專利名稱：一種產葡萄糖氧化酶酵母工程菌及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種產葡萄糖氧化酶的基因工程菌，特別是一種產葡萄糖氧化酶的酵母工程菌，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
葡萄糖氧化酶(GOD)是生物領域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面，將其應用于血糖測定以來，GOD被廣泛應用于食品、飼料、醫藥等許多相關領域。在食品工業中，由于氧的存在，引起許多不利于產品質量的化學反應，并為許多微生物生長創造了條件。目前，許多國家已將GOD作為工人的安全抗氧劑而廣泛應用于各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成過氧化 氫、形成葡萄糖酸四個方面。利用其專一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析儀，能快速準確簡易地測定各種食品中的葡萄糖含量，指導生產。在醫藥工業中，GOD作為試劑盒、酶電極等用于血清(漿)、尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；G0D制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑、牙垢和齲齒的形成防止口腔疾病和牙病的發生。此外，由于可以催化生成H2O2，還可用于對H2O2敏感的淋巴瘤的導向目標的治療。GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環境，調節飼糧消化，促進動物生長。含葡萄糖氧化酶、乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑，可用于預防牲畜胃腸道感染、腹瀉，并有促進動物生長作用。從動植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富；細菌GOD產酶量少；一般采用黑曲霉(具有GRAS資格)和青霉屬菌株作為GOD生產菌。我國及美國均采用點青霉及產黃青霉生產G0D,日本常用尼崎青霉,俄羅斯用生機青霉,近年報道膠霉屬(Clioctadium)、擬青霉屬(Paecilomyces)和帚霉屬(Scopulariopsis)也能生產G0D。產量低、酶活低、檢測方法復雜是GOD產業化的限制性因素，國內外為此做了大量工作并取得了明顯進展。目前國外生產的GOD廠家主要是德國的Boehringer和日本的TOYOBO0規模化生產高活性的GOD還有困難。發酵生產GOD的同時產生大量雜蛋白，分離提取復雜，成本聞。

發明內容
本發明提供了一株組成型產葡萄糖氧化酶的基因工程菌，于2012年7月I日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址為中國武漢、武漢大學，保藏編號為CCTCC NO M2012267，分類學命名為畢赤酵母(Pichia pastoris)X33_pGAPZ a-G0X。本發明還提供了一株產葡萄糖氧化酶基因工程菌的構建方法，包括如下步驟I)根據本實驗室篩選保藏的黑曲霉CCTCC NO Μ2011291的基因為模版設計引物，獲得GOD基因；
2)將GOD基因連接到畢赤酵母表達載體pGAPZ α，得到重組質粒pGAPZ a -GOD ；3)重組載體轉化 Pichia pastoris X33。葡萄糖氧化酶酶活測定方法G0D活性測定一般采用鄰-聯(二)茴香胺分光光度法。在有氧條件下，GOD催化葡萄糖脫氫產生H2O2，在過氧化物酶(POD)作用下，氧供體鄰-聯(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色產物。測540nm處吸光度的變化，根據標準曲線的結果，計算葡萄糖氧化酶活力單位。本發明的有益效果該菌株表達的葡萄糖氧化酶在搖瓶中的酶活為23U/mL，比野生菌的酶活提高了近11倍，大大降低了生產成本，在工業上具有重大應用價值。生物材料保藏
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一種產葡萄糖氧化酶的酵母工程菌，該菌株為巴斯德畢赤酵母，命名為Pichiapastoris X33-pPIC9K-G0X，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M2012267，保藏日期為2012年7月I日。


圖I :克隆表達載體構建圖。圖2 :蛋白電泳(SDS-PAGE)實驗結果。M :蛋白質分子量標準(Protein MolecularWeight Marker);泳道24h_144h :重組畢赤酵母發酵上清液隨時間變化的電泳分析。
具體實施例方式實施例I重組菌的構建及鑒定根據本實驗室篩選保藏的黑曲霉CCTCC NO M2011291的基因為模版設計引物，獲得GOD基因。限制性內切酶Kpn I和Not I雙酶切消化純化后的GOD基因和載體pGAPZ α，用T4DNA連接酶于16°C過夜連接，連接產物用化學轉化法轉化宿主菌JM109，轉化菌液涂布在含有卡那霉素(30mg/mL)的LB平板上，37°C過夜培養，最終獲得含有GOD基因的重組表達質粒pGAPZ a -GOD，用雙酶切進行驗證。將重組質粒pGAPZ a -GOD電擊轉化Pichia pastoris X33感受態細胞，得到基因工程菌，并經過鑒定命名為Pichia pastoris X33_pGAPZ a-G0X。畢赤酵母的轉化采用電轉化法Χ33于500mL YPD中培養至0D_=1. 2-1. 5，1500g離心收集細胞；依次用400mL冰冷的無菌水洗兩次細胞，再用40mL冰冷的lmol/L山梨醇洗一次細胞，重懸細胞于ImL lmol/L山梨醇。100 μ L原生質體與5_10 μ g線性化質粒DNA (Bgl II切)混合，轉入冰冷的電轉杯，放置5分鐘；電擊細胞與DNA的混合物(I. 5kv，
4.2-4. 9ms);加入ImL冰冷的lmol/L山梨醇，繼續放置30min;再加入0. 5mL S0S，30°C放置2小時，偶爾搖動志菌體不易沉淀；用lmol/L山梨醇稀釋菌體后涂布于固體MD培養基。30°C培養4-6天后挑取單克隆。實施例2重組菌的酶活測定和蛋白電泳采用實施例I中構建的酵母工程菌為生產菌株，活化后，將30°C、200rpm下培養到0D_在I. 6-1. 7之間的種子以2%的接種量轉入基本發酵培養基，于30°C、200rpm條件下發
酵培養。培養基種子和基本發酵培養基為YPDS培養基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g，山梨醇168g ;斜面培養基添加瓊脂20g ；發酵結束后，通過蛋白電泳(SDS-PAGE)得到一條分子量大小約為68kDa的蛋白條帶，同時在搖瓶中驗證產葡萄糖氧化酶的能力，最高酶活為23U/mL比野生菌的酶活(2. 2U/mL)提高了近11倍。可以理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據本發明的技術方案及其發 明構思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應屬于本發明所附的權利要求的保護范圍。
權利要求
1.一種產葡萄糖氧化酶酵母工程菌，于2012年7月I日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號 CCTCC NO M 2012267。
2.權利要求I所述酵母工程菌，其特征在于組成型表達外源葡萄糖氧化酶。
3.—種權利要求I所述基因工程菌的構建方法，包括如下步驟 1)采用化學全合成或PCR方法獲得黑曲霉葡萄糖氧化酶基因； 2)將葡萄糖氧化酶基因連接到畢赤酵母表達載體pGAPZa，得到重組質粒pGAPZa -GOD ； 3)重組載體轉化畢氏酵母(Pichiapastoris)X33得到基因工程菌CCTCC NO:M2012267。
4.權利要求I所述基因工程菌應用于葡萄糖氧化酶生產的方法，其特征在于以權利要求I所述酵母工程菌為生產菌株，活化后，將30°C、200rpm下培養到OD6tltl在I. 6-1. 7之間的種子以2%的接種量轉入基本發酵培養基，于30°C、200rpm條件下培養；種子和基本發酵培養基為YPDS培養基組成為胰蛋白胨20g/L，酵母抽提物10g/L，葡萄糖20g/L，山梨醇168g/L ;斜面培養基添加瓊脂20g/L。
全文摘要
本發明公開了一種產葡萄糖氧化酶酵母工程菌及構建方法與應用，屬于基因工程技術領域。本發明采用重組DNA技術將黑曲霉的葡萄糖氧化酶(GOD)基因克隆連接到畢赤酵母表達載體pGAPZα，并轉化Pichia pastoris X33，經篩選鑒定得到一株可以產較高活性葡萄糖氧化酶的重組畢赤酵母Pichia pastoris X33-pGAPZα-GOD，保藏編號為CCTCC NOM2012267。該菌株表達的葡萄糖氧化酶在搖瓶中的酶活為23U/mL，比野生菌的酶活提高了近11倍，為葡萄糖氧化酶的大規模生產及作為食品添加劑在淀粉中的應用奠定了良好的基礎。
文檔編號C12N15/81GK102925375SQ201210350000
公開日2013年2月13日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者陳堅, 顧磊, 張娟, 堵國成, 沈依娜, 李夢潔, 李婷, 王丹, 丁雪, 殷政 申請人:江南大學