專利名稱：一種利用農桿菌介導的光皮樺轉基因方法
技術領域：
本發明涉及一種利用農桿菌介導培養轉基因光皮樺的方法。2.背景技術
光皮樺(Betula Iuminifera H. Wink.)為樺木科樺木屬的落葉高大喬木,天然分布于我國秦嶺、淮河流域以南的14個省區，是木材材質優良的闊葉珍貴用材樹種，且具有耐貧瘠、速生、開花早等特性，現已成為中國南方地區杉木、松樹地更新的最重要珍貴造林樹種，也是良好的林木遺傳學研究材料。該樹種的育種工作已全面啟動，在不同種源區選擇了優良單株，并進行雜交創制新種質，建立其轉基因技術平臺對于開展光皮樺分子育種，創制抗蟲、抗旱新種質以及驗證已克隆基因的功能等均具有十分重要的作用。
轉基因技術指利用分子生物學技術，將某些抗逆、抗病蟲等已知功能性狀的基因， 通過現代科技手段移植到目標生物體中，從而對植物各種性狀進行改良的方法。其常用的方法有農桿菌介導法；基因槍法；電擊和聚乙二醇(PEG)法和花粉管通道法。迄今為止， 國內外已得到60種以上轉基因植物，其中棉花、煙草和大豆等已大面積種植。通過轉基因技術，可以改變光皮樺的遺傳物質，提高其抗蟲、抗旱和木材品質，從而降低生產成本，提高經濟效益。
CN200910113862. 4公開了諶紅輝的“光皮樺葉芽組織培養快速繁殖技術”發明專利技術，以光皮樺葉芽為外植體，誘導再生植株，這種方法雖然繁殖系數較高，但選材時間較難，而采用種子和葉片作為外植體采樣比較方便且可以多次采集。3.發明內容
本發明要解決的技術問題是建立光皮樺組培體系并利用農桿菌介導培養光皮樺轉基因植株。
解決上述技術問題的技術方案是按如下步驟進行
(I)培養基配方
預培養培養基配方MS+TDZ0.4mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5. 5g/ L (PH5. 9)
共培養培養基配方MS+TDZ0.4mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/ L+AS300ymol/L (PH5. 5)
選一培養基配方MS+TDZ0.4mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5. 5g/ L+Carb500mg/L+Hygl0mg/L
(PH5. 9)
選二、選三培養基配方MS+BA0.5mg/L+TDZ0. lmg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5. 5g/ L+Carb500mg/L+Hygl0mg/L
(PH5. 9)
生根培養培養基配方l/2MS+IBAlmg/L+蔗糖 20g/L+ 瓊脂 5. 5g/L (PH5. 9)
AS(乙酰丁香酮)、Carb (羧芐青霉素)和Hyg (潮霉素)都在培養基倒板前溫度低于50°C時再加入，防止失效。
(2)光皮樺組培苗的準備
A :種子消毒滅菌將收集的光皮樺種子放入50ml無菌離心管中，倒入70%酒精消毒1-2分鐘；倒去酒精，加入40ml O. I %升汞溶液，浸泡5min ;倒去升汞溶液，用無菌蒸餾水清洗種子4-5遍。
B :小苗誘導與繼代培養將滅好菌的種子放在無菌濾紙上吸干水分，置入MS培養基中；操作完畢后用封口膜(MicroporeTM Surgical Tape)封好培養皿，在25°C-28°C下光照培養2周；將發芽的小苗置入繼代培養基1/2MS，每瓶3-4株，培養2-3個月(25°C -28°C 下光照培養)。
⑶預培養
選取長勢較好的組培苗的葉片為外植體。選取其前3片較幼嫩的葉片，用剪刀在葉片上剪2-3道傷口(深達葉脈)，較大的葉片可剪成O. 5cm大小，接入預培養培養基，每皿 40-50片，暗培養7天。
(4)農桿菌培養
挑取農桿菌單克隆或吸取所保藏的農桿菌菌液100 μ I于5mlYEP (含50mg/LKan 和50mg/LStr)培養基中，28°C，250rpm振蕩培養20_36h至飽和，再按O. 2% -O. 3%的比例， 轉入含有抗生素的YEP培養基中，相同條件下培養12-16h，當0D600的值為O. 8-1. O時即可用于轉化。
(5)轉化和共培養
A :取培養好的菌液IOOml分裝于50ml離心管中，4000rpm,離心20-30min,去上清。用含300 μ mo I/LAS的IOOmlMS感菌液(PH5. 5)制成懸浮液，使菌液0D600終濃度為
B :將預培養過的光皮樺葉片放入農桿菌懸浮液中侵染20min ；
C :取出葉片，置于無菌濾紙上浙干10_20min ；
D :將葉片置于共培養培養基上，25°C暗培養5天。
(6)選擇培養
A :將共培養好的葉片轉入選一培養基中，每皿10-12片或每瓶4-5片，25°C -28°C 光照培養3-4周；
B :將選一培養基上長出的帶芽原基和微芽的愈傷塊，轉入選二培養基，每瓶4-5 塊，光照培養4周；
C :將選二上未達到生根要求的小苗和愈傷組織繼續轉入選三培養基，每瓶4-5 塊，光照培養4周。
(7)生根培養
將長至Icm以上的小苗，轉入生根培養基中培養，每瓶接1-2株。
(8)馴化移栽
A、選取長勢較好(根部和莖葉分化的較好)的試管苗，打開蓋子，煉苗1-3天；
B、將幼苗取出，洗凈小苗根部附著的培養基，然后移栽于溫室花盆中(基質由泥炭珍珠巖蛭石按I : I : I配制)，再用1000倍液多菌靈澆透，蓋膜一周，每天澆水，保證濕度，促進生根。
本發明的有益效果是(1)利用光皮樺種子和無菌苗葉片作為外植體材料，建立了其較完善的無菌組培快繁體系。(2)在光皮樺組培快繁體系的基礎上，建立了其轉基因體系(農桿菌介導)，為以后轉基因植株的選擇創建了基礎。4.


圖I :光皮樺組培苗；圖2 :預培養7天后的葉片；圖3 :共培養5天后的葉片；圖4 : 選一培養基培養3-4周后長出的愈傷組織；圖5 :選二培養基培養4周后長出的小苗；圖6 : 選三培養基培養4周后長出的小苗；圖7 :小苗生根培養。5.具體實施方式
下面結合實施例作進一步詳述
實施 例I23培養階段選一培養階段選二培養階段生根培養階段培養基MS+TDZO. 4mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖30g/L+瓊脂5. 5 g/L +Carb500mg/L+Hygl0mg/LMS+BAO. 5mg/L+TDZ0. lmg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 5. 5g/L +Carb500mg/L+Hygl0mg/Ll/2MS+IBAlmg/L+蔗糖 20g/L+瓊脂 5. 5g/L培養時間3-4周4周2周培養材料共培養后的愈傷組織選一培養后帶芽的愈傷組織篩選培養后得到的小苗成功率%46.856. 86100
實施例I :將共培養5天后的葉片轉入選一培養基中，每皿接種10-12片， 250C _28°C下光照培養3-4周，之后統計有效培養數并計算出選一培養階段的再生率；
實施例2 :選取選一培養基上長出帶芽原基和微芽的愈傷塊，轉入選二培養基，每瓶接種4-5塊，25°C _28°C下光照培養4周，之后統計有效培養數并計算出選二培養階段的成苗率；
實施例3 :將選擇培養得到的高于Icm的小苗轉接到生根培養基中，在相同培養條件下進行生根培養，待長有5條健壯根系即可進行煉苗移栽。
總之本方法的關鍵在于接種材料的選擇和處理、培養基的成分含量和培養條件及培養時間的選擇。
權利要求
1.ー種利用農桿菌介導的光皮樺轉基因方法，其技術方案按如下步驟進行 (1)培養基配方 預培養培養基配方MS+TDZO. 4mg/L+NAA0. 05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5. 5g/L(PH5. 9)共培養培養基配方MS+TDZO. 4mg/L+NAA0. 05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L+AS300ymol/L (PH5. 5) 選ー培養基配方MS+TDZO. 4mg/L+NAA0. 05mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 5. 5g/L+Carb500mg/L+HyglOmg/L (PH5.9) 選 ニ、選三培養基配方MS+BA0. 5mg/L+TDZ0. lmg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5. 5g/ L+Carb500mg/L+Hygl0mg/L (PH5.9) 生根培養培養基配方l/2MS+IBAlmg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5. 5g/L (PH5. 9) AS(こ酰丁香酮)、Carb (羧芐青霉素)和Hyg (潮霉素)都在培養基倒板前溫度低于50°C時再加入，防止失效。
(2)光皮樺組培苗的準備 A :種子消毒滅菌將收集的光皮樺種子放入50ml無菌離心管中，倒入70%酒精消毒1-2分鐘；倒去酒精，加入40ml0. I %升汞溶液，浸泡5min ;倒去升汞溶液，用無菌蒸餾水清洗種子4-5遍。
B :小苗誘導與繼代培養將滅好菌的種子放在無菌濾紙上吸干水分，置入MS培養基中；操作完畢后用封ロ膜(MicroporeTM Surgical Tape)封好培養皿，在25°C-28°C下光照培養2周；將發芽的小苗置入繼代培養基1/2MS，每瓶3-4株，培養2-3個月(25°C -28°C下光照培養)。
(3)預培養 選取長勢較好的組培苗的葉片為外植體。選取其前3片較幼嫩的葉片，用剪刀在葉片上剪2-3道傷ロ(深達葉脈)，較大的葉片可剪成O. 5cm大小，接入預培養培養基，每皿40-50片，暗培養7天。
(4)農桿菌培養 挑取農桿菌單克隆或吸取所保藏的農桿菌菌液IOOy I于5mlYEP(含50mg/LKan和50mg/LStr)培養基中，28°C，250rpm振蕩培養20_36h至飽和，再按O. 2% -O. 3%的比例，轉入含有抗生素的YEP培養基中， 相同條件下培養12-16h，當0D600的值為O. 8-1. O時即可用于轉化。
(5)轉化和共培養 A :取培養好的菌液IOOml分裝于50ml離心管中，4000rpm,離心20_30min,去上清。用含300 μ mo I/LAS的IOOmlMS感菌液(PH5. 5)制成懸浮液，使菌液0D600終濃度為I. O ； B :將預培養過的光皮樺葉片放入農桿菌懸浮液中侵染20min ； C :取出葉片，置于無菌濾紙上浙干10-20min ； D :將葉片置于共培養培養基上，25°C暗培養5天。
(6)選擇培養 A :將共培養好的葉片轉入選ー培養基中，每皿10-12片或每瓶4-5片，25°C _28°C光照培養3-4周； B :將選ー培養基上長出的帶芽原基和微芽的愈傷塊，轉入選ニ培養基，每瓶4-5塊，光照培養4周； C :將選ニ上未達到生根要求的小苗和愈傷繼續轉入選三培養基，每瓶4-5塊，光照培養4周。
(7)生根培養 將長至Icm以上的小苗，轉入生根培養基中培養，每瓶接1-2株。
(8)馴化移栽 A、選取長勢較好( 根部和莖葉分化的較好)的試管苗，打開蓋子，煉苗1-3天； B、將幼苗取出，洗浄小苗根部附著的培養基，然后移栽于溫室花盆中(基質由泥炭珍珠巖蛭石按I : I : I配制)，再用1000倍液多菌靈澆透，蓋膜一周，每天澆水，保證濕度，促進生根。
全文摘要
本發明涉及一種利用農桿菌介導的光皮樺轉基因方法，包括下列步驟(1)以光皮樺種子為外植體培養得到組培苗；(2)選取幼嫩的組培苗葉片接入預培養基中，黑暗培養；(3)用MS培養基重懸培養基重懸離心收集的農桿菌菌體制得農桿菌菌液；(4)將預培養的葉片，投入農桿菌菌液中侵染一段時間后取出外植體，轉入共培養基培養；(5)共培養后的材料轉入篩選培養基中誘導不定芽的再生；(6)生根培養；(7)煉苗移栽。本發明建立了農桿菌介導的光皮樺遺傳轉化體系，為通過轉基因技術深入研究并發掘光皮樺的最佳使用價值奠定了基礎。
文檔編號C12N15/82GK102978235SQ20121034386
公開日2013年3月20日 申請日期2012年9月17日 優先權日2012年9月17日
發明者童再康, 李美飛, 黃華宏, 樓雄珍, 姜小鳳 申請人:浙江農林大學