超低溫冰箱冷凍24 h，再放入凍干機中凍成干粉。其中YP液體基礎培養基的組成是5 g蛋白胨、10 g葡萄糖、3 g麥芽膏、3 g酵母膏，溶于1000 mL蒸餾水中；YP固體基礎培養基是在YP液體基礎培養基組份中另加有15^18g瓊脂；絮凝劑液體培養基的組成是10 g葡萄糖，5 g K2HPO4, 2 g KH2PO4,0. 2 gMg(SO4) · 7Η20，0· I g NaCl, O. 5 g 尿素，O. 5 g 酵母膏，pH 7. 2 7. 5。實施例2，將實施例I中菌種發酵產生的生物絮凝劑干粉溶于蒸餾水，配制成濃度為2g/L水溶液，投入I mg/L磺胺甲惡唑污水中。方法絮凝劑投加量分別為lmL、3mL、5mL、7mL、9mL ;助凝劑 CaCl2 溶液投加量為 O mL、0. 5 mL、l mL、l. 5 mL、2 mL ;pH 值調至 4、5、6、7、8 ;溫度分別設定為5°C，15 °C, 25 °C，35 °C，45 °C，55 °C，搖床轉數為140 r/min，反應0 h、0. 25 h、0. 5 h、0. 75h、l h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h，結果如圖 I-圖 5 所示，最佳去除條件PH值為5，絮凝劑投加量為5 mL，助凝劑投加量為O. 5 mL，絮凝時間為I h，溫度為35 °C。此條件下去除磺胺甲惡唑溶液效果良好，去除率可達67. 82 %。處理含有磺胺甲惡唑實際生活污水，根據單因素試驗初步確定的絮凝條件最佳值，設計L9 (43)正交試驗，優化生物絮凝劑去除磺胺甲惡唑的反應條件。結果如表I所示。PH值5，絮凝劑的投加量為8 mL，助凝劑的投加量為O. 2 mL，絮凝時間I h。通過比較極值得出各因素對去除率的影響度為RA>RB>RC>RD。即pH值的影響度最高，其次為絮凝劑投加量、助凝劑體積量和絮凝時間。經驗證在此條件下生物絮凝劑對生活污水中磺胺甲惡唑的去除率達到53. 27 %。生物絮凝劑產生菌發酵生產的生物絮凝劑對生活污水中磺胺甲惡唑的去除效果的正交試驗結果和直觀分析見表一。
表一正交試驗結果和直觀分析表
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權利要求
1.一株高效生物絮凝劑產生菌，其特征在于為克雷伯氏菌MFX {Klebsiella sp.)，于2012年06月20日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號CGMCC NO. 6243。
2.根據權利要求I所述的高效生物絮凝劑產生菌，其特征在于具體篩選步驟如下 (1)取15mL哈爾濱市太平污水處理廠中的新鮮活性污泥加入100 mL YP液體基礎培養基三角瓶中，置于溫度為30 °C，轉速為150 r/min的搖床中培養18 48 h，獲得富集菌液； (2)取15mL富集菌液加入IOOmLYP液體基礎培養基三角瓶中，重復步驟(I)的培養條件:Γ4次，獲得馴化菌液； (3)梯度稀釋馴化菌液，稀釋梯度分別為10'10_2、10' 10' 10_5、10_6，分別取100 μ L馴化菌液加入YP固體基礎培養基平板中，涂布法涂勻，置于溫度為30°C的培養箱中，培養18^48 h，獲得單菌落； (4)利用之字劃線、三區劃線繼續純化所獲得單菌落，YP液體基礎培養基、YP固體基礎培養基交替培養馴化，加速篩菌過程，重復多次操作獲得純菌落； (5)將純菌落加入100mL絮凝劑液體培養基三角瓶中，置于溫度為30 °C，轉速為150r/min的搖床中培養18 h，獲得種子液； (6)取10mL種子液置于100 mL絮凝劑液體培養基三角瓶中，置于溫度為30 °C，轉速為150 r/min的搖床中培養24 h，獲得發酵液，測其絮凝率及產率； 其中YP液體基礎培養基的組成是5 g蛋白胨、10 g葡萄糖、3 g麥芽膏、3 g酵母膏，溶于1000 mL蒸餾水中；YP固體基礎培養基是在YP液體基礎培養基組份中另加有15 18g瓊脂；絮凝劑液體培養基的組成是10 g葡萄糖，5 g K2HPO4, 2 g KH2PO4,0. 2 g Mg(SO4) ·7Η20，O. I g NaCl, O. 5 g 尿素，O. 5 g 酵母膏，pH 7. 2 7. 5。
3.根據權利要求2所述的高效生物絮凝劑產生菌，其特征在于篩選方法步驟(2)中獲得的馴化菌液OD66tl為I. 0，培養基均在112°C下滅菌30 min后使用。
4.根據權利要求1、2、3之一所述的高效生物絮凝劑產生菌，其特征在于菌株發酵生產的生物絮凝劑對藥品和個人護理品中抗生素類藥物磺胺甲惡唑有良好的去除能力，應用在城市給水及污水處理中。
全文摘要
一株高效生物絮凝劑產生菌，它涉及城市給水、污水處理過程中痕量污染物的去除，解決了生物絮凝劑產量低、人工調控性差及處理底物單一的問題，篩選方法是取哈爾濱城市污水處理廠活性污泥馴化富集生物菌群，搖瓶稀釋培養、平板劃線、分離和純化生物菌種，通過多次重復三區劃線，得到純種生物絮凝劑產生菌株KlebsiellaSp.，該菌株對城市生活污水中的痕量污染物去除率達到67.82%，本發明提高了城市污水中痕量污染物的去除率、降低了生產能耗。
文檔編號C12N1/02GK102876600SQ20121033705
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月13日 優先權日2012年9月13日
發明者馬放, 邢潔, 楊基先, 李昂, 龐長瀧, 吳丹, 魏薇 申請人:哈爾濱工業大學宜興環保研究院