專利名稱：定性檢測人類braf v600e基因突變的測序引物對及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及體外核酸檢測領域，尤其涉及一種在臨床樣本中區分人類BRAF V600E基因突變的測序引物對及其試劑盒。
背景技術：
BRAF基因全名為人源鼠肉瘤病毒(v-raf)致癌同源體Bl(v_raf mourine sarcomaviral oncogene homo log BI, B_raf),其編碼的B型有絲分裂原激活的蛋白激酶依賴性激酶的激酶(RAF)是RAS/RAF/MEK/MARK信號通路的關鍵成分，該信號通路調節細胞的生長、增值和凋亡，當其發生改變時則可能導致腫瘤的形成。BRAF錯義突變發生于近8%人類腫瘤中，主要發生在結直腸癌、黑色素瘤和甲狀腺乳頭狀癌中。多種消化道腫瘤中均存在不同頻率的BRAF基因突變。因此，該突變可作為一個診斷和預后的分子生物學標記及開發治療相關癌癥的基因祀點。BRAF基因包括3個保守區域，稱為CR1、CR2和CR3。CR3為激酶區域。大多數的BRAF突變主要發生外顯子15上的激活區，其中約92%位于第1799核苷酸上，T突變為A，導致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E(1799T>A))。而V600E突變正好位于BRAF基因的活性區域(CR3)上。目前認為，這一突變帶來的負電荷模擬了蘇氨酸598和絲氨酸601的磷酸酰基化過程，從而異常激活了 BRAF基因。BRAF V600E突變對下游激酶的激活能力是野生型的12. 5倍。在同一腫瘤中，BRAF突變和Kras突變幾乎不同時出現。BRAF蛋白可能獨立于RAS蛋白而發揮作用。因此，2010年版《NCCN結直腸癌臨床實踐指南》建議在使用西妥昔單抗前，對野生型KRAS患者進行BRAF基因(V600E)突變檢測，能篩除約50%的非適用人群，以提高用藥的針對性。目前醫院用于BRAF V600E基因分型檢測的“金標準”是PCR-直接測序法，但直接測序法的敏感性不高，只能檢測出突變細胞比率在10-20%以上的腫瘤組織，對于含〈10%突變細胞的腫瘤組織以及外周血，常規PCR+直接測序法幾乎無能為力。相比于直接測序法，焦磷酸測序的靈敏性更高、成本更低。焦磷酸測序(Pyrosequencing)是一種基于聚合原理的DNA測序(確定DNA中核苷酸的順序)方法，是新一代DNA序列分析技術。它是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團(PPi)。PPi可最終轉化為可見光信號，并由PyrogramTM轉化為一個峰值。每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續DNA鏈的合成。通過分析出峰情況，達到測定DNA序列的目的目前市場上還沒有利用焦磷酸技術進行BRAF V600E的基因多態性檢測的產品。

發明內容
本發明的目的是提供一種特異性高、準確性好、能夠定性檢測人類BRAF V600E基因突變的測序引物對及其試劑盒。為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為一種定性檢測人類BRAF V600E基因突變的測序引物對，所述引物對為如下引物正向擴增引物5'-CTTCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3' (SEQ ID NO. I)反向擴增引物5'-GCATCTCAGGGCCAAAAATT-3' (SEQ ID NO. 2)；測序引物5'-CCACTCCATCGAGATT-3' (SEQ ID NO. 3)；其中，正向擴增引物的5'端進行了生物素標記。一種定性檢測人類BRAF V600E基因突變的測序試劑盒，所述試劑盒中包括含有SEQ ID NO. I所示引物的PCR反應液，SEQ ID NO. 2所示的反向擴增引物，SEQ ID NO. 3所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. I所示引物的5’端進行生物素標記。進一步地，所述試劑盒還包括BRAF陽性對照品；所述BRAF陽性對照品包含BRAF陽性對照品I和BRAF陽性對照品2 ;所述BRAF陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 5所示核苷酸序列的野生純合子質粒；所述對照品2為所述野生純合子質粒與插有SEQ ID NO. 6所示核苷酸序列的突變純合子質粒組成的質粒混合物；其中，質粒載體為PMD18-T質粒；所述質粒混合物中，野生純合子質粒與突變純合子質粒的數量比為1:1。進一步地，所述試劑盒中還包括質控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 4) (controloligo)和作為空白對照品的DNase-RNase-free水；質控序列是由QIAGEN設計合成的一段寡聚核苷酸鏈，用于檢測PyroMark Q24測序儀的各項性能指標。所述的PCR反應液I中其他組分為常規的IOx PCR Buffer、dNTP和H2O,各組分按常規體積比配置(10x PCR Buffer、dNTP、H2O和反應液中引物的體積比為5:3:37. 5:1)。試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規試劑，如尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。本發明的優點及有益效果I)本發明提供的定性檢測人類BRAF V600E基因突變的焦磷酸測序試劑盒，定性準確，具有靈敏性高、特異性強的優點，樣品處理簡單，測序速度快，高通量，半個小時完成一次上機反應，直接給出檢測位點頻率分析，結果直觀。2)本發明提供的定性檢測人類BRAF V600E基因突變的焦磷酸測序試劑盒靈敏度和特異性高。由于采取特異性擴增引物和測序引物的雙保險設計，通過對核昔酸加入順序的選擇，實現等位基因聞分辨檢測，靈敏度和特異性均有很大提聞;3)本發明提供的定性檢測人類BRAF V600E基因突變的焦磷酸測序試劑盒檢測速度快；4)本發明提供的定性檢測人類BRAF V600E基因突變的焦磷酸測序試劑盒步驟簡單；5)本發明提供的定性檢測人類BRAF V600E基因突變的焦磷酸測序試劑盒可同時進行高通量的樣本檢測。6)本發明的試劑盒中設置了空白對照和陽性對照，能更好的確保檢測結果的準確性。
由于設計了靈敏度高，特異性好的引物，并且選擇了合適的方法，本發明的試劑盒能夠對BRAF V600E基因分型進行快速檢測。本發明的試劑盒可實時監測反應進程，反應時間短，PCR產物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應時間短，高通量，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用于突變分析。


圖I為臨床BRAF野生型的焦磷酸測序結果圖；圖2為臨床質控品control oligo的焦磷酸測序結果圖；圖3為臨床空白對照的焦磷酸測序結果圖；圖4為多組設計引物的凝膠電泳圖；圖中①、②表明非特異性條帶，③表明特異性和片段大小均比較合適，④表明目的帶片段大小不對。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本發明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。實施例I :試劑盒的制備I.引物的設計與合成使用QIAGEN PyroMark Assay Design 軟件，針對 BRAF 基因的 15 號外顯子 1799位點(T>A)設計上下游擴增引物和測序引物。試劑盒中最主要的影響試劑盒的準確性的就是引物，包括擴增引物和測序引物，在設計的初期，我們設計了多組引物進行比較(見圖5)；引物均委托專業公司合成，為HPLC純化，其中SEQ ID NO. I所示正向擴增引物的5’端為生物素標記。表I突變位點與類型
權利要求
1.一種定性檢測人類BRAF V600E基因突變的測序引物對，其特征在于，所述引物對為SEQ ID NO. I所示的正向擴增引物，SEQ ID NO. 2所示的反向擴增引物，SEQ ID NO. 3所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. I所示引物的5’端進行生物素標記。
2.一種定性檢測人類BRAF V600E基因突變的測序試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括含有SEQ ID NO. I所示引物的PCR反應液，SEQ ID NO. 2所示的反向擴增引物，SEQ IDNO. 3所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. I所示引物的5’端進行生物素標記。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括BRAF陽性對照品I和BRAF陽性對照品2 ;所述BRAF陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 5所示核苷酸序列的野生純合子質粒；所述對照品2為所述野生純合子質粒與插有SEQ ID NO. 6所示核苷酸序列的突變純合子質粒組成的質粒混合物；其中，質粒載體為PMD18-T質粒。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述質粒混合物中野生純合子質粒與突變純合子質粒的數量比為1:1。
5.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括如SEQID NO. 4所示的質控品和空白對照品。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述空白對照為DNase-RNase-free水。
全文摘要
本發明提供一種定性檢測人類BRAF V600E基因突變的測序引物對及其試劑盒，屬于體外核酸檢測領域，所述試劑盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR反應液、PCR擴增引物、焦磷酸測序引物、以及陽性對照品；本發明提供的試劑盒靈敏度高，特異性好，PCR產物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應時間短，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用于突變分析。
文檔編號C12N15/11GK102925555SQ201210347950
公開日2013年2月13日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者周姍 申請人:長沙三濟生物科技有限公司