專利名稱：定性檢測尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1a1基因分型的測序引物對及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外核酸檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種在臨床樣本中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl (UGTlAl)基因分型的測序引物對及其試劑盒。
背景技術(shù)：
尿苷二憐酸葡萄糖醒酸基轉(zhuǎn)移酶(uridinediphosphoglucuronateglucucronosy I transferase, UGT)是生物體內(nèi)進行第II相生物轉(zhuǎn)化時最重要的酶之一，屬于糖基轉(zhuǎn)移酶超家族。UGT共有2個亞家族，UGTlA和UGT2家族。UGTlAl是一種對許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)進行解毒，加強其排泄的重要酶類，UGTlAl基因的遺傳多態(tài)性對減輕藥物的毒副作用有重要的臨床意義。目前發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性主要包括(TA) η重復(fù)序列啟動子(UGT1A1*28)的多態(tài)性和UGT1A1*6基因序列的多態(tài)性。在中國人中，UGT1A1*28只發(fā)現(xiàn)兩種類型(TA)6和(TA)7，可組合成TA6/6、TA6/7和TA7/7三種等位基因。相對于TA6/6表·型患者，TA7/7表型患者的UGTlAl酶活性降低約50%。UGT1A1*6基因突變主要發(fā)生在第一號外顯子第211核苷酸上G突變成A，導(dǎo)致其編碼的甘氨酸變?yōu)榫彼?G71R)。UGTlAl基因表達減少會增加人體對某些藥物的敏感性，可能發(fā)生未預(yù)期的毒性。伊立替康(Irinotecan，CPT-11)，是DNA拓撲異構(gòu)酶I抑制劑，可誘導(dǎo)單鏈DNA損傷，從而阻斷DNA復(fù)制叉，阻止DNA鏈的重新組裝，引起DNA雙鏈的斷裂，造成細胞死亡。主要治療成人晚期轉(zhuǎn)移性大腸癌，對小細胞和非小細胞肺癌、宮頸癌和卵巢癌亦有療效。伊立替康為前體藥物，在體內(nèi)經(jīng)過羧酸酯酶轉(zhuǎn)化為活性代謝物。羧酸酯酶將伊立替康分子10位的哌啶側(cè)鏈裂解，產(chǎn)生7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)，其活性較伊立替康強100到1000倍。SN-38經(jīng)肝臟尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-GT，主要由UGTlAl、UGT1A7和UGT1A9代謝)葡萄糖醛酸化滅活，生成葡萄糖醛酸化SN-38 (SN-38G),從而保護健康細胞免受伊立替康毒性的影響。但UGTlAl酶的UGT1A1*28的形式不能催化SN-38，結(jié)果聚集在體內(nèi)的SN-38引發(fā)腹瀉或嗜中性白血球減少癥等其他毒性，UGT1A1*28的突變使UGTlAl的轉(zhuǎn)錄活性下降三分之二，UGT1A1*6的突變導(dǎo)致酶活性降為野生型的49%，因此，2005年，美國FDA要求在伊立替康藥品標簽上加入警示,建議患者在使用伊立替康前先檢查是否帶有UGT1A1*28 突變。目前醫(yī)院用于UGTlAl基因分型檢測的“金標準”是PCR-直接測序法，但直接測序法的敏感性不高，只能檢測出突變細胞比率在10-20%以上的腫瘤組織，對于含〈10%突變細胞的腫瘤組織以及外周血，常規(guī)PCR+直接測序法幾乎無能為力。相比于直接測序法，焦磷酸測序的靈敏性更高、成本更低。焦磷酸測序(Pyrosequencing)是一種基于聚合原理的DNA測序(確定DNA中核苷酸的順序)方法，是新一代DNA序列分析技術(shù)。它是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(PPi)。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個峰值。每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。通過分析出峰情況，達到測定DNA序列的目的目前市場上還沒有利用焦磷酸技術(shù)進行UGTlAl的基因多態(tài)性檢測的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異性高、準確性好、能夠定性檢測尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl (UGTlAl)基因分型的測序引物對及其試劑盒。為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種定性檢測尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl (UGTlAl)基因分型的測序引物對，所述引物對為如下引物
UGT1A1*6 正向擴增引物5' -CAGCAGAGGGGACATGAAAT-3' (SEQ IDN0. I)；UGT 1A1*6 反向擴增引物5' -CTTTGGAATGGCACAGGGTAC-3' (SEQ IDN0. 2)UGT1A1*6 測序引物5' -CTTCAAGGTGTAAAATGC-3' (SEQ ID NO. 3)UGT1A1*28 正向擴增引物5' -TGAAAGTGAACTCCCTGCTACC-3' (SEQID NO. 4)UGT1A1*28 反向擴增引物5' -TCCACTGGGATCAACAGTATCTT-3' (SEQID NO. 5)UGT1A1*28 測序引物5' -CGCCCTCTCCTACTTA-3' (SEQ ID NO. 6)其中，UGT1A1*6正向擴增引物(SEQ ID NO. I)和 UGT1A1*28 (SEQ IDN0.4)正向擴增引物的5'端分別進行生物素標記。一種定性檢測尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl基因分型的測序試劑盒，所述試劑盒包括含有SEQ ID NO. 2所示反向擴增引物的PCR反應(yīng)液1，含有SEQ ID NO. 5所示反向擴增引物的PCR反應(yīng)液2，SEQ ID NO. I和SEQ IDN0. 4所示的正向擴增引物，SEQ IDNO. 3和SEQ ID NO. 6所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 5所示引物的5，端進行生物素標記。進一步地，所述試劑盒中還包括質(zhì)控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 7) (controloligo)和作為空白對照品的超純水；質(zhì)控序列是由QIAGEN設(shè)計合成的一段寡聚核苷酸鏈，用于檢測PyroMark Q24測序儀的各項性能指標。進一步地，所述試劑盒還包括UGT1A1*6陽性對照品1，UGT1A1*6陽性對照品2，UGT1A1*6陽性對照品3 ;UGT1A1*28陽性對照品1，UGTIAl氺28陽性對照品2，UGTIAl氺28陽性對照品3 ；所述UGT1A1*6陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的UGT1A1*6野生純合子質(zhì)粒；所述UGT1A1*6陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列的UGT1A1*6突變純合子質(zhì)粒；UGT1A1*6陽性對照品3為由所述UGT1A1*6突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*6野生純合子質(zhì)粒組成的UGT1A1*6質(zhì)粒混合物；所述UGT1A1*28陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的UGT1A1*28野生純合子質(zhì)粒；UGT1A1*28陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的UGT1A1*28突變純合子質(zhì)粒；UGT1A1*28陽性對照品3為由所述UGT1A1*28突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*28野生純合子質(zhì)粒組成的UGT1A1*28質(zhì)粒混合物；其中，質(zhì)粒載體為pMD18-T質(zhì)粒；所述UGT1A1*6質(zhì)粒混合物中UGT1A1*6突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*6野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為I: I ;所述UGT1A1*28質(zhì)粒混合物中UGT1A1*28突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*28野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1。所述的PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液2中其他組分為常規(guī)的IOx PCR Buffer、dNTP和H2O,各組分按常規(guī)體積比配置(IOx PCR Buffer、dNTP、H2O和反應(yīng)液中引物的體積比為5:3:37. 5:1)。試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶和雙 磷酸酶組成的酶混合物，由5’-磷酰硫酸和熒光素組成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為I)本發(fā)明提供的定量檢測UGTlAl基因分型的焦磷酸測序試劑盒定性準確，具有靈敏性高、特異性強的優(yōu)點，樣品處理簡單，測序速度快，高通量，半個小時完成一次上機反應(yīng)，直接給出檢測位點頻率分析，結(jié)果直觀。2)本發(fā)明提供的定量檢測UGTlAl基因分型的焦磷酸測序試劑盒靈敏度和特異性高；3)本發(fā)明提供的定量檢測UGTlAl基因分型的焦磷酸測序試劑盒檢測速度快；4)本發(fā)明提供的定量檢測UGTlAl基因分型的焦磷酸測序試劑盒步驟簡單；5)本發(fā)明提供的定量檢測UGTlAl基因分型的焦磷酸測序試劑盒可同時進行高通量的樣本檢測。6)本發(fā)明的試劑盒中設(shè)置了空白對照和陽性對照，能更好的確保檢測結(jié)果的準確性。由于設(shè)計了靈敏度高，特異性好的引物，并且選擇了合適的方法，本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)GTlAl基因分型進行快速檢測。本發(fā)明的試劑盒可實時監(jiān)測反應(yīng)進程，反應(yīng)時間短，PCR產(chǎn)物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應(yīng)時間短，高通量，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用于突變分析。


圖I為臨床樣本UGT1A1*6野生型的焦磷酸測序圖；圖2為臨床樣本UGT1A1*6突變雜合型的焦磷酸測序圖；圖3為臨床樣本UGT1A1*6突變純合型的焦磷酸測序圖；圖4為臨床樣本UGT1A1*28野生型的焦磷酸測序圖。圖5為臨床樣本UGT1A1*28突變雜合子型的焦磷酸測序圖。圖6為臨床樣本UGT1A1*28突變純合子型的焦磷酸測序圖。圖7為臨床質(zhì)控品control oligo的焦磷酸測序結(jié)果圖；圖8為臨床空白對照的焦憐酸測序結(jié)果圖；圖9為多組設(shè)計引物的凝膠電泳圖；圖中①、②表明非特異性條帶，③表明特異性和片段大小均比較合適，④表明目的帶片段大小不對。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步的詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實施例I :試劑盒的制備I.引物的設(shè)計與合成研究表明目前針對UGTlAl基因多態(tài)性主要是UGT1A1*6和UGT1A1*28兩種基因多態(tài)性，UGT1A1*6基因突變主要發(fā)生在第一號外顯子第211核苷酸上G突變成A，導(dǎo)致其編碼的甘氨酸變?yōu)榫彼?G71R)，UGT1A1*28的多態(tài)性是(TA)n重復(fù)序列啟動子，使用PyroMarkAssay Design2. O軟件，根據(jù)這兩個突變位點(表I)設(shè)計并確定了 PCR擴增引物和焦磷酸測序引物(表2)，試劑盒中最主要的影響試劑盒的準確性的就是引物，包括擴增引物和測序引物，在設(shè)計的初期，我們設(shè)計了多組引物進行比較(見圖9);其中擴增引物和測序引物先經(jīng)過PAGE純化，再經(jīng)HPLC純化，其中UGT1A1*6正向擴增引物(SEQ ID NO. I)和UGT1A1*28(SEQ ID NO. 4)正向擴增引物的5'端分別進行生物素標記。表I.突變位點與類型
權(quán)利要求
1.一種定性檢測尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl基因分型的測序引物對，其特征在于，所述引物對為SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 4所示的正向擴增引物，SEQ ID NO. 2和SEQID NO. 5所示的反向擴增引物，SEQ ID N0.3和SEQ ID NO. 6所示的測序引物；其中，SEQ IDNO. I和SEQ ID NO. 4所示引物的5’端進行生物素標記。
2.一種定性檢測尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶IAl基因分型的焦磷酸測序試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括含有SEQ ID NO. 2所示反向擴增引物的PCR反應(yīng)液1，含有SEQID NO. 5所示反向擴增引物的PCR反應(yīng)液2，SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 4所示的正向擴增引物，SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 6 所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 5 PJf示引物的5’端進行生物素標記。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括SEQID NO. 7所示的質(zhì)控品和空白對照品。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述空白對照品為水。
5.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括UGT1A1*6陽性對照品I,UGTlAl氺6陽性對照品2,UGTlAl氺6陽性對照品3 ;UGT1A1*28陽性對照品1，UGT1A1*28陽性對照品2，UGT1A1*28陽性對照品3 ； 所述UGT1A1*6陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的UGT1A1*6野生純合子質(zhì)粒；所述UGT1A1*6陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列的UGT1A1*6突變純合子質(zhì)粒；UGT1A1*6陽性對照品3為由所述UGT1A1*6突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*6野生純合子質(zhì)粒組成的UGT1A1*6質(zhì)粒混合物； 所述UGT1A1*28陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的UGT1A1*28野生純合子質(zhì)粒；UGT1A1*28陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的UGT1A1*28突變純合子質(zhì)粒；UGT1A1*28陽性對照品3為由所述UGT1A1*28突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*28野生純合子質(zhì)粒組成的UGT1A1*28質(zhì)粒混合物； 其中，質(zhì)粒載體為PMD18-T質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述UGT1A1*6質(zhì)粒混合物中UGT1A1*6突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*6野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1。
7.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述UGT1A1*28質(zhì)粒混合物中UGT1A1*28突變純合子質(zhì)粒和所述UGT1A1*28野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1。
全文摘要
本發(fā)明提供一種定性檢測尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1基因分型的測序引物對及其試劑盒，屬于體外核酸檢測領(lǐng)域，所述試劑盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR反應(yīng)液、PCR擴增引物、焦磷酸測序引物、以及陽性對照品；本發(fā)明提供的試劑盒靈敏度高，特異性好，PCR產(chǎn)物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應(yīng)時間短，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用于突變分析。
文檔編號C12Q1/68GK102899406SQ20121034797
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者周姍 申請人:長沙三濟生物科技有限公司