專利名稱：大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別是涉及大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4及其編碼基因與應用。
背景技術：
土壤中的磷素多數以有機態形式存在，且一半以上為植酸及其鹽類，不能被植物直接吸收利用。酸性磷酸酶是一類能夠分解利用土壤有機態磷、釋放無機磷供植物吸收利用的酶類總稱，該酶在植物生長發育過程中具有多種生物學功能，其中以參與植物磷素吸收利用最為重要。因此，挖掘與利用酸性磷酸酶基因，對于分解土壤中的有機態磷、提高植物磷素吸收利用效率、解決當前土壤有效磷供應不足、植物磷素缺乏等問題具有重要的理論和應用價值。 紫色酸性磷酸酶(Purple acid phosphatase, PAP)是一種廣泛存在于動、植物體內的酸性磷酸酶類。根據其蛋白分子量大小，紫色酸性磷酸酶可分為兩個亞家族，即編碼低分子量(約35kD)和編碼聞分子量(約55kD)的紫色酸性磷酸酶。其中，植物低分子量紫色酸性磷酸酶與動物體內的磷酸酶比較相似，而高分子量紫色酸性磷酸酶在植物中占有較大比例。紫色酸性磷酸酶一般具有5個保守基序和7個高度保守的氨基酸殘基(以G/G以XI/GNH (D/E)/VXXH/GHXH:下劃線字體代表保守氨基酸殘基)以及一個金屬離子的雙核中心。動物體內的PAP —般由Fe3+-Fe2+構成雙核金屬中心，而植物體內的PAP —般由Fe3+-Zn2+或Fe3+-Mn2+構成雙核金屬中心。關于紫色酸性磷酸酶基因的克隆與應用研究，目前已有報道。Li等從擬南芥中分離得到29個PAPs基因，半定量PCR分析發現7個PAPs基因可在低磷脅迫下誘導表達；Xiao等克隆了苜蓿中的MtPAPl基因，經轉化擬南芥證明該基因具有分解有機磷的功能。對擬南芥缺AtPAP26突變體的研究結果發現，AtPAP26在擬南芥有機磷利用方面起著重要作用；Wang等將擬南芥AtPAP15轉入大豆，在植酸鹽為唯一磷源條件下，3個轉基因株系磷利用率分別提高117. 8%,56. 5%,57. 8%。Liang等從菜豆中獲得了 PvPAP3基因，Real Time-PCR分析發現,低磷脅迫下,該基因在憐聞效品種G19833的表達聞于憐低效品種D0R364。由此可見，擬南介、首猜、采 等植物中的紫色酸性磷酸酶基因具有活化植株根際周圍土壤中的有機態磷、促進植株體內磷素再循環利用的功能。然而，關于大豆中的紫色酸性磷酸酶基因的克隆以及根際周圍有機磷利用研究，目前報道甚少。

發明內容
本發明目的是提供一種大豆紫色酸性磷酸酶及其編碼基因，用于活化植株根際周圍土壤中的有機態磷、促進植株體內磷素再循環利用。本發明另一目的是提供含有上述基因的載體。
本發明又一目的是提供含有上述基因或載體的宿主細胞。本發明再一目的是提供大豆紫色酸性磷酸酶及其編碼基因在提高植株植酸磷利用率中的應用。大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4基因的 開放閱讀框(ORF)序列，如SEQ ID NO. I所示，長度為1329bp。大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4編碼的蛋白序列，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示或該序列經替換一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，SEQIDNO. 2長度為442個氨基酸殘基。應當理解，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區在不影響蛋白表達的條件下，對編碼上述蛋白的基因序列進行修改。因此，本發明還包含對編碼上述蛋白的基因序列進行的替換、添加和/或缺失一個或多個核苷酸，具有與上述編碼基因相同功能的核苷酸序列。本發明還包括基于所述基因的正義序列或反義序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達載體、含有所述載體的宿主細胞，利用所述宿主細胞制備大豆紫色酸性磷酸酶的方法等。所述該序列經替換一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，是指該序列的活性功能域之外的位點進行有限氨基酸的保護替換所得的序列仍能保持原來的活性。本發明氨基酸序列的活性功能域為135 430位，在此位點外可替換一個或幾個氨基酸得到具有同等功能的氨基酸序列。比如，在非活性區段，將第123位的Ala替換為Val，或是將第440位的Leu替換為Thr，且具有同樣的功能效果。本發明以磷高效大豆品種“中黃15”為材料，以擬南芥AtPAP15序列為基礎，利用同源基因克隆技術，分離得到大豆中的紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4的開放閱讀框(ORF)序列。采用熒光實時定量PCR技術，檢測GmPAP4基因在磷高效(中黃15)與磷低效(牛毛黃)大豆品種中的差異表達，結果發現，在植酸鹽為唯一磷源條件下，植酸磷處理15cT70d，GmPAP4基因在磷高效大豆品種(中黃15)中的表達量遠遠高于磷低效品種(牛毛黃)中的表達量，且最大差異可達8倍(植酸磷處理56cT63d)。在此基礎上，通過原核表達載體的構建，實現了 GmPAP4基因在大腸桿菌BL21中的原核表達，利用His標簽，分離純化得到了誘導表達后的GmPAP4編碼蛋白；經酶活檢測分析發現，GmPAP4編碼蛋白具有酸性磷酸酶活性，且以pH=5. O時的酸性磷酸酶活性最高。同時通過構建GmPAP4的GFP融合表達載體，采用基因槍轟擊技術將構建的pCamE_GmPAP4: :GFP融合基因導入洋蔥內表皮細胞，利用熒光顯微鏡觀察該融合基因所表達蛋白在洋蔥內表皮細胞中的分布情況，結果顯示轉化PCamE-GmPAP4: :GFP質粒的洋蔥內表皮細胞的細胞膜部位有明顯的熒光，說明GmPAP4編碼蛋白主要分布于細胞膜。利用所構建完成的GmPAP4基因的植物超表達載體pCamE-GmPAP4,采用農桿菌介導轉化技術轉入Columbia型擬南芥中，經轉基因擬南芥的植酸磷分解利用試驗證明，GmPAP4具有分解植株根際周圍植酸態磷、提高植酸磷利用效率的功能。本發明的有益效果(I)本發明首次發現了大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4及其編碼基因，為提高植株植酸磷利用率提供了新的候選基因。(2)本發明大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4的開放閱讀框及其編碼蛋白能分解利用植株根際周圍植酸態磷、提高轉基因擬南芥植酸磷利用效率，可利用基因工程手段進一步提高植株植酸磷利用效率。


圖I是“中黃15 ”低磷處理GmPAP4基因cDNA的PCR擴增的結果圖；其中M為DNAMarker DL 2000 ;1為“中黃15”低磷處理cDNA的PCR擴增結果。圖2是植酸磷處理下GmPAP4基因在“中黃15”與“牛毛黃”根系中的差異表達結果圖；其中，橫坐標表示植酸磷處理的天數，縱坐標表示GmPAP4在“中黃15”與“牛毛黃”根系表達量的比值。圖3是GmPAP4基因原核表達蛋白的SDS-PAGE電泳檢測結果；對pET32a_GmPAP4質粒轉化的BL21受體菌株進行誘導表達試驗，其中箭頭所示為表達目的片段61. 2KDa ;皿是蛋白標準分子量；1為不含重組質粒的空菌株；2為含有空載質粒的菌株；3為含有目的基因GmPAP4的菌株；4為分離純化獲得的GmPAP4特異蛋白。
圖4是GmPAP4基因編碼蛋白的酸性磷酸酶活性檢測結果圖；其中，pET_32a為空載體，GmPAP4為重組質粒。圖5是GmPAP4基因編碼蛋白在不同pH條件下的酸性磷酸酶活性檢測結果圖。圖6是GmPAP4編碼蛋白的洋蔥表皮亞細胞定位觀察結果；其中，A圖紫外光激發下的空載體PCamE-GFP轉化洋蔥細胞的熒光觀察結果；B圖紫外光激發下的重組質粒pCamE-GmPAP4: :GFP轉化洋蔥細胞的熒光觀察結果。圖7是T3代轉基因擬南芥目的基因GmPAP4的PCR檢測結果圖；其中，1_9為T3轉基因擬南芥植株，5-9為篩選得到的含有目的基因的擬南芥陽性植株，M是DNA MarkerDL2000,10為野生型對照，11為空白對照，12為質粒陽性對照。圖8是T3轉GmPAP4基因擬南芥的RT-PCR檢測結果圖；其中，M為DNA MarkerDL2000 ；Γ4為T3代轉基因擬南芥；5為野生型對照；6為空白對照；7為質粒陽性對照。圖9是在植酸磷和適磷2種處理下，T3超表達轉GmPAP4基因擬南芥的生長情況；其中，+Pi為適磷處理，+Po為植酸磷處理；WT為野生型，G4為T3代擬南芥。圖10是T3超表達轉GmPAP4基因擬南芥與野生型植株地上部生物重比較結果圖；其中，+Pi為適磷處理，+Po為植酸磷處理；WT為野生型，G4為T3代擬南芥。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例lGmPAP4基因的分子克隆(I)大豆幼苗培養與缺磷處理選取飽滿、整齊一致大豆品種“中黃15”種子，催芽后選擇出芽一致的材料播種于石英砂中，7d后移至營養液中，待對生真葉展開后，進行缺磷脅迫(Ommol/L)處理,對照磷處理濃度為I. Ommol/L。在磷脅迫處理21d后取植株根系,液氮速凍后，_80°C超低溫冰箱保存待用。(2)實時定量PCR分析所用材料處理選取飽滿整齊一致的大豆品種“中黃15”和“牛毛黃”種子(購自中國農業科學院國家大豆種質資源庫)，播種于蛭石。出苗7d后取植株根系作為對照(記為Od)，然后設置2個不同磷處理組(適磷、植酸磷，磷濃度均為I. Ommol/L),隨后在磷處理7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d、63d、70d，分別取植株根系樣品，液氮速凍，_80°C超低溫冰箱保存待用。(3)總RNA提取大豆植株總RNA(缺磷、適磷、植酸磷處理)提取參照TRNzol TotalRNA Reagent操作指南進行。(4) cDNA反轉錄合成植株總RNA經反轉錄后獲得cDNA，合成過程參照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 操·作指南進行。(5)PCR擴增所用引物的設計利用AtPAP15序列，在NCBI網站比對大豆EST，通過電子克隆技術拼接得到目的基因的電子序列。依據該電子序列設計引物，序列如下Fl :5，-GGTACCATGGAACTCAAACAACAAAAACTCC-3’Rl :5’ -CTCGAGTTAGGGCGTCAAAAGTGTACTTCTG-3’(6)GmPAP4基因開放閱讀框(ORF)的分子克隆利用所設計的Fl與Rl引物，以缺磷處理下的反轉錄cDNA為模板進行PCR擴增，克隆GmPAP4基因的開放閱讀框序列。PCR反
應體系及程序如下
中黃 15 cDNA1.0 μ
IOxPCR buffer (含Mg2 )2.0 μL
2.5 mM dNTPs2.0 μL
Ex Taq DNA polymerase ( 2.5 /μ .,)0.2 μL
Fl (5 μΜ)1.0 pL
Rl (5 μΜ)1.0
CidH2O12.8 μ PCR 程序95 °C IOmin
94 Γ45 s λ
58 0C45 s >- 35 cycles
72 V90s -72 °C IOminIO0C holdPCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，并連接于pGM-Τ載體。反應體系為 10 X Ligation Buffer I μ L, pGM~T Vector I μ L, PCR Product 7 μ L, T4DNA LigaseI μ L，混勻后16°C連接過夜。電泳結果如圖I所示，I泳道獲得約I. 3kb左右的一條特異條帶。(7)轉化大腸桿菌，獲得陽性克隆連接產物采用熱擊法轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性克隆，進行質粒提取，酶切檢測和測序，獲得GmPAP4基因的開放閱讀框序列見SEQ ID NO. I (長 1329bp)。實施例2GmPAP4基因在不同大豆品種中的差異表達分析以GmPAP4為目標基因，大豆組成型表達Actinll基因為內參對照，設計Realtime-PCR引物F2和R2，采用SYBRuiGreen I熒光染料法進行熒光實時定量PCR，通過比較Ct進行GmPAP4基因表達水平的相對定量分析。F2 :5， -CGACCTCTTCCTCGTAAAACC-3’R2 :5’ -GTGCTTGTCTCCTGCCAAAG-3’GmPAP4基因在不同大豆品種根系中的相對表達量=2_ΛΛετ，Δ Δ Ct= (CtGmPAP4- Ctactinll)中黃15根系-(CtGmPAP4-Ctaetinll)牛毛黃根系，結果如圖2所示，植酸磷處理I5cT7Od, GmPAP4基因在“中黃15”根系的表達量遠遠高于“牛毛黃”中的表達量，且在植酸磷處理56飛3d時，GmPAP4在“中黃15”根系的表達量為“牛毛黃”根系中表達量的8倍。實施例3GmPAP4基因的原核表達(I)將重組質粒pGM-GmPAP4和原核表達載體pET_32a (+)采用KpnI/XhoI雙酶切，并回收目的片段，將回收后的pET-32a(+)表達載體與GmPAP4酶切片段進行連接。酶切反應體系為 KpnI I μ L，XhoI I μ L, IOXL Buffer 2 μ LjH2O 11 μ L，Plasmid 5 μ L。連接反應體系為 GmPAP4Fragment 5 μ L, pET_32a (+) Vector I μ L, T4DNA Ligase I μ L, 10 X LigationBuffer I μ L, ddH20 2 μ L,混勻后 16°C連接過夜。(2)融合重組蛋白的誘導表達將上述連接產物轉化大腸桿菌DH5a，經PCR和酶切檢測，將陽性克隆的質粒轉化大腸桿菌BL21菌株，挑取陽性克隆，經質粒提取、酶切檢測、測序鑒定，得到含有GmPAP4基因正確編碼序列的陽性克隆。(3) SDS-PAGE蛋白電泳分析利用O. 8mmol/L IPTG誘導表達轉有原核表達載體的BL21菌株，分別收集誘導前、誘導后12h的菌液。將收集的菌液離心后，倒出液體，分別加入200 μ L上樣緩沖液，振蕩混勻后，置于沸水中10分鐘，瞬離；分別配置12%的分離膠，5%的濃縮膠。各取30 μ L樣品上樣；濃縮膠部分以80V恒壓，分離膠部分以120V恒壓電泳。SDS-PAGE電泳圖如圖3所示，經IPTG誘導，重組質粒在大約61. 2KDa的位置上出現了特異條帶，與預期的表達目標蛋白大小一致。其中，pET-32a(+)載體本底表達20. 4KDa蛋白；GmPAP4基因去除信號肽為1182bp，編碼393個氨基酸，表達理論上為40. 8KDa的蛋白，二者共為61. 2KDa。實施例4GmPAP4基因編碼蛋白的純化與酸性磷酸酶活性檢測(l)GmPAP4基因編碼蛋白的分離與純化按照Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒的操作指南進行。(2) GmPAP4基因編碼蛋白的酸性磷酸酶活性檢測首先配制對硝基酚(P -NP)的標準溶液，在405nm波長下比色測定吸光值，以對硝基酚含量為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。然后以0-冊？為底物，反應體系包括10臟01/1 MgCl2,10mmol/L P-NPP，50mmol/L乙酸鈉-乙酸緩沖液和20 μ L GmPAP4,反應總體積I. 5mL, 37°C水浴，反應30min，加入0. 5mL lmol/L NaOH溶液終止反應,測定405nm下的吸光值,根據標準曲線計算反應產生的P -NP的量，計算GmPAP4的相對活性。結果如圖4所示，與對照(pET_32a)相比，重組質粒pET32a-GmPAP4的酸性磷酸酶活性提高了 40%，差異達到極顯著水平，說明目標蛋白GmPAP4可以分解反應底物P -NPP，具有酸性磷酸酶的活性。
(3)GmPAP4基因編碼蛋白在不同pH條件的酸性磷酸酶活性檢測反應體系分別選用不同的緩沖液，pH值3. 5 5. 5為50mmol/L乙酸鈉·乙酸緩沖液，pH值6. 0^7. O為50mmol/LTris ·乙酸緩沖液，pH值7. 5^9. O為50mmol/LTris -HCl緩沖液；其余方法步驟與GmPAP4編碼蛋白酸性磷酸酶活性檢測基本相同。結果如圖5所示，通過分析7個不同pH條件下的GmPAP4蛋白的酸性磷酸酶活性，結果發現，GmPAP4蛋白在pH=5. O的條件下酸性磷酸酶活性最高，符合酸性磷酸酶的特征。實施例5GmPAP4編碼蛋白的亞細胞定位分析(I)PCR所用引物的設計利用生物軟件DNAMAN設計一對PCR引物，擴增GmPAP4去除終止密碼子后的開放閱讀框，進行編碼蛋白的亞細胞定位，引物序列如下F3 :5，-GTCGACATGGAACTCAAACAACAAAAACTC-3，，R3 :5’-GGTACCGGGCGTCAAAAGTGTACTTC-3’ ，(2)亞細胞定位所需開放閱讀框的擴增以pGM_GmPAP4質粒為模板，利用F3和R3引物，擴增不含終止密碼子的GmPAP4基因開放閱讀框序列，電泳檢測后切膠回收目的條帶，與pGM-Τ載體連接，藍白斑篩選，測序，挑選出開放閱讀框序列無誤的陽性克隆PGM-PAP4用于后續試驗。(3)融合表達載體的構建將中間載體PGM-PAP4和GFP融合表達載體pCamE_GFP分別用SalI和KpnI雙酶切。回收酶切產物，與載體pCamE_GFP進行連接。酶切反應體系為 SalI I μ L，KpnI I μ L, IOXMBuffer 2 μ L, H2O 6 μ L, Plasmid 10 μ L。連接體系為 PAP4 Fragment 5 μ L, pCamE-GFP Vector I μ L, T4 DNA Ligase I μ L,10 X LigationBufferl μ L7H2O 2 μ L，混勻后16°C連接過夜。連接產物采用熱擊法轉化大腸桿菌感受態細胞。挑取陽性克隆，進行質粒提取，酶切檢測和測序，獲得用于亞細胞定位的融合表達載體pCamE-GmPAP4: :GFP。pCamE_GFP 與專利 CN 101942426B 中表達載體 pCamE_GFP 相同。(4)融合表達載體PCamE-GmPAP4: :GFP基因槍轉化采用基因槍轟擊技術將融合表達載體pCamE-GmPAP4: :GFP轉化洋蔥內表皮細胞，轉化步驟按照基因槍操作說明書進行，對照組為空載體pCamE-GFP。(5)熒光顯微鏡觀察基因槍轟擊后的洋蔥內表皮細胞置于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光在細胞內的分布情況。結果如圖6所示，結果顯示轉化PCamE-GmPAP4: :GFP質粒的洋蔥內表皮細胞的細胞膜部位有明顯的熒光，由此可知GmPAP4編碼蛋白主要分布于植物細胞膜。實施例6GmPAP4基因表達蛋白的功能分析 (I) GmPAP4基因的植物超表達載體pCamE_GmPAP4的構建將pGM_GmPAP4和PCamE質粒采用Sal I /Kpn I雙酶切，回收酶切產物，進行連接。酶切反應體系為SalII μ L，KpnI I μ L, IOXM Buffer 2 μ L, BSA 2 μ L, H2O 6 μ L, Plasmid 8yL。連接體系為GmPAP4Fragment5μ L，pCamE Vector I μ L，T4DNA Ligase I μ L，10XLigation BufferluL, ddH20 2 μ L，混勻后16°C連接過夜。將連接產物轉化大腸桿菌DH5a，經PCR和酶切雙重檢測，得到陽性克隆進行測序，得到測序正確的超表達載體進行后續試驗。(2)農桿菌介導法侵染擬南芥采用浸花法(Floral dip)將攜帶有pCamE_GmPAP4的農桿菌轉入Columbia型擬南芥中。PCR檢測目的基因GmPAP4，結果如圖7所示。(3)轉基因擬南芥的植酸磷利用分析選取4個T3轉基因擬南芥株系和野生型對照為材料；每個材料分別種30盆，I株/盆，進行2種磷處理(植酸磷處理、適磷處理，濃度均為I. Ommol/L)。以植酸磷處理下的T3轉基因擬南芥的目的基因GmPAP4cDNA為模板，進行RT-PCR擴增，所用引物為PCamE-GmPAP4載體上的潮霉素引物，引物序列為F4 5’-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC-3’ ；R4 :5’-ATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3';擴增長度為 1026bp，結果如圖8所示，可見擴增出目的條帶。在植株生長期間，觀察擬南芥植株在2種磷處理下的生長情況，并稱量地上部生物重，進行植酸磷利用分析。擬南芥生長情況如圖9所示，植酸磷處理下，與野生型相比，T3代轉基因擬南芥植株表現出植株葉片較大、葉柄較長、葉色發綠、生長勢強等特點，而野生型對照則表現出葉片較小、葉柄較短、葉色發紫、生長勢弱的缺磷癥狀，表明T3代轉基因擬南芥植株可以分解利用根際周圍的植酸憐、GmPAP4具有提聞轉基因擬南芥在植酸憐條件下的耐低磷能力的作用。進一步測定T3代轉基因擬南芥植株與野生型的地上部生物重，結果如圖10所示，適磷條件下的轉基因擬南芥與野生型對照生物重沒有顯著差異；而植酸磷條件下的轉 GmPAP4擬南芥地上部生物重與野生型相比，則提高39. 3%，差異達到極顯著水平；說明T3代轉基因擬南芥植株可以分解利用根際周圍的植酸磷、因而受到低磷影響較小，具有較高的生物重；而野生型植株則受到低磷影響較大，具有較低的生物重，GmPAP4具有提高轉基因擬南芥在植酸磷條件下的耐低磷能力的作用。結論大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4基因所表達的蛋白具有分解植株根際周圍植酸磷、提高轉基因擬南芥植酸磷利用效率的功能。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種大豆紫色酸性磷酸酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO. 2衍生的氨基酸序列。
2.編碼權利要求I所述大豆紫色酸性磷酸酶的基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No. I。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求2或3所述基因或權利要求4所述載體的宿主細胞。
6.權利要求I所述大豆紫色酸性磷酸酶、權利要求2或3所述基因在提高植物植酸磷利用率中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4及其編碼基因與應用。所述大豆紫色酸性磷酸酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO.2衍生的氨基酸序列。大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本發明首次發現了大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4及其編碼基因，為提高植株植酸磷利用率提供了新的候選基因，可利用基因工程手段進一步提高植株植酸磷利用率。
文檔編號C12N1/19GK102876641SQ20121033683
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月12日 優先權日2012年9月12日
發明者張彩英, 李喜煥, 孔佑賓, 常文鎖, 李文龍 申請人:河北農業大學