專利名稱：一種菊屬及其近緣種屬通用的ssr標記pcr反應方法
技術領域：
本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種菊屬及其近緣種屬通用的SSR標記PCR反應方法。
背景技術：
聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等優點，能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一 DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷。PCR五因素引物、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA模板和Mg2+。
PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成①模板DNA的變性模板DNA經加熱至93°C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2 4分鐘，2 3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。SSR標記是一類重要的分子標記，應用于植物的育種、品種鑒定等領域，SSR標記的開發與利用需要一個靈敏度高，準確性好的PCR反應方法。而目前在菊屬及其近緣種屬(菊屬、亞菊屬、太行菊屬、芙蓉菊屬)尚未研究出高效、通用性強的SSR標記的PCR反應方法。

發明內容
為填補在菊屬、亞菊屬，太行菊屬、芙蓉菊屬的野生種和品種之間沒有通用的SSR標記PCR反應方法的空白，本發明的目的是提供一種菊屬及其近緣種屬通用的SSR標記PCR反應方法。本發明提供的菊屬及其近緣種屬通用的SSR標記PCR反應方法，其PCR反應體系
如下引物濃度0.32 μ M/μ I Taq 晦濃度0.211/μΙ dNTP 濃度0.4 μ M/ μ I Mg2+的濃度0.65 μ M/μ I DNA樣品的濃度2~4ng/ μ I 反應體系總體積為25 μ I,其中，所述引物可選自以下2對引物中的任意一對SSR標記LHJ-I弓丨物序列上游引物5’-ATGGTGGTGGTAGCTGGGT-3’(如 SEQ ID NO. I 所示)下游引物5’-GAGATCGGAGGGTGCGTG-3’(如 SEQ ID NO. 2 所示)SSR標記ΥΗ-2弓丨物序列上游引物5’-TTCGACGGGTGGTGGTGTT-3’(如 SEQ ID NO. 3 所示)下游引物5’-GACACCACAACGCTACCGC-3’(如 SEQ ID NO. 4 所示)其中，反應條件為94°C預變性5min ;94°C變性 O. 5min，50_62°C復性 O. 5min，72°C延伸lmin, 30個循環；72°C延伸5min 。本發明還提供所述菊屬及其近緣種屬通用的SSR標記PCR反應方法在菊屬、亞菊屬、太行菊屬、芙蓉菊屬的野生種和品種中的應用。本發明所提供的菊屬及其近緣種屬通用的SSR標記PCR反應方法具有如下優點I、本發明填補了在菊屬，亞菊屬，太行菊屬，芙蓉菊屬的野生種和品種之間缺少通用的SSR標記PCR反應方法的空白。2、本發明的SSR標記PCR反應方法靈敏度高，重復性好，易于操作，而且通用性好。3、有利于菊屬，亞菊屬，太行菊屬，芙蓉菊屬SSR標記的開發和利用，推動菊屬及近緣種屬的新品種培育和商品花卉生產。


圖I為本發明方法所做菊屬品種和野生種的SSR標記PCR產物的瓊脂糖電泳圖。圖2為本發明方法所做亞菊屬、太行菊屬、芙蓉菊屬及菊屬野生種的SSR標記PCR產物的瓊脂糖電泳圖。其中，圖I中PCR產物瓊脂糖凝膠電泳條帶序號代表的種類依次是1野菊、2甘菊、3甘野菊、4毛華菊、5小紅菊、6菊花腦、7紫花野菊、8神農香菊、9陽光小菊、10繁白露、11四季黃、12香玉、13上海小菊、14夏菊、15國慶紅、16玉人面、17神馬、18帥旗、19粉玉卷簾、20金葵臺、21精興將軍。圖2中PCR產物瓊脂糖凝膠電泳條帶序號代表的種類依次是I亞菊、2磯菊、3灌木亞菊、4細裂亞菊、5異色亞菊、6柳葉亞菊、7太行菊、8長裂太行菊、9芙蓉菊、10甘野菊、11毛華菊。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中，菊屬及近緣種屬植物材料均取自北京林業大學種質資源圃，DNA樣品的提取采用天根生化科技(北京)有限公司DNA提取試劑盒完成，所用的Tag酶、dNTP和MgCl2是由Promega公司生產的，SSR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。實施例I本發明菊屬及其近緣種屬通用的SSR標記PCR反應方法的建立(I)提取了菊屬、亞菊屬、太行菊屬、芙蓉菊屬內常用的野生種及其栽培品種的DNA樣品。菊屬野生種類有野菊，甘菊，甘野菊，毛華菊，小紅菊，菊花腦，紫花野菊，神農香菊。菊屬栽培種類中小菊品種有陽光小菊(盆栽小菊)，繁白露(北方地被小菊)，四季黃(北方地被小菊)，香玉(切花小菊)，上海小菊(南方地被小菊)，夏菊(夏季開花種類)，國慶紅(南方地被小菊)，玉人面(茶用菊品種);菊屬栽培種類中大菊有神馬(重要切花菊品種)，帥旗(中國傳統大菊品種)，粉玉卷簾(中國傳統大菊品種)，金葵臺(中國傳統大菊品種)，精興將軍(日本大菊品種);亞菊屬種類亞菊，磯菊(原產日本)，灌木亞菊，細裂亞菊，異色亞菊，柳葉亞菊；太行菊屬太行菊，長裂太行菊(此屬為中國特有，僅此兩種);芙蓉菊屬芙蓉菊(僅此一種，特產我國)。(2)經過大量的預實驗，設計了 25 μ I體系PCR五因素4水平正交試驗Taq 酶(5υ/μ I) :0. 25 μ 1,0. 5μ 1,0. 75 μ I, I. 0μ I ；dNTP (20 μ M/μ I) 0. 25 μ 1,0. 5μ 1,0. 75 μ I, I. 0μ I ；Mg2+ (6. 5 μ M/μ I ) I. 5 μ 1, 2. O μ 1, 2. 5 μ 1, 3. O μ I ；引物(ΙΟμΜ/L):0· 2μ 1，0· 4μ 1，0· 6μ 1，0· 8μ I ;DNA 樣品(50ng/y I) :0. 5 μ 1，I. O μ 1，I. 5 μ 1，2· O μ I根據正交實驗設計原理得到16個不同的反應體系，見表I。表IPCR反應體系1-1權利要求
1.一種菊屬及其近緣種屬通用的SSR標記PCR反應方法，其特征在于，PCR反應體系如下引物濃度0.32 μ M/μ I Taq 酶濃度0.2υ/μ1dNTP 濃度0.4 μ M/μ IMg2+的濃度0.65 μ M/μ I DNA樣品的濃度2 4ng/ μ I 反應體系總體積為25 μ I.
2.如權利要求I所述的菊屬及其近緣種屬通用的SSR標記PCR反應方法，其特征在于，弓丨物為SSR標記LHJ-I引物序列 上游引物5’ -ATGGTGGTGGTAGCTGGGT-3’ 下游引物5’ -GAGATCGGAGGGTGCGTG-3'。
3.如權利要求I所述的菊屬及其近緣種屬通用的SSR標記PCR反應方法，其特征在于，弓丨物為SSR標記ΥΗ-2引物序列 上游引物5’ -TTCGACGGGTGGTGGTGTT-3’ 下游引物5’ -GACACCACAACGCTACCGC-3’。
4.如權利要求I所述的菊屬及其近緣種屬通用的SSR標記PCR反應方法，其特征在于，反應條件為94°C預變性 5min ;94°C變性 O. 5min，50-62°C 復性 O. 5min，72°C 延伸 lmin,30個循環；72°C延伸5min。
5.權利要求1-4任一項所述的菊屬及其近緣種屬通用的SSR標記PCR反應方法在菊屬、亞菊屬、太行菊屬、芙蓉菊屬的野生種和品種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種菊屬及其近緣種屬通用的SSR標記PCR反應方法，其PCR反應體系中，引物濃度為0.32μM/μl，Taq酶濃度為0.2U/μl，dNTP濃度為0.4μM/μl，Mg2+的濃度為0.65μM/μl，DNA的濃度為2~4ng/μl。應用本發明所用的方法進行SSR分子標記PCR反應，所得到的條帶清晰、多態性好、重復性高，而且操作簡單，在菊屬、亞菊屬、太行菊屬、芙蓉菊屬的野生種和品種間通用，應用前景十分廣闊。
文檔編號C12Q1/68GK102876790SQ20121034831
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者張啟翔, 劉華, 孫明, 程堂仁, 王佳, 潘會堂 申請人:北京林業大學