分離核酸的方法及裝置制造方法
【專利摘要】一種分離核酸的方法包括：將含有核酸的樣品溶液加至石英纖維濾紙的樣品接收部；使緩沖溶液沿著石英纖維濾紙長度方向擴散、通過樣品接收部，從而把核酸根據其分子量不同而在石英纖維濾紙上進行定位。本發明還涉及相關的分離核酸的裝置。
【專利說明】分離核酸的方法及裝置
【技術領域】
[0001]本發明涉及分離核酸的方法及裝置。
【背景技術】
[0002]核酸應用于醫學和生物學等領域。核酸的體外操作和分析之前通常需要將其與其他不需要的雜質分離開來，以避免影響后續體外操作和分析過程。
[0003]不同分子量的核酸提供由于不同的原因而重要的信息。例如，脫氧核糖核酸提供關于基因先天和后天突變/局部重排方面的重要信息。和脫氧核糖核酸相反，核糖核酸則反映細胞的生物學“快照”，因為它們總是跟隨周圍環境持續變化。 [0004]在某些應用中，如果能夠從單個生物樣本中將核酸根據分子量的不同而進行分離，對生物樣本的收集和后續分析將會得到大幅簡化。在生物樣本非常小的時候，例如活組織切片檢查時，很難將該生物樣本進一步分解成對分子量不同的核酸進行各自分離的更小的生物樣本，從同一個生物樣本同時分離出不同分子量的核酸尤為重要。
[0005]現有各種不同隔離/分離/純化核酸的技術。例如，國際專利申請公開第2007/104962號介紹了一種將液體樣本沿吸水膜流動以使核酸沿著膜的長度分布從而從液體樣品中分離的方法。
[0006]美國專利申請公開第2009/0143570號涉及一種分離從基因組脫氧核糖核酸、核糖核酸和蛋白質中選出的至少兩種細胞成分的方法，其包括:把包含細胞成分的水溶液施加至第一固體支撐來吸附基因組脫氧核糖核酸；和把包含沒有被吸附的核糖核酸和蛋白質的通過物施加至第二固體支撐來吸附核糖核酸。
[0007]對于核酸使用的增加創造了對于快速、簡便和可靠的核酸分離方法和裝置的需求，因此，有必要開發新的分離核酸的方法及裝置。

【發明內容】

[0008]本發明的目的是提供一種新的分離核酸的方法及裝置。
[0009]一方面，本發明涉及的分離核酸的方法包括:將含有核酸的樣品溶液加至石英纖維濾紙的樣品接收部；使緩沖溶液沿著石英纖維濾紙長度方向擴散、通過樣品接收部，從而把核酸根據其分子量不同而在石英纖維濾紙上進行定位。
[0010]另一方面，本發明涉及的分離核酸的裝置包括:石英纖維濾紙，其包括:樣品接收部，其接收含有核酸的樣品溶液；以及定位部，其在緩沖溶液沿著石英纖維濾紙長度方向擴散、通過樣品接收部之后定位相應分子量的核酸。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]通過結合附圖對于本發明的實施例進行描述，可以更好地理解本發明，在附圖中:
[0012]圖1是根據本發明的第一實施例所提供的裝置的示意圖。[0013]圖2是根據本發明的第二實施例所提供的裝置的示意圖。
[0014]圖3是根據本發明的第三實施例所提供的裝置的示意圖。
[0015]圖4是根據本發明的第四實施例所提供的裝置的示意圖。
[0016]圖5是例I中獲得的電泳圖像。
[0017]圖6為例2中獲得的電泳圖像。
[0018]圖7為例3中獲得的電泳圖像。
[0019]圖8為例4中獲得的電泳圖像。
[0020]圖9為圖3所示裝置和例5中獲得的電泳圖像。
[0021]圖10為圖4所示裝置和例6中獲得的電泳圖像。
【具體實施方式】
[0022]在下文中，將根據【專利附圖】

【附圖說明】本發明的實施方式，將不會詳細描述眾所周知的功能和結構，以避免因不必要的細節而使本發明變得令人費解。
[0023]除非另作說明，本文使用的技術術語或者科學術語為本發明所屬領域內具有一般技能的人士所理解的通常意義。本發明專利申請說明書以及權利要求書中使用的“第一”、“第二”、“第三”以及類似的詞語并不表示任何順序、數量或者重要性，而只是用來區分不同的組成部分?！鞍ā?、“含有”、或者“包含”等類似的詞語意指出現在“包括”、“含有”、或者“包含”前面的元件或者物件涵蓋出現在“包括”、“含有”、或者“包含”后面列舉的元件或者物件及其等同，并不排除其他元件或者物件。盡管“連接”、“鄰接”、或者“相連”等類似的詞語常用于描述物理的或者機械的連接，但并非限定于此，而且包括直接的或間接的連接。
[0024]說明書中的近似用語用來修飾數量，表示本發明并不限定于該具體數量，還包括與該數量接近的可接受的而不會導致相關基本功能的改變的修正的部分。相應的，用“大約”、“約”等修飾一個數值，意為本發明不限于該精確數值。在某些例子中，近似用語可能對應于測量數值的儀器的精度。
[0025]在以下的說明書和權利要求中，除非清楚地另外指出，單復數不加以限制。
[0026]本申請所提及的“可”、“可能”和“可為”表示在一定環境下發生的可能性；具有指定的性質，特征或者功能的可能性；和/或通過顯示一個或者多個能力、性能而適合于另一種動作，或者與該適合的動作相關的可能性。因此，用于“可”、“可能”和“可為”表示修飾的術語顯然適合、能夠或者適于所表示的能力，功能，或者用途，同時考慮在一些情況下，所修飾的術語可能有時不適合、不能或者不合適。例如，在一些情況下，事件或者能力可能是所期望的，而在其它情況下，該事件或者能力不能發生。這種區別通過術語“可”、“可能”和“可為”涵蓋。
[0027]本發明涉及從生物樣本把核酸與不需要的雜質分離及/或從單一生物樣本把核酸根據不同分子量互相分離的方法和裝置。本發明涉及的方法和裝置不需要使用昂貴的離心分尚設備且分尚時間較短。
[0028]本發明中“分離”指的是從樣品溶液把核酸與不需要的雜質分離及/或從單一生物樣本把核酸根據不同分子量互相分離而進行的隔離或純化核酸的行為或行動。
[0029]本發明中“核酸”是指脫氧核糖核酸、核糖核酸、或其組合。分離得到的核酸可包括單一類型的核酸或2個以上不同類型的核酸。分離得到的核酸可為單鏈、雙鏈、線性或環狀。分離得到的核酸的分子量也沒有限制，其在一些實施例中可在幾個堿基對(base pair,bp)到幾百萬bp的范圍內。
[0030]本發明提及的“生物樣本”這一術語是廣義上的，而且意在涵蓋各種包含核酸的生理或臨床生物資源。這樣的生物資源包括，但不限于，整體組織，包括活檢材料和吸出物；體外培養細胞，包括初級細胞和次級細胞、轉化細胞系、及組織細胞和血細胞；體液，如尿液、唾液、精液、分泌物、眼睛清洗和吸出物、肺清洗和吸出物；合成脫氧核糖核酸或核糖核酸的介質；化學法或生物法合成的脫氧核糖核酸或核糖核酸的混合物；真菌和植物組織，例如葉、根、莖和菌蓋；可存在于生物樣本上或里的微生物和病毒；以及其他任何脫氧核糖核酸和/或核糖核酸存在或 可存在的資源。
[0031]樣品溶液 可為以溶解、懸浮、混合或其他方式包含脫氧核糖核酸、核糖核酸或其組合，或含有脫氧核糖核酸、核糖核酸或其組合的細胞、細胞成分或細胞提取物的溶液。樣品溶液可從生物樣本制備而得。
[0032]從生物樣本制備含有核酸的樣品溶液的一個示例方法包括使用包含離液物(chaotropic substances)及/或其他試劑的溶解試劑對生物樣本進行溶解的步驟,實施這個步驟最簡單的方法是把生物樣本與溶解試劑相接觸。溶解試劑中離液物的濃度可為約
0.1摩爾/升至約10摩爾/升，例如約I摩爾/升至約10摩爾/升。
[0033]本發明提及的離液物是指一種能夠通過例如改變核酸的二級、三級、四級結構，保留一級結構完整等方式造成核酸無序的物質。離液物的示例包括但不限于，鹽酸胍、異硫氰酸胍/硫氰酸胍、硫氰酸鈉、高氯酸鈉、碘化鈉、碘化鉀、尿素、和/或這些物質的任何組合。一種典型的離液陰離子系列，按照離液能力遞減的順序排列如下:CC13C00_、CNS—、CF3COO'ClO4-，I- 、CH3COO' Br' Cl' CHO2'
[0034]對于某些生物樣本，如細菌，溶解試劑可包含分解酶，或者，對該生物樣本在溶解前例如用分解酶進行預處理。
[0035]—些實施例中,溶解試劑包括足量的緩沖液。在溶解試劑中使用的緩沖液示例包括三_(羥甲基)甲胺鹽酸鹽(三-鹽酸)、磷酸鈉、醋酸鈉、四硼酸鈉-硼酸和甘氨酸-氫氧化鈉。
[0036]一些實施例中，溶解試劑包括還原劑，該還原劑能夠促進離液物對核糖核酸酶的變性和幫助未降解核糖核酸的分離。還原劑示例包括但不限于，2-氨基乙硫醇、三-羧基乙
基磷化氫及巰基乙醇。
[0037]—些實施例中，溶解試劑包括非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、兩性表面活性劑、及\或各種表面活性劑的任意組合。非離子表面活性劑的示例包括但不限于聚氧亞乙基辛基苯基醚(Triton? X-100)、(辛基苯氧基)聚乙氧乙醇(IGEPAL?CA-630/NP-40)、三乙烯基乙二醇單月桂醇醚(BRIJ? 30)，山梨醇酐月桂酸酯(SPAN? 20)，或者聚山梨醇酯化合物家族，例如聚山梨醇酯20 (即TWEEN? 20)、TWEEN? 40、TWEEN?60和TWEEN? 80(Sigma-Aldrich公司，美國密蘇里州圣路易斯市)。陽離子表面活性劑的示例包括溴化十六烷基三甲基銨、氯化十二烷基三甲基銨、氯化十四烷基三甲基銨和氯化十六烷基吡啶。
[0038]溶解試劑中表面活性劑的濃度隨表面活性劑的種類和待溶解生物樣本中成分的不同而變化。一些實施例中，表面活性劑的重量濃度可為約0.1%到約20%。[0039]—些實施例中，溶解試劑包含蛋白酶，其為例如絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶等中的至少一種。可用不含核酸酶的蛋白酶。包含如金屬離子等穩定劑的蛋白酶，也可用。蛋白酶的用量可為添加后每毫升溶解試劑的約0.001IU到約10IU、或者約0.01IU 到約 IIUo
[0040]一些實施例中，溶解試劑含脫氧核糖核酸分解酶抑制劑及/或核糖核酸分解酶抑制劑。
[0041] 一些實施例中，溶解試劑包含消泡劑。消泡劑的示例包括含硅消泡劑(如硅油、二甲基聚硅氧烷、有機硅乳液，改性聚硅氧烷和有機硅化合物)、醇類消泡劑(例如乙炔二醇、庚醇、辛醇，高碳醇和聚氧化亞烷基二醇)、醚類消泡劑(例如，庚基溶纖劑和壬基溶纖劑-3-庚基山梨糖醇)、脂肪和油類消泡劑(如動物油和植物油)、脂肪酸類消泡劑(例如，硬脂酸，油酸和棕櫚酸)、金屬皂類消泡劑(例如，硬脂酸鋁和硬脂酸鈣)、脂肪酸酯類消泡劑(例如，天然蠟和磷酸三丁酯)、磷酸鹽類消泡劑(例如，辛基磷酸鈉)、胺類消泡劑(例如二戊基胺)、酰胺類消泡劑(例如，硬脂酸酰胺)、其他消泡劑(如硫酸鐵和釩土 )、和各種消泡劑的任意可能組合。
[0042]一些實施例中，溶解試劑包含醇，其可為伯醇、仲醇及叔醇，如甲醇、乙醇、丙醇及其同分異構體、和丁醇及其同分異構體等。溶解試劑中醇的重量濃度，可為約5%到約90%。
[0043]一些實施例中，溶解試劑為 11 lustra? RNAspin Mini kit (cat#25-0500-71)中的RAl溶解緩沖液，其中加入了 2-β -巰基乙醇(cas#60-24-2)。
[0044]制備含有核酸的樣品溶液的方法可以借助例如超聲波處理、尖銳突出物處理、或高速攪拌或振蕩處理等技術手段。
[0045]請參圖1，根據本發明的第一實施例所提供的裝置70包括:長條形石英纖維濾紙72，其包括第一尾部74、緩沖溶液載入部76、樣品接收部78、和與第一尾部74相反的第二尾部79。緩沖溶液載入部76相對于第二尾部79更靠近第一尾部74。樣品接收部78比緩沖溶液載入部76更接近第二尾部79。
[0046]參照圖2，根據本發明的第二實施例所提供的裝置I包括樣品墊2和與樣品墊2在長度方向上相連的收集墊3。樣品墊2是與圖1中石英纖維濾紙72相似的石英纖維濾紙，其包括第一尾部5、樣品接收部4、和與第一尾部5相反的第二尾部(未標記)。收集墊3可為石英纖維濾紙或者終止墊，其與樣品墊2的第二尾部連接。
[0047]參照圖3，根據本發明的第三實施例所提供的裝置10包括樣品墊12和與樣品墊12在長度方向上相連的吸液墊13。樣品墊12是與圖1中石英纖維濾紙72相似的石英纖維濾紙，其包括第一尾部15、緩沖溶液載入部17、樣品接收部14、和與第一尾部15相反的第二尾部16。緩沖溶液載入部17相對于第二尾部16更靠近第一尾部15。樣品接收部14比緩沖溶液載入部17更接近第二尾部16。
[0048]參照圖4，根據本發明的第四實施例所提供的裝置100包括樣品墊170、與樣品墊170在長度方向上相連的終止墊180、和與終止墊180在長度方向上連接的吸液墊130。樣品墊170是與圖1中石英纖維濾紙72相似的石英纖維濾紙，其包括第一尾部150、緩沖溶液載入部120、樣品接收部140、和與第一尾部150相反的第二尾部160。緩沖溶液載入部120相對于第二尾部160更靠近第一尾部150。樣品接收部140比緩沖溶液載入部120更接近第二尾部160。
[0049]石英纖維濾紙72、2、12、170可為任何吸著樣品溶液且不抑制核酸的儲存或后續分析的多孔吸液石英纖維濾紙。一些實施例中，石英纖維濾紙72、2、12、170由無粘結劑的純石英纖維制成。一些實施例中，石英纖維濾紙72、2、12、170對顆粒大小不小于2.2微米的粒子阻止通過效率為約98%，基礎重量為約85g/m2，厚度范圍為約300微米到約600微米。可應用于本發明的石英纖維濾紙的示例，包括但不限于可從美國新澤西州通用電氣醫療公司購得的Whatman" grade QM-A石英微纖維濾紙以及可從美國馬薩諸塞州Millipore公司購得的AQFA石英纖維濾紙。
[0050]含有核酸的樣品溶液施加到石英纖維濾紙72、2、12、170的樣品接收部78、4、14、140。樣品接收部78、4、14、140可為能接收樣品溶液的任何形狀或構造。一些實施例中，石英纖維濾紙72、2、12、170的樣品接收部78、4、14、140包含溶解試劑，生物樣本則可以直接應用于樣品接收部78、4、14、140。在這些情況下，生物樣本就是含有核酸的樣品溶液。
[0051]緩沖溶液可以是核酸的任何溶劑。一些實施例中，緩沖溶液是三(羥甲基)氨基甲烷乙二胺四乙酸(TE)緩沖溶液，和用羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)替換三(羥甲基)氨基甲烷后的磷酸鹽緩沖溶液和TE緩沖溶液中的至少一種。
[0052]緩沖溶液沿著石英纖維濾紙72、2、12、170長度方向擴散并通過樣品接收部78、4、
14、140。緩沖溶液載入部可為能接收緩沖溶液的任何形狀或構造。一些實施例中，緩沖溶液施加至緩沖溶液載入部76、17、120。一些實施例中，第一尾部5被浸于緩沖溶液中，從而緩沖溶液從第一尾部5開始擴散，在此情況下，第一尾部5就是緩沖溶液載入部。
`[0053]終止墊3、180是由不同于石英纖維濾紙的材料所制成的細長條。一些實施例中，終止墊3、180是由纖維素制成，如為Whatman? grade 31ET紙。
[0054]吸液墊13、130由吸液材料制得，如纖維素、二氧化硅微纖維濾紙、和玻璃纖維。一些實施例中，吸液墊13、130是由美國新澤西州的通用電氣醫療公司提供的Whatman?grade 470特殊用途濾紙所制得。
[0055]從后述實驗示例可以看出，在緩沖溶液沿著石英纖維濾紙72、2、12、170長度方向擴散、通過樣品接收部78、4、14、140之后，核酸在石英纖微濾紙72、2、12、170上根據分子量的不同而定位。具體而言，分子量高的核酸與分子量低的核酸相比，其定位于距離樣品接收部78、4、14、140更近的地方。
[0056]一些實施例中，大部分具有第一分子量的核酸被定位于樣品接收部78、4、14、140附近。在這種情況下，樣品接收部78、4、14、140是具有第一分子量的核酸的定位部。一些實施例中，第一分子量是指在至少約5萬個堿基對(50kilo base pairs, 50kb)或從約50kb到約150kb的范圍內。一些實施例中，約50kb是指50kb±15kb的范圍。
[0057]一些實施例中，大部分具有第二分子量的核酸被定位于第二尾部79、6、16、160附近。在這種情況下，第二尾部79、6、16、160是具有第二分子量的核酸的定位部。一些實施例中，第二分子量是在小于約50kb的范圍內。
[0058]一些實施例中，終止墊180、3 (當收集墊3為終止墊時)和石英纖維濾紙170、2相鄰，在緩沖溶液沿著石英纖維濾紙170、2長度方向擴散、通過樣品接收部140、4之后，大部分隨緩沖溶液遷移的核酸被定位在樣品墊170、2和終止墊180、3之間的界面。
[0059]一些實施例中，核酸定位于樣品接收部78、4、14、140和第二尾部79、6、16、160之間，從而這些核酸的定位部位于樣品接收部78、4、14、140和第二尾部79、6、16、160之間。
[0060]一些實施例中，在緩沖溶液擴散之前，使清洗液沿著石英纖維濾紙72、2、12、170長度方向擴散、通過樣品接收部78、4、14、140。清洗液在沒有外力僅靠毛細作用的情況下在石英纖維濾紙上擴散、帶走在石英纖維濾紙上吸著能力比核酸低的雜質，以將核酸與樣品溶液中不需要的雜質相分離。
[0061]含有核酸的樣品溶液、清洗液和緩沖溶液可用管子、移液管、自動注入裝置、或任何其他適用的方法或工具添加到石英纖維濾紙上。
[0062]清洗液可包括能分解雜質(例如蛋白質)的酶。此外，它可根據需要包括脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶或類似物。包含脫氧核糖核酸酶的清洗液的使用可有助于核糖核酸的選擇性回收。同樣，包含核糖核酸酶的清洗液可有助于選擇性的回收脫氧核糖核酸。
[0063]清洗液可包括水溶性有機溶劑和/或水溶性鹽。清洗液洗出樣品溶液中與核酸一起吸著在石英光纖濾紙上的雜質。因此，它可含有將雜質從石英纖維濾紙脫吸的同時讓核酸保持吸著的成分。核酸難溶的水溶性有機溶劑，如醇類，適合從石英纖維濾紙解吸核酸以外的其他成分。與此同時，水溶性鹽的納入可增強核酸的吸附，協助對不必要的雜質的選擇性解吸。
[0064]清洗液中的水溶性有機溶劑的示例包括甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇和丙酮，其中乙醇較為合適。水溶性有機溶劑在清洗液中的重量濃度可為約20%至100%或約40% 到約 100%。[0065]清洗液中的水溶性鹽可為鹵化鹽或三(羥甲基)氨基甲烷。
[0066]一些實施例中，清洗液為含80%乙醇的TE緩沖溶液。
[0067]清洗液可與含有核酸的樣品溶液在石英纖維濾紙的添加位置相同，即都在樣品接收部添加，或者與緩沖溶液在石英纖維濾紙的添加位置相同，即都在緩沖溶液載入部添加。清洗液也可從石英纖維濾紙上不同于樣品接收部和緩沖溶液載入部的位置添加。
[0068]一些實施例中，清洗液擴散至第二尾部79、6、16、160，把樣品溶液中不需要的雜質帶至第二尾部79、6、16、160。再在緩沖溶液擴散之前切除第二尾部79、6、16、160。通過這種方式，被定位在殘余石英纖維濾紙上的核酸為將不需要的雜質提純/分離/隔離后的核酸。
[0069]一些實施例中，在清洗液通過樣品接收部4、沿著石英纖維濾紙2長度方向、朝向收集墊3 (終止墊、吸液墊或石英纖維濾紙)及裝置I的第二尾部6擴散之后，更換收集墊3，從而使緩沖溶液從樣品墊2擴散至更換的收集墊3。
[0070]石英纖維濾紙72、1、12、170，收集墊3，吸液墊13、130，終止墊180可由如聚酯(Mylar?)或聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)等塑料材料之類的背襯材料提供支撐。
[0071]一些實施例中，裝置70、1、10、100包含塑料殼體(未圖示)，其將石英纖維濾紙72、
1、12、170，收集墊3，吸液墊13、130，終止墊180包覆于其內，但用相應開孔將樣品接收部78、4、14、140和/或緩沖溶液載入部76、5、17、120暴露，從而使含有核酸的樣品溶液、清洗液以及緩沖溶液可以被添加到樣品接收部78、4、14、140和/或緩沖溶液載入部76、5、17、120。一些實施例中，樣品接收部78、4、14、140和/或緩沖溶液載入部76、5、17、120可位于殼體之外。
[0072]本發明的裝置70、1、10、100可為一個簡單的核酸純化、分離設備，也可為整個核酸分析設備/儀器組件的組成部分。
[0073]在緩沖溶液擴散之后，可將定位在石英纖維濾紙上的核酸在低離子強度或用水的條件下進行洗提等后續處理。
[0074]本發明中“吸著”是指樣品溶液被吸收、吸附或摻入或摻到樣品接收部，使得不容易從樣品接收部移除，除非有意或不慎達到從樣品接收部移除吸著的組成的條件。
[0075]本發明中“大部分”是指達到總量的至少約15%、至少約50%、或至少約90%。舉例而言，“大部分具有第一分子量的核酸被定位在樣品接收部附近”是指具有第一分子量并且定位于樣品接收部的核酸，可為吸著于樣品接收部的樣品溶液中具有第一分子量的核酸總量的至少約15%、至少約50%、或至少約90%。類似地，“大部分具有第二分子量的核酸被定位在第二尾部附近”是指具有第二分子量并且定位于第二尾部的核酸，可為吸著于樣品接收部的樣品溶液中具有第二分子量的核酸總量的至少約15%、至少約50%、或至少約90%。
[0076]石英纖維濾紙的多孔性所固有的毛細作用力作為使清洗液和/或緩沖溶液沿著石英纖維濾紙擴散、通過樣品接收部的動力。吸液墊13、130依靠其強大的毛細作用力吸引清洗液和/或緩沖溶液朝向吸附墊13、130擴散?；陔s質與核酸對于多孔石英纖維濾紙的吸著力不同，清洗液和/或緩沖溶液帶走雜質，核酸與樣品溶液中雜質充分分離，消除了對產生外部動力(如離心力和壓力)的儀器和具有特定技能的人才的需求，使在偏遠地區的現場分離成為可能。
[0077]緩沖溶液沿著石英纖維濾紙長度方向擴散、通過樣品接收部，使核酸在石英纖維濾紙上遷移，分子量越低，核酸從樣品接收部遷移的距離越遠。當緩沖溶液從石英纖維濾紙擴散到由不同于石英纖維濾紙材料制成的終止墊或吸液墊時，隨著緩沖溶液遷移的核酸將停止且定位于石英纖維濾紙和終止墊或吸液墊之間的界面。因此，通過緩沖溶液擴散，將核酸以分子量大小定位在石英纖維濾紙的相應的位置，即可達到分離核酸與雜質及/或不同分子量核酸的目的。`
[0078]實驗示例
[0079]下述實驗示例為本【技術領域】內的技術人員實施本發明提供進一步的指導。示例并不限定權利要求書中界定的本發明的范圍。
[0080]例I脫氧核糖核酸尺寸分析
[0081]小鼠基因組脫氧核糖核酸溶液(5ul，來自中國北京的康為世紀生物科技有限公司)和5ul人類基因組脫氧核糖核酸溶液(來自美國加州的Clontech Laboratories, Inc.)被置于兩個分離的含有1%瓊脂糖膠的樣品槽來進行脈沖場凝膠電泳。
[0082]脈沖場凝膠電泳是由Bio-rad實驗室的CHEF Mapper" XA系統在電壓為6v/cm且溫度為10° C的環境里進行24小時。電泳之后，瓊脂糖膠被IxSYBR Green I溶液染色5小時，之后使用美國新澤西州通用電氣醫療公司提供的Typhoon? Trio?多模式成像儀顯影。
[0083]脈沖場凝膠電泳圖像如圖5所示。在圖5中，泳道1、III表征MidRange 11 PFG標記，泳道II表征5ul小鼠基因組脫氧核糖核酸溶液，泳道IV表征5ul人類基因組脫氧核糖核酸溶液。
[0084]從圖5中可以看出，小鼠基因組脫氧核糖核酸的分子量小于約50kb，而人類基因組脫氧核糖核酸至少為約50kb且在約50kb到約150kb的范圍內。[0085]例2低分子量(< 50kb)脫氧核糖核酸
[0086]請參照圖2，裝置I (寬4mm，長5.5cm)包括樣品墊2 (寬4mm，長2.5cm)和與樣品墊2有5mm重疊長度的收集墊3 (寬4_，長3.5cm)。樣品墊2和收集墊3都是從美國新澤西州通用電氣醫療公司獲得的Whatmanii grade QM-A石英微纖維濾紙。樣品墊2的樣品接收部4距離樣品墊2的第一尾部5有1.5cm。
[0087]小鼠基因組脫氧核糖核酸樣品溶液(2.5ul，100ng/ul，分子量< 50kb，同例I中所用)加入一支1.5ml的微離心管中，然后和2.5ul緩沖液(66.87%鹽酸胍，4%Triton? X-100)混合。
[0088]在將混合物轉移至樣品墊2的樣品接收部4之前，先將該微離心管搖晃約15秒。
[0089]5秒鐘后，樣品混合物被吸收，樣品墊2的第一尾部5被置于一個96槽板的含有150ul清洗液(含80%乙醇的TE緩沖溶液(IOmM Tris pH8，0.1mMEDTA))的一個槽中來沿著裝置長度方向擴散清洗液。
[0090]5分鐘后，裝置I被取出，樣品墊2和收集墊3相分離，并在溫度為37° C的烘箱中干燥10分鐘。干燥之后，樣品墊2按照上述相同方式和一個新的與用過的相同的收集墊3組裝在一起。
[0091]第一尾部5置于一個96槽板的含有150ulTE緩沖溶液(IOmM Tris pH8，0.1mMEDTA)的槽中用來沿著裝置I來擴散TE緩沖溶液。
[0092]5分鐘后，裝置I被取出，并在溫度為37° C的烘箱中干燥30分鐘。
[0093]干燥之后,裝置I切成寬4mm、長5mm的小片。每一小片被分別置于含有0.8%瓊脂糖膠的樣品槽中。
[0094]在電壓為120V的條件下電泳45分鐘。電泳之后，用IxSYBR Green I染色瓊脂糖膠1.5小時,之后使用Typhoon? Trio?多模式成像儀顯影。
[0095]電泳圖像如在圖6中所示，圖中第I至12泳道表征根據在裝置I中位置所排列的第一尾部5到第二尾部6的小片，具體而言，第I至5泳道表征來自樣品墊2的小片，第6至12泳道則表征來自收集墊3的小片，第13泳道是空白的，第14泳道表征脫氧核糖核酸標記(日本Takara DL15000)。該圖像顯示，在清洗液和TE緩沖溶液擴散之后，大部分小鼠基因組脫氧核糖核酸(分子量< 50kb)定位在裝置I的第二尾部6附近(第11，12泳道)。換句話說，第二尾部6是本例中的定位部。
[0096]例3高分子量O 50kb)脫氧核糖核酸
[0097]重復例2的實驗，但用人類基因組脫氧核糖核酸(分子量> 50kb，與例I中所用的同)取代例2中的小鼠基因組脫氧核糖核酸。
[0098]電泳圖像如在圖7中所示，圖中第I至12泳道表征根據在裝置I中位置所排列的第一尾部5到第二尾部6的小片，第I至5泳道是來自樣品墊2的小片，第6至12泳道則為來自收集墊3的小片，第13泳道是表征脫氧核糖核酸標記(日本Takara DL15000)。
[0099]圖像顯示，在清洗液和TE緩沖溶液擴散之后，大部分人類基因組脫氧核糖核酸仍然保留在樣品接收部4 (第3，4泳道)附近。換句話說，大部分人類基因組脫氧核糖核酸定位于樣品接收部4，而樣品接收部4是本例中的定位部。
[0100]例4聞分子量脫氧核糖核酸和低分子量脫氧核糖核酸
[0101]人類基因組脫氧核糖核酸樣品溶液(2.5ul，100ng/ul，同例I中所用)加入一支1.5ml的微離心管中，然后與2.5ul脫氧核糖核酸標記(日本Takara DL15000，包括7個分子量:15kb、10kb、7.5kb、5kb、2.5kb、lkb、250bp)和 5ul 緩沖液(66.87% 鹽酸胍，4%Triton?X-100)混合。
[0102]混合物用同例2中的相同的方式處理，但收集墊3是4cm長，且清洗液和TE緩沖溶液都是例2中兩倍的量。
[0103]電泳圖像如在圖8中所示，圖中第I泳道表征脫氧核糖核酸標記(日本TakaraDL15000)，第2至14泳道表征裝置I從第一尾部5到第二尾部6的小片。
[0104]該圖顯示，在清洗液和TE緩沖溶液擴散之后，在樣品接收部4 (第4泳道)附近僅有人類基因組脫氧核糖核酸，而且，在第二尾部6 (第14泳道)僅有低分子量的脫氧核糖核酸標記。也就是說，對于人類基因組脫氧核糖核酸，定位部是樣品接收部4，對于低分子量的脫氧核糖核酸標記，第二尾部6是其定位部，而對于分子量介于定位于樣品接收部4的核酸分子量和定位于第二尾部6的核酸分子量之間的核酸，其定位部介于第二尾部6和樣品接收部4之間。
[0105]例5脫氧核糖核酸和核糖核酸
[0106]請參照圖9，使用圖3中的裝置10，其包括一個樣品墊12 (寬4mm，長6cm的Whatman' grade QM-A石英微纖維濾紙)，一個與樣品墊12部分重疊的吸液墊13(Whatman? grade 470特殊用途濾紙)和一個將樣品墊12和吸液墊13包覆的殼體(未圖示，中國上海的上海杰一生物科技有限公司的A-1O塑料殼體)。
[0107]包含1.2xl06 細胞的融合組織培養物(干細胞培養物)被急速旋轉并除去浮層介質。細胞粒與 35ul 的 Illustra? RNAspin Mini kit (cat#25-0500-71)的 RAl 溶解緩沖液和0.35ul的2-β -巰基乙醇(BME, cas#60-24_2)旋轉混合。
[0108]通過殼體的一個開口(未圖示)把5ul細胞溶解液加到與樣品墊12的第一尾部15距離2.7cm的樣品接收部14。在干燥之后，Iul的total Jurkat RNA(lug/ul)通過該開口加至樣品接收部14。
[0109]不含脫氧核糖核酸酶/核糖核酸酶的TE緩沖溶液(150ul，IOmM Tris pH8，0.1mMEDTA)通過殼體的另一個開口(未圖示)加至與樣品墊12的第一尾部15距離為Icm的緩沖溶液載入部17，沿著裝置10長度方向擴散。
[0110]10分鐘之后，樣品墊12從殼體取出并置于0.8%的瓊脂糖膠。在IlOV的電壓進行電泳45分鐘。之后，用插入染料對瓊脂糖膠染色I小時，再使用Typhoon? Trio?多模式成像儀顯影。
[0111]核酸定位的結果顯示在圖9中，圖中所示是按照與樣品墊12中相應的位置排列的，但泳道A顯示的是NEBlkb ladder,泳道B是與樣品接收部14所接收的細胞溶解液和total Jurkat RNA用量完全相同的對照樣本的顯影，為作比較，此樣本電泳前未經TE緩沖溶液擴散處理。
[0112]從圖9可以看出，在TE緩沖溶液沿著裝置10擴散之后，高分子量的脫氧核糖核酸(DNA)被定位在樣品接收部14附近，而核糖核酸(RNA)成分遷移并被定位至第二尾部16。也就是說，樣品接收部14是高分子量脫氧核糖核酸的定位部而第二尾部16是核糖核酸成分的定位部。
[0113]例6脫氧核糖核酸和核糖核酸[0114]請參照圖10，應用圖4中的裝置100，其包含一個樣品墊170 (寬4mm，長4cm的WhatmanK grade QM-A石英微纖維濾紙),一個與樣品墊170部分重疊的終止墊180 (寬4mm,長2.5cm的WhatmanR grade 31ET紙)，一個與終止墊180部分重疊的吸液墊130(W hatnian? grade 470特殊用途濾紙)和一個將前述墊包覆的殼體(未圖示，中國上海的上海杰一生物科技有限公司的A-1O塑料殼體)。
[0115]包含1.2x106細胞的融合組織培養物(干細胞培養物)被急速旋轉并除去浮層介質。細胞粒與 35ul 的 Illustra? RNAspin Mini kit (cat#25-0500-71)的 RAl 溶解緩沖液和0.35ul的2-β -巰基乙醇(BME, cas#60-24_2)旋轉混合。
[0116]通過殼體的一個開口(未圖示)把5ul細胞溶解液加到與樣品墊170的第一尾部150距離2.7cm的樣品接收部140。在干燥之后，Iul的total Jurkat RNA (lug/ul)通過該開口加至樣品接收部140。
[0117]150ul不含脫氧核糖核酸酶/核糖核酸酶的TE緩沖溶液(IOmM Tris pH8，0.1mMEDTA)通過殼體的另一個開口(未圖示)加至與樣品墊170的第一尾部150距離為Icm的緩沖溶液載入部120，沿著裝置100長度方向擴散。
[0118]10分鐘之后，樣品墊170和終止墊180從殼體取出并置于0.8%的瓊脂糖膠。在IlOV的電壓進行電泳45分鐘。之后，用插入染料對瓊脂糖膠染色I小時，再使用Typhoon?Trio?多模式成像儀顯影。
[0119]核酸定位的結果顯示在圖10中，圖中所示是按照與樣品墊170和終止墊180相應的位置排列的，但泳道D顯示的是NEBlkb ladder,泳道C是與樣品接收部140所接收的細胞溶解液和total Jurkat RNA用量完全相同的對照樣本的顯影，為作比較，此樣本電泳前未經TE緩沖溶液擴散處理。
[0120]從圖10可以看出，脫氧核糖核酸(DNA)被定位在樣品接收部140附近，而在樣品墊170的第二尾部160和終止 墊180之間的界面上核糖核酸(RNA)的集中度非常顯著。換句話說，樣品接收部140是脫氧核糖核酸的定位部而第二尾部160和終止墊180之間的界面是核糖核酸的定位部。
[0121]盡管在【具體實施方式】中對本發明的部分特征進行了詳細的說明和描述，但在不脫離本發明精神的前提下，可以對本發明進行各種改變和替換。同樣的，本領域熟練技術人員也可以根據常規實驗獲得本發明公開的其它改變和等同物。所有這些改變，替換和等同物都在本發明所定義的權利要求的構思和范圍之內。
【權利要求】
1.一種分離核酸的方法，其特征在于，包括: 將含有核酸的樣品溶液加至石英纖維濾紙的樣品接收部； 使緩沖溶液沿著石英纖維濾紙長度方向擴散、通過樣品接收部，從而把核酸根據其分子量不同而在石英纖維濾紙上進行定位。
2.如權利要求1所述的分尚核酸的方法，其特征在于，大部分具有第一分子量的核酸被定位在樣品接收部附近。
3.如權利要求2所述的分離核酸的方法，其特征在于，第一分子量為至少約5萬個堿基對(50kilo base pairs,50kb)o
4.如權利要求2所述的分離核酸的方法，其特征在于，第一分子量為約50kb至約150kb。
5.如權利要求1至4中任一權利要求所述的分離核酸的方法，其特征在于，石英纖維濾紙呈長條形，包括第一尾部、緩沖溶液載入部、樣品接收部、和第二尾部，緩沖溶液載入部相對于第二尾部更靠近第一尾部，樣品接收部比緩沖溶液載入部更接近第二尾部。
6.如權利要求5所述的分尚核酸的方法，其特征在于，大部分具有第二分子量的核酸被定位在第二尾部附近。
7.如權利要求6所述的分離核酸的方法,其特征在于,第二分子量為低于約50kb。
8.如權利要求5所述的分離核酸的方法，其特征在于，其包括，提供一個與第二尾部相鄰的吸液墊。
9.如權利要求8所述的分離核酸的方法，其特征在于，其包括，在使緩沖溶液沿著石英纖維濾紙長度方向擴散、通過樣品接收部、至終止墊、第二石英纖維濾紙、或第二吸液墊之前，使清洗溶液沿著石英纖維濾紙長度方向擴散至吸液墊。
10.如權利要求5所述的分離核酸的方法，其特征在于，緩沖溶液載入部為第一尾部，且浸在緩沖溶液中。
11.如權利要求5所述的分離核酸的方法，其特征在于，其包括，提供一個與第二尾部相鄰的、由不同于石英纖維濾紙材料所制成的終止墊。
12.如權利要求5所述的分離核酸的方法，其特征在于，其包括，在使緩沖溶液沿著石英纖維濾紙長度方向擴散之前，使清洗液沿著石英纖維濾紙長度方向擴散至第二尾部、并切除第二尾部。
13.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其特征在于，核酸為脫氧核糖核酸、核糖核酸、或其組合。
14.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其特征在于，緩沖溶液為核酸的溶劑。
15.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其特征在于，緩沖溶液為三_(羥甲基)氨基甲烷乙二胺四乙酸(TE)緩沖溶液，和用羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)替換三(羥甲基)氨基甲烷的磷酸鹽緩沖溶液和TE緩沖溶液中的至少一種。
16.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其特征在于，其包括，用溶解試劑制備樣品溶液。
17.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其特征在于，樣品接收部包含溶解試劑。
18.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其特征在于，其包括:在使緩沖溶液沿著石英纖維濾紙長度方向擴散、通過樣品接收部、至第二石英纖維濾紙之前，使清洗液沿著石英纖維濾紙長度方向擴散、通過樣品接收部、至第三石英纖維濾紙。
19.一種分離核酸的裝置，其特征在于，其包括: 石英纖維濾紙，其包括: 樣品接收部，其接收含有核酸的樣品溶液；以及 定位部，其在緩沖溶液沿著石英纖維濾紙長度方向擴散、通過樣品接收部之后定位相應分子量的核酸。
20.如權利要求19所述的分離核酸的裝置，其特征在于，樣品接收部包含溶解試劑。
21.如權利要求19所述的分離核酸的裝置，其特征在于，定位部為樣品接收部。
22.如權利要求19所述的分離核酸的裝置，其特征在于，其包括，包覆石英纖維濾紙的殼體。
23.如權利要求19至22中任一權利要求所述的分離核酸的裝置，其特征在于，石英纖維濾紙呈長條形，包括第一尾部、緩沖溶液載入部、樣品接收部、和第二尾部，緩沖溶液載入部相對于第二尾部更靠近第一尾部，樣品接收部比緩沖溶液載入部更接近第二尾部。
24.如權利要求23所述的分離核酸的裝置，其特征在于，其包括，與第二尾部相鄰的、由不同于石英纖維濾紙材料所制成的終止墊。
25.如權利要求23所述的分離核酸的裝置，其特征在于，緩沖溶液載入部為第一尾部。
26.如權利要求23所述的分離核酸的裝置，其特征在于，其包括，與第二尾部相鄰的吸液墊。
27.如權利要求23所述的分離核酸的裝置，其特征在于，定位部為第二尾部。
28.如權利要求23所述的分離核酸的裝置，其特征在于，定位部位于樣品接收部和第二尾部之間。
【文檔編號】C12N15/10GK103667253SQ201210347718
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月18日 優先權日:2012年9月18日
【發明者】約翰.尼爾森, 帕特里克.斯普納, 克里斯托弗.普萊奧, 侯嶸, 陳林 申請人:通用電氣公司