專利名稱：一種難溶于水的三維絲素蛋白支架及其制備與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種三維絲素蛋白支架及其制備方法，特別涉及一種難溶于水的三維絲素蛋白支架及其制備方法與應用。
背景技術：
蠶絲是強度最好的天然纖維之一，由7(Γ80%的絲素蛋白和2(Γ30%的絲膠蛋白組成。絲素蛋白的氨基酸序列主要由“甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸一甘氨酸-絲氨酸”(GAGAGS)的重復單元構成，其中甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸占總氨基酸含量的85%以上。該重復序列絕大多數位于絲素蛋白的結晶區，并自組裝成反向平行折疊鏈構象(anti-parallel β -sheet)結構。這些結構賦予絲素蛋白具有良好力學和緩慢降解速率的 特性。絲膠蛋白在體內會引起炎癥反應,在使用前需要需進行脫膠處理(degummed)。絲素蛋白由分子量為325KD和25KD兩種蛋白組成，其降解產物為氨基酸。大量的研究表明絲素蛋白具有良好的生物相容性，其體內炎癥反應(inflammatory responses)要遠低于膠原和聚乳酸等常用生物材料。絲素蛋白纖維作為外科縫線已有悠久的歷史，經編織后作為人工韌帶和組織補片已在研究領域應用。但在目前的生物材料研究領域應用更多的是再生型絲素蛋白。即絲素蛋白經過脫膠、溶解、提純后，再通過物理、化學的方法，形成海綿狀、膜狀、凝膠狀、微球狀等形態。在絲素蛋白多孔支架制備方面，中國發明專利“絲素蛋白海綿狀三維多孔材料制備方法”(CN 1262579C)中，在絲素蛋白溶液中加入醇類有機溶劑作為變性劑，經冷凍和解凍獲得乳白色多孔材料，材料經醇類溶液浸洗，再冷凍、干燥獲得所需材料。中國發明專利“一種絲素蛋白微孔支架的制備方法”(CN 102133432A)中，將絲素蛋白溶液與有機溶劑混合，注入模具內，獲得絲素蛋白凝膠，用熱水洗去凝膠中的有機溶劑，再冷凍干燥獲得所述支架。中國發明專利“一種多孔蠶絲絲素蛋白材料的制備方法”(CN 101864177A)中，將絲素蛋白溶液與促凝膠劑(羧酸、聚乙二醇)混合，獲得凝膠，在熱干燥法獲得支架。中國發明專利“一種難溶于水的絲素蛋白多孔材料及其制備方法”(CN 101857729A)中，將絲素蛋白溶液與鹽溶液混合，經冷凍干燥、濕熱蒸汽處理、水洗等步驟獲得所需的支架。中國發明專利“一種醫用微孔海綿及其制備方法”(CN 101967254A)中，將絲素蛋白溶液與PVA溶液混合，在緩慢加熱過程中加入甲醛水溶液，固化成型、脫模洗滌、冷凍干燥得所述支架。中國發明專利“一種三維絲素蛋白多孔支架材料的制備方法”(CN101596327A)中，在攪拌狀態的絲素蛋白溶液中加入氯化鈉顆粒，靜置后取沉淀部分，經模具內壓縮成型、烘干、浸洗步驟獲得所述支架。現有絲素蛋白海綿狀支架的制備方法，基本使用了變性、促凝、交聯劑等，這些添加劑在后續的步驟中洗去，或者成為支架的一部分。以氯化鈉顆粒作為變性和成孔方式為例，形成的絲素蛋白凝膠沉積在氯化鈉顆粒的間隙，由于間隙的不均一性，導致多孔支架孔壁厚度的不均一性，從幾微米到幾百微米不等，形成的絲素蛋白支架力學較高，降解速率緩慢，但完全洗去支架中少許被絲素蛋白完全包裹的氯化鈉微粒并不容易。那么制備厚度為納米級孔壁、微米級孔徑、分布均勻的絲素蛋白海綿，將有良好的應用前景。針對上述問題，本發明專利期望通過最簡單和最經濟的工藝，獲得一種難溶于水的三維絲素蛋白支架。

發明內容
本發明目的是提供一種難溶于水的三維絲素蛋白支架及其制備方法，制備工藝過程中不接觸有毒物質，制備工藝簡單，利于大量生產，容易控制支架的整體外形和支架內部的孔隙率、孔徑參數，進而產生不同的物理和生物學性能，滿足不同用途的需要；該支架的孔壁的厚度為納米級，孔徑大小為微米級，高孔隙率，孔間互通；該支架在37°C生理鹽水中的溶失率小于1% ;該支架在體外作為三維細胞培養支架、三維質粒轉染載體，在體內組織工程領域作為軟骨支架、脂肪支架、骨支架、肌肉支架等將有巨大應用前景。本發明采用的技術方案是一種難溶于水的三維絲素蛋白支架，所述支架按如下方法制備(1)以桑蠶蠶絲為原料，經脫膠、溶解、透析，獲得截留液a，將截留液a或截留液a的濃縮液過濾或離心，取濾液或上層離心液得到絲素蛋白溶液；(2)將步驟(I)得到的絲素蛋白溶液的質量濃度用水調整至O.廣30%，倒入模具(所述模具可以為各種形狀、各種材質的模具，對模具的表面平整度及光滑度沒有要求，通常采用塑料材質的方形皿、圓形皿、孔板或管狀容器)內，模具于-1(T-80°C冷凍2 40h，再在-4(T-110°C條件下真空冷凍干燥l(T72h，在模具內形成三維絲素蛋白支架；(3)將模具在溫度5(TlO(rC，相對濕度7(Γ100%條件下放置2(T200min進行濕熱交聯，再在2(T60°C烘干2(Tl20min或在-4(T-110°C冷凍干燥5 12h，去除模具，獲得難溶于水的三維絲素蛋白支架。進一步，步驟(2)所述模具在-2(T-50°C冷凍5 15h，再在-6(T-110°C條件下真空冷凍干燥16 48h，在模具內形成三維絲素蛋白支架。進一步，步驟(2)所述模具內加入的絲素蛋白溶液體積量為10(T20000ml/m2模具。進一步，步驟(3)所述模具在溫度65 70°C，相對濕度8(Γ90%條件下放置10(Tl20min進行濕熱交聯。進一步，步驟(I)所述截留液a的濃縮液通過下述兩種濃縮方法之一獲得(a)反滲透法將透析后的透析袋放入質量濃度2(Γ60%的聚乙二醇水溶液中，靜置20h進行濃縮，獲得截留液a的濃縮液；所述聚乙二醇平均分子量100(T10000 ； (b)溶劑揮發法將截留液a在敞口容器內，于溫度1(T60°C，相對濕度1(Γ60%的環境中靜置2 30h，獲得截留液a的濃縮液。進一步，步驟(I)所述截留液a或截留液a的濃縮液過濾或離心方法為下列之一
a)將截留液a或截留液a的濃縮液于4°C、300(T6000g條件下離心5 20min，棄去沉淀，取上層溶液即為所述的絲素蛋白溶液；b)將截留液a或截留液a的濃縮液用孔徑為2 20 μ m的濾器過濾，去除不溶性顆粒，濾液即為所述的絲素蛋白溶液。進一步，步驟(I)所述脫膠、溶解、透析方法為a)脫膠將IOOg桑蠶蠶絲放入4 8L的2M碳酸鈉水溶液中，9(Tl00°C水浴2(T60min，純水清洗，該過程重復3次，脫去絲膠蛋白，留下絲素蛋白，將絲素蛋白在2(T60°C烘干，獲得干燥后的絲素蛋白；b)溶解將上述干燥后的絲素蛋白溶于9 11M的溴化鋰水溶液中，55飛5°C水浴3(T300min至絲素蛋白充分溶解，獲得含絲素蛋白的混合液；所述干燥后的絲素蛋白與溴化鋰水溶液的質量體積比為O. Γ0. 2:1 ；c)透析將含絲素蛋白的混合液用截留分子量100(Γ20000道爾頓的透析袋進行透析，用10倍混合液體積的無菌去離子水作為透析液在3天透析1(Γ12次，去除溶液中的溴化鋰成分，獲得截留液a。
本發明所述難溶于水的三維絲素蛋白支架應用于體外三維細胞培養載體或三維質粒轉染載體，或者所述難溶于水的三維絲素蛋白支架應用于體內組織工程領域的軟骨支架、脂肪支架、骨支架或肌肉支架等，將有巨大應用前景。本發明所述難溶于水的三維絲素蛋白支架，支架的孔隙率、孔徑、孔壁厚度等參數主要取決于所用的絲素蛋白溶液濃度，這些參數也受冷凍的溫度和冷凍程序的影響。大致趨勢是絲素蛋白溶液的濃度越高，獲得支架的孔徑越小，孔隙率越低，孔壁越厚。緩慢的冷凍過程將獲得更均一的內部結構。模具的形狀將直接影響支架的整體外形，支架脫模后，仍可以按照切割成需要的形狀。本發明所述截留液a和截留液a的濃縮液均為不同濃度的絲素蛋白溶液，為便于表述而命名，字母本身沒有含義。與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在本發明目的是提供一種難溶于水的三維絲素蛋白支架及制備方法和應用，制備工藝中不接觸有毒物質，未使用變性、促凝和交聯等添加劑，制備工藝簡單，利于大量生產；該支架以絲素蛋白為原料，現有的研究表明絲素蛋白及其降解產物(氨基酸)擁有良好的生物相容性；該支架為納米級孔壁微米級孔徑，在體外應用方面可以作為三維細胞培養載體，利于細胞的生物學研究和擴增，亦可作為三維質粒轉染的載體，提高質粒轉染效率；在體內應用方面可以作為軟骨支架、脂肪支架、骨支架和肌肉支架，具有巨大應用前景。


圖I實施例2制備的難溶于水的三維絲素蛋白支架的電鏡掃描圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例I (絲素蛋白濃度30%)(I)絲素蛋白溶液的制備a)脫膠將IOOg桑蠶蠶絲(浙江華芝絲綢有限責任公司，5A級)放入5L的2M碳酸鈉水溶液中，98°C水浴30min，純水清洗，該過程重復3次，脫去絲膠蛋白，留下絲素蛋白，將絲素蛋白在50°C烘干，獲得70g干燥后的絲素蛋白，備用；b)溶解將上述干燥后的絲素蛋白以質量體積比O. 2 :1溶于9. 3M的溴化鋰(LiBr)水溶液中，60°C水浴90min至絲素蛋白充分溶解，獲得含絲素蛋白和少量不溶性顆粒組成的混合液；c)透析將混合液用再生纖維素透析袋(截留分子量4000道爾頓)透析，用10倍混合液體積的無菌純水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr離子，獲得截留液a ；d)濃縮將透析后的透析袋放入5倍體積的質量濃度50%聚乙二醇(PEG，分子量7000)水溶液，室溫靜置濃縮8h，取截留液b，即獲得截留液a的濃縮液；e)將截留液b在水平轉子5000g，4°C，離心lOmin，除去底部的未溶解絲素蛋白和溴化鋰中可能存在不溶性顆粒，取上清液，即獲得提純后的絲素蛋白溶液300ml ；f)濃度測定取提純后的絲素蛋白溶液10ml，在平皿內烘干，質量差法測得絲素蛋白溶液質量濃度為30%。絲素蛋白溶液4°C保存備用。(2)用純化水將質量濃度30%的絲素蛋白溶液的濃度調整至20% (先量取30%絲素蛋白溶液在60°C烘干至恒重測量絲素蛋白溶液的含水量，進而計算將其濃度調整至20%時所需的純化水量)。在模具(24孔板)內加入質量濃度20%的絲素蛋白溶液，每孔I. 5ml,在溫度_20°C，靜置冷凍10h，再在-80°C，靜置冷凍20h，將模具在_80°C冷阱的真空冷凍干燥系統內干燥30h，在模具內形成三維絲素蛋白支架；(3)將模具在 溫度70V，相對濕度90%條件下放置150min進行濕熱交聯，然后在50°C鼓風干燥箱內干燥lOOmin，去除模具，獲得難溶于水的三維絲素蛋白支架。實施例2 (絲素蛋白溶液濃度5%)(I)絲素蛋白溶液的制備a)脫膠將IOOg桑蠶蠶絲(浙江華芝絲綢有限責任公司，5A級)放入5L的2M碳酸鈉水溶液中，98°C水浴30min，純水清洗，該過程重復3次，脫去絲膠蛋白，留下絲素蛋白，將絲素蛋白在50°C烘干，獲得70g干燥后的絲素蛋白，備用；b)溶解將上述干燥后的絲素蛋白以質量體積比O. 2 :1溶于9. 3M的溴化鋰(LiBr)水溶液中，60°C水浴90min至絲素蛋白充分溶解，獲得含絲素蛋白和少量不溶性顆粒組成的混合液；c)透析將混合液用再生纖維素透析袋(截留分子量4000道爾頓)透析，用10倍混合液體積的無菌純水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr離子，獲得截留液a ;d)將截留液b在水平轉子5000g，4°C，離心lOmin，除去底部的未溶解絲素蛋白和溴化鋰中可能存在不溶性顆粒，取上清液，即獲得提純后的絲素蛋白溶液IlOOml ;e)濃度測定取提純后的絲素蛋白溶液10ml，在平皿內烘干，質量差法測得絲素蛋白溶液質量濃度為4%。f)濃縮將敞口容器稱重，倒入質量濃度為4%的絲素蛋白溶液，于溫度50°C鼓風干燥箱內干燥5h，再次稱重測算濃縮后絲素蛋白溶液的濃度為12%，絲素蛋白溶液4°C保存備用。(2)將絲素蛋白溶液用純化水濃度調整為5%，在模具(24孔板)內加入質量濃度5%的絲素蛋白溶液，每孔I. 5ml，在溫度-20°C，靜置冷凍10h，再在_40°C，靜置冷凍20h，其它操作同實施例1，獲得難溶于水的三維絲素蛋白支架，掃描電鏡圖見圖I所示。實施例3 (絲素蛋白溶液濃度1%)(I)絲素蛋白溶液的制備a)脫膠將IOOg桑蠶蠶絲(浙江華芝絲綢有限責任公司，5A級)放入5L的2M碳酸鈉水溶液中，98°C水浴30min，去離子水清洗，該過程重復3次，脫去絲膠蛋白，留下絲素蛋白，將絲素蛋白在50°C烘干，獲得70g干燥后的絲素蛋白，備用；
b)溶解將絲素蛋白以質量體積比0. 20 1溶于9. 3M的溴化鋰(LiBr)水溶液中，60°C水浴90min至絲素蛋白充分溶解，獲得含絲素蛋白和少量不溶性顆粒組成的混合液；c)透析將混合液用再生纖維素透析袋(截留分子量2000道爾頓)透析，用10倍混合液體積的無菌去離子水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr離子，獲得截留液a ；d)將截留液a用孔徑IOym的濾器，除去底部的不溶性顆粒，取濾液即獲得提純后的絲素蛋白溶液1200ml ;e)濃度測定取提純后的絲素蛋白溶液10ml，在平皿內烘干，質量差法測得絲素蛋白溶液的質量濃度為4%。絲素蛋白液4°C保存備用。(2)將絲素蛋白溶液濃度用純化水調整為1%，在模具(24孔板)內加入質量濃度1%的絲素蛋白溶液，每孔I. 5ml，在溫度-40°C，靜置冷凍30h ;將模具在_80°C冷阱的真空冷凍干燥系統內干燥30h，在模具內形成三維絲素蛋白支架；(3)將模具在溫度70V，相對濕度88%條件下放置120min進行濕熱交聯，然后在溫度_40°C，靜置冷凍IOh ;將模具在-80°C冷阱的真空冷凍干燥系統內干燥24h，去除模具，獲得難溶于水的三維絲素蛋白支架。實施例4 (絲素蛋白溶液濃度O. 1%)(I)絲素蛋白溶液的制備同實施例3，獲得質量濃度為4%絲素蛋白溶液。(2)將絲素蛋白溶液濃度用純化水調整為O. 1%，在模具(24孔板)內加入質量濃度O. 1%的絲素蛋白溶液，每孔I. 5ml，在溫度_80°C，靜置冷凍30h ;將模具在_80°C冷阱的真空冷凍干燥系統內干燥30h，在模具內形成三維絲素蛋白支架；
(3)將模具在溫度70V，相對濕度90%條件下放置120min進行濕熱交聯，然后在溫度_40°C，靜置冷凍5h ;將模具在_80°C冷阱的真空冷凍干燥系統內干燥20h，去除模具，獲得難溶于水的三維絲素蛋白支架。
權利要求
1.一種難溶于水的三維絲素蛋白支架，其特征在于所述支架按如下方法制備(1)以桑蠶蠶絲為原料，經脫膠、溶解、透析，獲得截留液a，將截留液a或截留液a的濃縮液過濾或離心，取濾液或上層離心液得到絲素蛋白溶液；(2)將步驟(I)得到的絲素蛋白溶液的質量濃度用水調整至O. I 30%，倒入模具內，模具于-1(T-80°C冷凍2 40h，再在-4(T-110°C條件下真空冷凍干燥l(T72h，在模具內形成三維絲素蛋白支架；(3)將模具在溫度5(TlO(rC，相對濕度70 100%條件下放置2(T200min進行濕熱交聯，再在2(T60°C烘干2(Tl20min或在-4(T-110°C冷凍干燥5 12h，去除模具，獲得難溶于水的三維絲素蛋白支架。
2.如權利要求I所述的難溶于水的三維絲素蛋白支架，其特征在于步驟(2)所述模具在-2(T-50°C冷凍5 15h，再在-6(T-110°C條件下真空冷凍干燥16 48h，在模具內形成三維絲素蛋白支架。
3.如權利要求I所述的難溶于水的三維絲素蛋白支架，其特征在于步驟(2)所述模具內加入的絲素蛋白溶液體積量為10(T20000ml/m2模具。
4.如權利要求I所述的難溶于水的三維絲素蛋白支架，其特征在于步驟(3)所述模具在溫度65 70°C，相對濕度8(Γ90%條件下放置10(Tl20min進行濕熱交聯。
5.如權利要求I所述的難溶于水的三維絲素蛋白支架，其特征在于步驟(I)所述截留液a的濃縮液通過下述兩種濃縮方法之一獲得(a)反滲透法將透析后的透析袋放入質量濃度2(Γ60%的聚乙二醇水溶液中，靜置f 20h進行濃縮，獲得截留液a的濃縮液；所述聚乙二醇平均分子量100(Tl0000 ;(b)溶劑揮發法將截留液a在敞口容器內，于溫度1(T60°C，相對濕度1(Γ60%的環境中靜置2 30h，獲得截留液a的濃縮液。
6.如權利要求I所述的難溶于水的三維絲素蛋白支架，其特征在于步驟(I)所述截留液a或截留液a的濃縮液過濾或離心方法為下列之一 a)將截留液a或截留液a的濃縮液于4°C、300(T6000g條件下離心5 20min，棄去沉淀，取上層溶液即為所述的絲素蛋白溶液；b)將截留液a或截留液a的濃縮液用孔徑為2 20 μ m的濾器過濾，去除不溶性顆粒，濾液即為所述的絲素蛋白溶液。
7.如權利要求I所述的難溶于水的三維絲素蛋白支架，其特征在于步驟(I)所述脫膠、溶解、透析方法為a)脫膠將IOOg桑蠶蠶絲放入4 8L的2M碳酸鈉水溶液中，9(Tl00°C水浴2(T60min，純水清洗，該過程重復3次，脫去絲膠蛋白，留下絲素蛋白，將絲素蛋白在2(T60°C烘干，獲得干燥后的絲素蛋白；b)溶解將上述干燥后的絲素蛋白溶于iTllM的溴化鋰水溶液中，55飛5°C水浴3(T300min至絲素蛋白充分溶解，獲得含絲素蛋白的混合液；所述干燥后的絲素蛋白與溴化鋰水溶液的質量體積比為O. Γ0. 2:1 ；c)透析將含絲素蛋白的混合液用截留分子量100(Γ20000道爾頓的透析袋進行透析，用10倍混合液體積的無菌去離子水作為透析液在3天透析1(Γ12次，去除溶液中的溴化鋰成分，獲得截留液a。
8.如權利要求廣7之一所述的難溶于水的三維絲素蛋白支架在三維細胞培養載體、三維質粒轉染載體、軟骨支架、脂肪支架、骨支架或肌肉支架中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種難溶于水的三維絲素蛋白支架及其制備與應用將質量濃度為0.3~30%的絲素蛋白溶液注入模具內，經冷凍干燥獲得三維絲素蛋白支架；將模具在溫度50~100℃，相對濕度70~100%條件下濕熱交聯20~200min，再烘干去除模具，獲得難溶于水的三維絲素蛋白支架；本發明以絲素蛋白為原料，生物相容性好；制備工藝無毒環保，易于控制支架形狀和支架孔徑、孔隙率參數；支架為納米級孔壁微米級孔徑，模擬了細胞外基質微環境，應用于體外作為三維細胞培養載體、三維質粒轉染載體；體內組織工程領域作為軟骨支架、脂肪支架、骨支架、肌肉支架等方面。
文檔編號C12N5/00GK102847197SQ20121034397
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月17日 優先權日2012年9月17日
發明者陳隆坤, 其他發明人請求不公開姓名 申請人:浙江星月生物科技股份有限公司