專利名稱：產n-乙酰神經氨酸的基因工程菌及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌及其構建方法與應用。
背景技術：
N-乙酸神經氨酸(N-acetyl-D-neuraminic acid,Neu5Ac)是唾液酸家族中最有代表性的成員，由9個碳原子組成的吡喃糖，具有廣泛的生物學功能，在治療流感、神經性疾病、炎癥和腫瘤等方面具有重要的醫藥價值，具有廣泛的應用前景和較高的市場價值，特別是在流感(包括禽流感H5N1和2009年的HlNl)的預防和治療方面有良好的效果。目前，N-乙酰神經氨酸的來源有限，工業化生產研究較少，傳統的生產方法導致其價格昂貴，大大限制了相關的研發和應用。N-乙酰神經氨酸可從天然物質(比如燕窩、牛奶或者禽蛋)中提取，但由于含量低，分離純化工藝復雜，N-乙酰神經氨酸產量低、純度也極低，因此難以用于大工業化生產。由于N-乙酰神經氨酸及其衍生物結構復雜，化學合成法合成N-乙酰神經氨酸需要繁多的保護和去保護步驟，反應條件苛刻，需要銦等貴重金屬作為催化劑，并形成大量的中間產物，分離過程復雜困難，造成N-乙酰神經氨酸價格昂貴。自1957年Barry和Goebel首先在大腸桿菌K-235中發現聚唾液酸后，人們陸續在腦膜炎奈瑟菌、沙門氏菌中發現聚唾液酸，聚唾液酸是N-乙酰神經氨酸的同聚物，經酸水解或者酶水解后，分離純化可得N-乙酰神經氨酸，微生物發酵產聚唾液酸，容易實現規模化，在唾液酸生產中占據了重要的地位，但存在酸水解對環境不友好、酶解成本較高的問題。N-乙酰神經氨酸可通過酶法合成，N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸在N-乙酰神經氨酸醛縮酶(Neu5Ac lyase or Neu5Acaldolase, NanA, EC4.1. 3. 3)作用下生成 N-乙酸神經氨酸。但是ManNAc的價格昂貴，難以適用于工業化生產。研究發現，GlcNAc_2-異構酶(GlcNAc2-epimerase, AGE,EC5.1. 3 . 8)可催化 GlcNAc 異構化生成 ManNAc。通過 GlcNAc-2-異構酶和N-乙酰神經氨酸醒縮酶兩步酶法反應實現Neu5Ac的生產。GlcNAc異構化生成ManNAc的酶反應需要ATP作為激活劑，導致酶法合成成本高。近幾年來，研究人員將重組表達GIcNAc2-異構酶和N-乙酰神經氨酸醛縮酶(或N-乙酰神經氨酸合成酶)的兩種大腸桿菌細胞作為生物催化介質,生物轉化GlcNAc生產Neu5Ac。這種方法不用分離純化酶，同時由于細胞膜的保護，酶相對更穩定，輔助因子容易再生。但由于需要分別培養兩種表達不同酶的菌，將菌體濃縮后進行混合，這種模式難以工業化，同時底物和產物多次進出細胞，受到細胞壁的屏障，從而影響了催化反應效率和轉化率。從以上幾種合成N-乙酰神經氨酸的方法可以看出，現有生產方法產量低，成本高，難以規模化擴大，導致Neu5Ac的生產力水平低下，難以滿足未來市場需求。迫切需要利用工業生物技術構建代謝工程菌，實現Neu5Ac的經濟高效生產。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種制備產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌方法。本發明所提供的制備產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌方法，包括如下步驟將與N-乙酰神經氨酸合成相關的基因導入宿主菌得到產N-乙酰神經氨酸的重組菌；所述與N-乙酰神經氨酸合成相關的基因為N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的編碼基因和N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因。所述宿主菌為大腸桿菌或所述大腸桿菌的基因敲除突變體；所述基因敲除突變體為將大腸桿菌中N-乙酰神經氨酸轉運蛋白編碼基因、N-乙酰甘露糖胺激酶編碼基因和N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向異構酶編碼基因中的至少一個基因敲除后得到的。所述N-乙酸神經氨酸轉運蛋白的Genbankprotein id:AAC76256. 2 ；VERSI0N G1:87082231 ;
公開日:2011. 09. 01 ；所述N-乙酰甘露糖胺激酶的 Genebank protein id:AAC76254. 2 ；VERSI0N G1:
87082230;
公開日:2011. 09. 01 ；所述N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向異構酶的Genebank protein id:AAC76255.1 ；VERSIONG1:1789617 ;
公開日:2011. 09. 01。所述N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的氨基酸序列如序列表中序列I所示；所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶為如下1)-10)中任一所示I)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

2)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示；3)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示；4)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示；5)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示；6)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由I)衍生的蛋白質；7)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由2)衍生的蛋白質；8)將序列表中序列4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由3)衍生的蛋白質；9)將序列表中序列5所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由4)衍生的蛋白質；10)將序列表中序列6所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由5)衍生的蛋白質。所述N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示；所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶為如下a)或b)或c)或d)或e)所示a)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因為序列表中序列8所示的DNA分子或與序列表中序列8所示的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的DNA分子；b)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因為序列表中序列9所示的DNA分子或與序列表中序列9所示的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的DNA分子；
c)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因為序列表中序列10所示的DNA分子或與序列表中序列10所示的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的DNA分子；d)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因為序列表中序列11所示的DNA分子或與序列表中序列11所示的DNA分子具有90 %以上的同源性且編碼所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的DNA分子；e)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因為序列表中序列12所示的DNA分子或與序列表中序列12所示的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的DNA分子。所述與N-乙酰神經氨酸合成相關的基因是通過重組載體導入宿主菌的；所述宿主菌為大腸桿菌K12或大腸桿菌K12 Δ nanT或大腸桿菌K12 Δ nanK或大腸桿菌 K12 AnanTEK ；所述大腸桿菌K12 AnanTEK為在大腸桿菌K12中敲除了 N-乙酰神經氨酸轉運蛋白編碼基因、N-乙酰甘露糖胺激酶編碼基因和N-乙酰甘露糖胺6-磷酸差向異構酶編碼基因得到的基因工程菌。所述N-乙酸神經氨酸轉運蛋白的Genbankprotein id:AAC76256. 2 ；VERSI0N G1:
87082231;
公開日:2011. 09. 01 ；所述N-乙酰甘露糖胺激酶的 Genebank protein id:AAC76254. 2 ；VERSI0N G1:87082230 ;
公開日:2011. 09. 01 ；
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所述N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向異構酶的Genebank protein id:AAC76255.1 ；VERSIONG1:1789617 ;
公開日:2011. 09. 01。由所述方法制備得到的基因工程菌也屬于本發明的保護范圍。所述基因工程菌在制備N-乙酰神經氨酸中的應用也屬于本發明的保護范圍。本發明的另一個目的是提供一種制備N-乙酰神經氨酸的方法。本發明所提供的制備N-乙酰神經氨酸的方法，包括如下步驟發酵所述基因工程菌，得到表達N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶和N-乙酰神經氨酸醛縮酶的菌體細胞，用所述菌體細胞催化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經氨酸。含有N-乙酰葡萄糖胺2_異構酶的編碼基因和N-乙酰神經氨酸醒縮酶的編碼基因的重組表達載體也屬于本發明的保護范圍。所述N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的氨基酸序列如序列表中序列I所示；所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶為如下1)-10)中任一所示I)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示；2)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示；3)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示；4)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示；5)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示；6)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由I)衍生的蛋白質；7)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由2)衍生的蛋白質；8)將序列表中序列4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由3)衍生的蛋白質；9)將序列表中序列5所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由4)衍生的蛋白質；10)將序列表中序列6所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由5)衍生的蛋白質。所述重組表達載體為將所述N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的編碼基因和N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編基因插入PBADhisB載體的多克隆位點得到的重組表達載體；本發明所提供的產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌，可以減少底物傳輸障礙，提高催化效率；同時利用代謝工程(Metabolic engineering)原理,進行菌種改造,消除產生副產物的途徑及N-乙酰神經氨酸降解途徑，則可大大提高N-乙酰神經氨酸的累積。利用該基因工程菌生產N-乙酰神經氨酸，具有以下優點所用原料相對低廉，易于工業化大規模生產，因而將在今后N-乙酰神經氨酸的生產中占據了重要的地位。


圖1為N-乙酰神經氨酸代謝途徑。圖2為重組載體pEcNA的示意圖。圖3為N-乙酰神經 氨酸標準品的HPLC圖譜。圖4為轉化產物的HPLC圖譜。圖5為產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌中AGE和nanA蛋白的電泳檢測結果。圖6為大腸桿菌K12的基因組部分結構示意圖。圖7為大腸桿菌工程菌K12 AnanTEK的基因組部分結構示意圖。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。N-乙酰神經氨酸代謝途徑如圖1所示。實施例1、構建產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌一、構建協同表達N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶和N-乙酰神經氨酸醛縮酶重組質粒1、構建重組質粒pEcNA以發光藍細菌Anabaena sp. PCC7120基因組為模板，設計一對引物(Pl和P2)，擴增得到帶有RBS及其間隔序列的N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的編碼基因(GlcNAc 2-異構酶的編碼基因，即age基因)，片段大小約1200bp，與目的片段相符，經測序分析，結果表明擴增得到的序列與NCBI上編號為BA000019. 2的age基因序列相同，age基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示，該核苷酸序列所編碼的N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的氨基酸序列如序列表中序列I所示。將age基因用EcoRI和Hind III酶切后，回收age基因片段；將pBADhisB載體(購自invitrogen公司)也用EcoRI和Hind III酶切后，回收載體大片段；將回收的age基因片段與載體大片段進行連接，方法如下將T4 DNA連接酶buffer 2. 5 μ I加入滅菌的PCR管中，加入回收的pBADhisB DNA片段1μ I和目的片段age DNA 7“1，加入了4 DNA連接酶Ιμ ，加入ddH20 13. 5μ 1，16°C反應2小時，得到重組質粒pAge。用EcoRI和Hind III酶切重組質粒pAge,回收1167bp的age基因片段。以大腸桿菌(Escherichia coli) K12基因組DNA為模板，設計一對引物(P3和P4)，擴增得到EcnanA基因，經測序分析，結果表明擴增得到的序列與NCBI上編號為CP001637.1的nanA基因序列相同，EcnanA基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示，該核苷酸序列所編碼的N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。將EcnanA基因用NcoI和EcoRI酶切后，回收EcnanA基因片段；將pBADhisB載體(購自invitrogen公司)也用NcoI和EcoRI酶切后，回收載體大片段；將EcnanA基因與載體大片段進行連接，方法如下將T4 DNA連接酶buffer 2. 5 μ I加入滅菌的PCR管中，加入回收的pBADhisB DNA片段I μ I和目的片段EcnanA DNA 7 μ I，加入T4DNA連接酶I μ I，加入ddH20
13.5 μ 1，16°C反應2小時。得到重組質粒pEcnanA。

用NcoI和EcoRI酶切重組質粒pEcnanA,回收約900bp的EcnanA DNA片段；用NcoI和EcoRI酶切重組質粒pAge，回收約5IOObp的pAge (N/E)DNA片段。將T4 DNA連接酶buffer 2. 5 μ I加入滅菌的PCR管中，加入回收的pAge (N/E) DNA片段I μ I和EcnanADNA片斷7 μ 1，加入Τ4 DNA連接酶I μ 1，加入ddH20 13. 5 μ 1，16°C反應2小時。將連接產物轉化DH5a (購自Takara，產品目錄號為D9057A)，氨卞青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆，將陽性克隆進行液體培養，提取陽性克隆質粒，進行酶切驗證，結果表明age基因和NanA基因串聯插入pBADhisB的多克隆位點中，即894bp的EcnanA基因插入pBADhisB載體的NcoI和EcoRI酶切位點間，1167bp的age基因插入pBADhisB載體的EcoRI和Hind III酶切位點間，說明重組載體構建正確，將該重組載體命名PEcNA (圖2 )。引物序列如下Pl :5’ -CCGGAATTCAAGGAGATATAATGGGGAAAAACTTACAAGC-3’P2 :5， -CCCAAGCTTTTAACTCAAGGCCTCGAAT-3，P3 :5， -CGGAATTCTCACCCGCGCTCTTGCATC-3’P4 :5，-CATGCCATGGCAACGAATTTACG-3’2、構建重組質粒pPaNA以乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici)基因組為模板，擴增得到PananA基因，經測序分析，結果表明擴增得到的PananA基因的核苷酸序列如序列表中序列9所示，該核苷酸序列所編碼的N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示。除將EcnanA基因替換為PananA基因外，重組質粒pPaNA的構建方法與上述重組質粒pEcNA的構建方法相同。3、構建重組質粒pSaNA以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因組為模板,擴增得到SananA基因，經測序分析，結果表明擴增得到的SananA基因的核苷酸序列如序列表中序列10所示，該核苷酸序列所編碼的N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示。除將EcnanA基因替換為SananA基因外，重組質粒pSaNA的構建方法與上述重組質粒pEcNA的構建方法相同。
4、構建重組質粒pSdNA以痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)基因組為模板,擴增得到SdnanA基因。經測序分析，結果表明擴增得到的SdnanA基因的核苷酸序列如序列表中序列11所示，該核苷酸序列所編碼的N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示。除將EcnanA基因替換為SdnanA基因外，重組質粒pSdNA的構建方法與上述重組質粒pEcNA的構建方法相同。5、構建重組質粒pSmNA以苜猜中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)基因組為模板,擴增得到SmnanA基因，經測序分析，結果表明擴增得到的SmnanA基因的核苷酸序列如序列表中序列12所示，該核苷酸序列所編碼的N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的氨基酸序列如序列表中序列6所
/Jn ο除將EcnanA基因替換為SmnanA基因外，重組質粒pSmNA的構建方法與上述重組質粒pEcNA的構建方法相同。二、構建敲除N-乙酰神經氨酸分解代謝途徑關鍵基因的大腸桿菌K12 Δ nanTEK大腸桿菌K12的基因組部分結構示意圖見圖6所示，設計引物nanT(PlHl)和nanK(P2H2)，引物5'端有50bp的擬敲除基因的同源臂(引物序列下劃線部分)，3 '端為擴增引物，以質粒PKD13 (購自Clontech公司)為模板，擴增兩側含FRT位點的卡那霉素抗性基因。將pKD46質粒(購自Clontech公司)通過氯化I丐轉化法轉化至大腸桿菌K12 (公眾可從中國科學院微生物研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻是=TomoyaBaba, Takeshi Ara, Miki Has`egawa, Yuki Takai, Yoshiko Okumura, Miki Baba, KirillA Datsenko, Masaru Tomita, Barry L Wanner, and Hirotada Mori1. Constructionof Escherichia coli K—12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keiocollection. Molecular Systems Biology (2006) : 1-11.)，得到含有質粒pKD46 的大腸桿菌K12的感受態細胞。含有質粒pKD46的大腸桿菌K12，在阿拉伯糖誘導后，表達λ噬菌體的3個重組蛋白，宿主菌就具有了同源重組的能力。將擴增得到的卡那霉素抗性基因線性片段電轉入含有質粒PKD46的大腸桿菌Κ12的感受態細胞，利用卡那霉素平板篩選到陽性轉化體。再利用表達Flp重組酶的質粒pCP20 (購自Clontech公司)，將FRT位點之間的卡那霉素抗性基因刪除。利用該重組系統，構建了 N-乙酰神經氨酸轉運蛋白編碼基因(sialicacid transporter, nanT, Genbank protein id:AAC76256. 2 ；VERSI0N G1:87082231 ;
公開日2011. 09. 01)、N-乙酸甘露糖胺激酶編碼基因(N-acetylmannosamine kinase, nanK.Genebank protein id:AAC76254. 2 ；VERSI0N G1:87082230 ;
公開日2011. 09. 01)和 N-乙酸甘露糖胺_6_憐酸差向異構酶編碼基因(N-acetylmannosamine-6-P epimerase, nanE,Genebank protein id:AAC76255.1 ;VERSION G1:1789617 ;
公開日:2011. 09. 01)缺失的大腸桿菌工程菌。通過引物對(nanA-Pl和yhcH-R)擴增得到一個約1400bp的片段，經測序分析獲得的大腸桿菌工程菌的基因組上沒有nanT、nanE和nanK，說明nanTEK已成功敲除，其基因組部分結構示意圖見圖7所示。將獲得的大腸桿菌工程菌命名為K12 Λ nanTEK，編號TLOOl，即得到大腸桿菌TLOOl。引物序列如下5， -TTTTCATACCAAAGCGTGTGGGCATCGCCCACCGCGGGAG
nanT (PlHl)ACTCACAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’5， -AGACGGTAATGACTGTACTTCACCCATCATCATAATTTTTCnanK (P2H2)TCCCTGGGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3>nanA-Pl CCGGAATTCATGGCAACGAATTTACGyhcH-R CTTCACACTGACGCGCAGTG三、構建產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌1、構建基因工程菌TL004將重組質粒pEcNA用氯化鈣法轉化大腸桿菌TL001，在氨卞青霉素平板上篩選陽性克隆子，將得到的陽性克隆子命名為PEcNA/Λ TEK，再用蛋白電泳驗證，結果見圖5 (圖5中，泳道I為陽性克隆子pEcNA/Λ TEK細胞破碎上清)，從圖中可見，AGE (39KD)和nanA(32KD)兩個蛋白都有表達，說明菌株正確，得到產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌pEcNA/TL001，菌株編號為TL004。2、構建基因工程菌TL005將重組質粒pPaN A用氯化鈣法轉化大腸桿菌TL001，在氨卞青霉素平板上篩選陽性克隆子，將得到的陽性克隆子命名為PPaNA/Λ TEK，結果見圖5 (圖5中，泳道4為陽性克隆子pPaNA/Λ TEK細胞破碎上清)，從圖中可見，AGE (39KD)和nanA (32KD)兩個蛋白都有表達，說明菌株正確，得到產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌pPaNA/TLOOl，菌株編號為TL005。3、構建基因工程菌TL006將重組質粒pSaNA用氯化鈣法轉化大腸桿菌TL001，在氨卞青霉素平板上篩選陽性克隆子，將得到的陽性克隆子命名為PSaNA/Λ TEK，結果見圖5 (圖5中，泳道2為陽性克隆子pSaNA/Λ TEK細胞破碎上清)，從圖中可見，AGE (39KD)和nanA (32KD)兩個蛋白都有表達，說明菌株正確，得到產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌pSaNA/TLOO I，菌株編號為TL006。4、構建基因工程菌TL007將重組質粒pSdNA用氯化鈣法轉化大腸桿菌TL001，在氨卞青霉素平板上篩選陽性克隆子，將得到的陽性克隆子命名為PSdNA/Λ TEK，結果見圖5 (圖5中，泳道5為陽性克隆子pSdNA/Λ TEK細胞破碎上清)，從圖中可見，AGE (39KD)和nanA (32KD)兩個蛋白都有表達，說明菌株正確，得到產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌pSdNA/TLOOl，菌株編號為TL007。5、構建基因工程菌TL008將重組質粒pSmNA用氯化鈣法轉化大腸桿菌TL001，在氨卞青霉素平板上篩選陽性克隆子，將得到的陽性克隆子命名為PSmNA/Λ TEK，結果見圖5 (圖5中，泳道3為陽性克隆子pSmNA/Λ TEK細胞破碎上清)，從圖中可見，AGE (39KD)和nanA (32KD)兩個蛋白都有表達，說明菌株正確，得到產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌pSmNA/TLOOl，菌株編號為TL008。6、構建基因工程菌TL002將重組質粒pEcNA用氯化|丐法轉化大腸桿菌K12 Δ nanT (購自國立遺傳學研究所(NIG，Japan)，得到產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌pEcNA/Λ nanT，菌株編號為TL002。7、構建基因工程菌TL003將重組質粒pEcNA用氯化I丐法轉化大腸桿菌K12 Δ nanK (購自國立遺傳學研究所(NIG, Japan)，得到產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌pEcNA/Λ nanK，菌株編號為TL003。8、構建基因工程菌pEcNA/K12將重組質粒pEcNA用氯化鈣法轉化大腸桿菌K12，得到產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌 pEcNA/K12。實施例2、利用產N-乙酰神經氨酸基因工程菌的制備產N-乙酰神經氨酸一、產N-乙酰神經氨酸基因工程菌的誘導自誘導培養將產N-乙酰神經氨酸的代謝工程菌基因工程菌TL004、TL005、TL006、TL007、TL008、TL002、TL003和pEcNA/K12劃線到含有質量百分比濃度為1. 5%的瓊脂和含50 μ g/mL的氨卞青霉素LB平板上，37°C培養12h。挑取平板上所長的單克隆，接種到含80 μ g/mL氨卞青霉素的液體LB培養基中，37°C過夜振蕩培養，轉速250rpm ;將過夜培養物以體積百分比為I %的接種量接種至自誘導培養基ZYM中，37°C振蕩培養，轉速250rpm，培養時間16h。自誘導培養基 ZYM 配方如下100mLA+2mL B+2mL C+200 μ L D+ΙΟΟμ L E (以下均
為質量百分比濃度)；A. ZY 1%胰蛋白胨，O. 5%酵母粉；B. 50 XM :1. 25M Na2HPO4,1. 25M KH2PO4, 2. 5M NH4Cl 和 O. 25M Na2SO4 ；C. 50X5052 :25% 甘油，2. 5% 葡萄糖，10%L_ 阿拉伯糖；D-1MMgSO4;E. 1000X 微量元素50Mm FeCl3, 20mM CaCl2, IOmM MnCl2, IOmM ZnSO4, CoCl2,NiCl2' Na2Mo4' Na2SeO3 和 H3BO3 各 2mM。二、生物轉化制備N-乙酰神經氨酸誘導后的細胞，于4°C，8000轉/分鐘，離心5 15min，用質量百分濃度為O. 85%氯化鈉水溶液洗滌2次后以相同的離心條件收集菌體。重懸于適當體積的轉化底物液(30mMPKB緩沖液；0. 2 1. OM N-乙酰葡萄糖胺；0. 4 1. 4M丙酮酸;0· I 1% Triton X_100(體積百分比濃度)中，30°C，200轉/分鐘，pH7，轉化16h，得到轉化液。將得到的轉化液于4°C，12000轉/分鐘，離心5min，取上清，用O. 22 μ m的濾膜過濾后，用HPLC檢測N-乙酰神經氨酸的產量。HPLC采用Agilent 1200高效液相色譜儀(配四元泵、DAD檢測器和工作站)。色譜條件Aminex HPX-87H column (300 X 7. 8mm);流動相6mMH2S04，流速0. 55ml mirT1，柱溫65° C ;進樣量10 μ L，檢測波長210nm。N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)標準品購自sigma公司。實驗設三次重復,結果取平均值。結果N-乙酰神經氨酸標準品的HPLC圖譜如圖3所示，從圖中可見，N-乙酰神經氨酸標準品的保留時間為8. 5。轉化產物的HPLC圖譜如圖4所示，從圖中可見，保留時間為
8.5處為N-乙酸神經氨酸(Neu5Ac)的峰；9· 9min處為pyruvate的峰；11. 7min處為ManNAc的峰；12. 4min處為GlcNAc的峰。N-乙酰神經氨酸的產量如下基因工程菌TL004為200mM、基因工程菌TL005為32. 6mM、基因工程菌TL006為200mM、基因工程菌TL007為194. 8mM、基因工程菌為TL008為
7.2mM、基因工程菌TL002為123. 9mM、基因工程菌TL003為118. 9mM和基因工程菌pEcNA/K12為118. 3mM。N-乙酰神經氨酸產量最高達到200mM (61. QgF1)，生產強度3. QgFV1,從N-乙酰葡萄糖胺計算的轉化率為50%。
從以上結果可見，轉化同一重組質粒pEcNA的基因工程菌TL004、基因工程菌TL002、基因工程菌TL003和基因工程菌pEcNA/K12中，基因工程菌TL004的N-乙酰神經氨酸的產量最高，此結果說明DEnanTEK有效阻斷了 N-乙酰神經氨酸的分解途徑，有利于N-乙酰神經氨 酸的生產。
權利要求
1.一種制備產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌方法，包括如下步驟將與N-乙酰神經氨酸合成相關的基因導入宿主菌得到產N-乙酰神經氨酸的重組菌；所述與N-乙酰神經氨酸合成相關的基因為N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的編碼基因和N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于 所述宿主菌為大腸桿菌或所述大腸桿菌的基因敲除突變體； 所述基因敲除突變體為將大腸桿菌中N-乙酰神經氨酸轉運蛋白編碼基因、N-乙酰甘露糖胺激酶編碼基因和N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向異構酶編碼基因中的至少一個基因敲除后得到的。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于 所述N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的氨基酸序列如序列表中序列I所示； 所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶為如下1)-10)中任一所示 1)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示； 2)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示； 3)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示； 4)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示； 5)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示； 6)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由I)衍生的蛋白質； 7)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由2)衍生的蛋白質； 8)將序列表中序列4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由3)衍生的蛋白質； 9)將序列表中序列5所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由4)衍生的蛋白質； 10)將序列表中序列6所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由5)衍生的蛋白質。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于 所述N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示； 所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶為如下a)或b)或c)或d)或e)所示 a)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因為序列表中序列8所示的DNA分子或與序列表中序列8所示的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的DNA分子； b)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因為序列表中序列9所示的DNA分子或與序列表中序列9所示的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的DNA分子； c)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因為序列表中序列10所示的DNA分子或與序列表中序列10所示的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的DNA分子；d)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因為序列表中序列11所示的DNA分子或與序列表中序列11所示的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的DNA分子； e)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因為序列表中序列12所示的DNA分子或與序列表中序列12所示的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的DNA分子。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 所述與N-乙酰神經氨酸合成相關的基因是通過權利要求9或10所述的重組載體導入宿主菌的； 所述宿主菌為大腸桿菌K12或大腸桿菌K12 Δ nanT或大腸桿菌K12 Δ nanK或大腸桿菌Kl2 AnanTEK ； 所述大腸桿菌K12 ΔnanTEK為在大腸桿菌K12中敲除了 N-乙酰神經氨酸轉運蛋白編碼基因、N-乙酰甘露糖胺激酶編碼基因和N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向異構酶編碼基因得到的基因工程菌。
6.由權利要求1-5中任一所述的方法制備得到的基因工程菌。
7.權利要求6所述的基因工程菌在制備N-乙酰神經氨酸中的應用。
8.一種制備N-乙酰神經氨酸的方法，包括如下步驟 發酵權利要求6所述的基因工程菌，得到表達N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶和N-乙酰神經氨酸醛縮酶的菌體細胞，用所述菌體細胞催化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經氨酸。
9.含有N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的編碼基因和N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因的重組表達載體； 所述N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的氨基酸序列如序列表中序列I所示； 所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶為如下1)-10)中任一所示 .1)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示； .2)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示； .3)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示； .4)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示； .5)所述N-乙酰神經氨酸醛縮酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示； .6)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由1)衍生的蛋白質； .7)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由2)衍生的蛋白質； .8)將序列表中序列4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由3)衍生的蛋白質； .9)將序列表中序列5所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由4)衍生的蛋白質； .10)將序列表中序列6所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經氨酸醛縮酶活性的由5)衍生的蛋白質。
10.根據權利要求9所述的重組表達載體，其特征在于 所述重組表達載體為將所述N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的編碼基因和N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因插入PBADhisB載體的多克隆位點得到的重組表達載體。
全文摘要
本發明公開了產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌及其構建方法與應用。本發明所提供的制備產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌方法，包括如下步驟將與N-乙酰神經氨酸合成相關的基因導入宿主菌得到產N-乙酰神經氨酸的重組菌；所述與N-乙酰神經氨酸合成相關的基因為N-乙酰葡萄糖胺2-異構酶的編碼基因和N-乙酰神經氨酸醛縮酶的編碼基因。利用本發明所構建的產N-乙酰神經氨酸的基因工程菌生產N-乙酰神經氨酸，具有以下優點所用原料相對低廉，易于工業化大規模生產，因而將在今后N-乙酰神經氨酸的生產中占據了重要的地位。
文檔編號C12N1/21GK103060358SQ20121034962
公開日2013年4月24日 申請日期2012年9月19日 優先權日2011年10月20日
發明者林白雪, 張子娟, 陶勇 申請人:中國科學院微生物研究所