專利名稱：人體外周血誘導(dǎo)免疫抑制性b淋巴細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種人抑制性B淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)、 純化以及潛在的細(xì)胞療法在自身免疫性疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，某些小鼠的B細(xì)胞亞群能分泌調(diào)節(jié)性的細(xì)胞因子以及具有免疫抑制效應(yīng)的細(xì)胞稱為調(diào)節(jié)性B細(xì)胞。在小鼠的各種疾病模型中，尤其是自身免疫性疾病的小鼠模型中，研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的存在及其和疾病的發(fā)生、發(fā)展有一定的關(guān)聯(lián)。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)功能的B細(xì)胞包括Bla，T2-MZ前體細(xì)胞，BlO細(xì)胞(CD19hiCDldhiCD5+) 等。雖然它們的表型不同，但是這些B細(xì)胞都能分泌IL-10和/或TGF-β。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)BAFF能夠體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性BlO細(xì)胞的產(chǎn)生，而且將調(diào)節(jié)性BlO細(xì)胞輸入到自身免疫性關(guān)節(jié)炎以及I型糖尿病的小鼠模型中，能夠有效地抑制疾病的發(fā)生和發(fā)展。基于這些臨床前試驗(yàn)的結(jié)果，我們提出是不是在人體也存在調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的可能。事實(shí)上，人調(diào)節(jié)性B 細(xì)胞的存在已經(jīng)被證實(shí)，據(jù)報(bào)道雖然人調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在自身免疫性關(guān)節(jié)炎病人的外周血中的比例較正常人沒(méi)有很大改變，但是它們的抑制功能卻明顯降低。已經(jīng)報(bào)道的人調(diào)節(jié)性B 細(xì)胞的亞群包括過(guò)度性B細(xì)胞(CD19hiCD24hiCD38hi)和記憶性B細(xì)胞(CD19hiCD24hiCD27+)。 但大量獲得具有免疫抑制功能的B細(xì)胞的方法還存在困難。基于報(bào)道和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，我們提出BAFF可以誘導(dǎo)人抑制性B細(xì)胞的產(chǎn)生，并對(duì)這種抑制性B淋巴細(xì)胞的表型和功能特征進(jìn)行鑒定。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效誘導(dǎo)及純化抑制性B淋巴細(xì)胞的方法，為臨床細(xì)胞療法在自身免疫性疾病的應(yīng)用提供平臺(tái)。
本發(fā)明所述的人重組BAFF細(xì)胞因子誘導(dǎo)抑制性B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的方法，其步驟為
(I)從新鮮的人外周血中分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，然后置于含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；
(2)在第1，3，5天，加入50ng/ml人重組BAFF細(xì)胞因子誘導(dǎo)抑制性B淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生。
上述方法中，步驟(I)中將人外周血單個(gè)核細(xì)胞濃度調(diào)整為5 XlOfVml,培養(yǎng)體系 Iml0
本發(fā)明方法中，人外周血淋巴細(xì)胞在重組蛋白BAFF的誘導(dǎo)下產(chǎn)生抑制性B淋巴細(xì)胞；產(chǎn)生的抑制性B淋巴細(xì)胞經(jīng)功能鑒定，表明BAFF誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞體外增殖具有抑制效果。


圖I :抑制性B淋巴細(xì)胞的表型鑒定
A，人外周血單個(gè)核細(xì)胞在BAFF的刺激下在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7天，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)BAFF誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞分泌IL-10的能力。如圖所示，百分比代表IL-10+B細(xì)胞占所有 B細(xì)胞的比例；
B，所表達(dá)的GITR和CD5以及IL-10B細(xì)胞所表達(dá)的GITR和CD5，百分比代表82% 的IL-IO+B細(xì)胞是GITR和CD5雙陽(yáng)性。
圖2 :抑制性B淋巴細(xì)胞的功能鑒定
A，磁珠純化分選的⑶4+T細(xì)胞，用CFSE標(biāo)記，然后用抗⑶3和抗⑶28誘導(dǎo)增殖，在培養(yǎng)體系中加入新鮮分離的B細(xì)胞，BAFF誘導(dǎo)的B細(xì)胞以及BAFF誘導(dǎo)并且分選純化的GITR+CD5+的雙陽(yáng)性B細(xì)胞共同培養(yǎng)3天。百分比代表T細(xì)胞的增殖情況 (*，ρ〈0· 05;#, ρ<0. 01)。
具體實(shí)施方式
I.人外周血單個(gè)核細(xì)胞的純化新鮮的人外周血由健康志愿者提供。人外周血單個(gè)核細(xì)胞用Lymphoprep (Axis-Shield)分離。新鮮的人外周血標(biāo)本用生理鹽水按I: I稀釋,取3ml稀釋的標(biāo)本緩緩加入預(yù)先加入5ml Lymphoprep 的15ml離心管(BD)。離心管配平后，放入離心機(jī)(Beckman Coulter),室溫,離心力為600g,離心20min。小心取出離心管，用無(wú)菌吸管取出位于密度I. 077g/ml的細(xì)胞層，即為單個(gè)核細(xì)胞層。細(xì)胞用生理鹽水洗 2-3次，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。新鮮準(zhǔn)備的外周血單個(gè)核細(xì)胞可以直接用于誘導(dǎo)抑制性B淋巴細(xì)胞，也可以凍存在液氮中。凍存液的配方如下RPMI1640的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入15%DMS0 和30%FBS。凍存細(xì)胞的濃度為15-20XlO6Ail凍存液。用臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定凍存復(fù)蘇后細(xì)胞的存活率一般大于95%。
2.抑制性B淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)5X106純化的單個(gè)核細(xì)胞加入24孔板中培養(yǎng)7 天，培養(yǎng)液為RPMI1640含10%FBS。在第1，3，5天，加入50ng/ml人重組BAFF細(xì)胞因子(購(gòu)于P印rotech，編號(hào)310-13)誘導(dǎo)抑制性B淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生。
3.抑制性B淋巴細(xì)胞的純化B淋巴細(xì)胞是用人CD19磁珠分選試劑盒分選純化的。每IO7細(xì)胞重懸在80 μ I緩沖液中，加入20 μ I⑶19磁珠混勻并在4-8° C孵育15min。 緩沖液的配方為PBS+0. 5%BSA+2mM EDTA。細(xì)胞用緩沖液洗2次，然后重懸在500 μ I緩沖液中。細(xì)胞用MACS柱子純化，收集結(jié)合在柱子上的細(xì)胞即為B淋巴細(xì)胞。
4.抑制性B淋巴細(xì)胞的表型鑒定為了檢測(cè)BAFF誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞分泌IL-10的能力，細(xì)胞在培養(yǎng) 7 天后,加入 PMA(50pg/ml), ionomycin (500ng/ml)以及 Monensin (2 μ Μ) 再培養(yǎng)5h。取1-5 X IO6細(xì)胞用于鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記如⑶38，⑶24，GITR以及⑶5的表達(dá)； 同時(shí)細(xì)胞經(jīng)破膜，固定后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IL-10的表達(dá)情況(結(jié)果如圖I)。
5.抑制性B淋巴細(xì)胞的功能鑒定為了鑒定BAFF誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞的功能，同種T 淋巴細(xì)胞(⑶4+CD25_)用人⑶4磁珠分選試劑盒分選純化。純化的T淋巴細(xì)胞用CFSE標(biāo)記， 然后和未誘導(dǎo)的純化的B細(xì)胞，BAFF誘導(dǎo)的B細(xì)胞以及BAFF誘導(dǎo)并分選純化的GITR陽(yáng)性的B淋巴細(xì)胞按1:1的比例共同培養(yǎng)3天。T淋巴細(xì)胞用培樣板結(jié)合的⑶3和⑶28(1 μ g/ ml)刺激。如圖2所示，BAFF誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞明顯抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，而且GITR陽(yáng)性的B細(xì)胞抑制效果更加明顯。
權(quán)利要求
1.人重組BAFF細(xì)胞因子誘導(dǎo)抑制性B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的方法，其步驟為 (1)從新鮮的人外周血中分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，然后置于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)， (2)在第1，3，5天，加入50ng/ml人重組BAFF細(xì)胞因子誘導(dǎo)抑制性B淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(I)中，將人外周血單個(gè)核細(xì)胞濃度調(diào)整為5,106/ml,培養(yǎng)體系=ImL0
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種人抑制性B淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)、純化以及潛在的細(xì)胞療法在自身免疫性疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明無(wú)菌采集人外周血，采用LymphoprepTM(Axis-Shield)分離人單個(gè)核細(xì)胞，然后置于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時(shí)在第1，3，5天，加入50ng/ml人重組BAFF細(xì)胞因子誘導(dǎo)抑制性B淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生。本發(fā)明采用BAFF體外誘導(dǎo)人外周血B細(xì)胞分化為抑制性B淋巴細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)IL-10，并且具有抑制T淋巴細(xì)胞增殖的能力。
文檔編號(hào)C12N5/0781GK102978158SQ20121034394
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月17日
發(fā)明者王勝軍, 芮棵, 楊敏, 呂力為 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)