專利名稱：一種水稻光敏核不育系的分子檢測方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及利用2對光敏基因引物和2種核酸內切酶檢測光敏核不育系的方法及試劑盒。
背景技術：
雜交水稻的推廣應用已經極大地促進了全球稻米產量的増加。光敏核不育系(PGMS)是兩系農作物雜交種的核心部分。利用光敏核不育系進行的雜交水稻制種已獲得了非常成功的發展并得到廣泛應用。因而在雜交水稻育種中不育系的鑒定是非常重要的一環。光溫條件控制水稻育性轉換的分子機制的研究目前已經取得了 很大的進展。大部分真核生物的基因組序列轉錄成了長的非編碼RNA (lncRNAs)。其中長日特定雄性育性相關RNA (LDMAR)調節水稻的PSMS。在長日條件下植物正常花粉的發育需要足夠數量的LDMAR的轉錄。野生型和突變體之間的單核苷酸多態性(SNP)改變了 LDMAR的ニ級結構。在長日條件下，導致了發育中的花粉過早的細胞程序化死亡(PCD)，從而導致PSMS。有研究表明“農墾58S”光敏不育性主要受第12染色體的一個主效基因座pmsl2-l控制。在正常水稻中，野生型PMS12-1的表達抑制了光敏不育的發生。PMS12-1編碼了ー個獨特的非編碼RNA，產生ー個名為osa-smR5864w的21個核苷酸的小分子RNA。與正常水稻品種相比，光敏不育水稻中pmsl2-l發生了 C-G的一個替換，該突變影響了小RNA的表達水平及其可能與靶基因的互作能力而產生雄性不育，是構成粳稻光敏核不育系的原因。目前進行光敏核不育系鑒定的主要方法是花粉鏡檢法和自交結實法。其中花粉鏡檢法因為直觀、操作簡便和成本低可用于大群體鑒定而成為目前進行不育系鑒定的主要方法。但這一方法存在如下一些缺點水稻生育期太長而受時間限制、育性劃分模糊和較難判斷。光敏核不育系是因為pmsl2-l的點突變所致，與正常水稻相比，突變體發生了 C-G的一個替換，這為依據pmsl2-l的基因序列來鑒定光敏核不育系提供了依據。而對單堿基多態性位點的檢測有賴于操作簡便、結果明了的檢測方法。較常見的單堿基多態性位點的檢測方法包括測序、SSCP、RFLP等方法。這些方法雖各有優點，但也各有其不足之處。測序可以直接測出DNA序列中的所有突變位點的堿基替代情況，但該方法需要昂貴的儀器和較長的步驟，成本較高；SSCP方法較為成熟，但操作繁瑣，耗時長，結果易造成誤判；PCR-RFLP方法要求待測多態性位點和某一酶切位點相關。

發明內容
本發明的目的是為了快速準確的檢測出水稻材料是否為光敏核不育系，從而提供ー種光敏核不育系的分子檢測方法及檢測試劑盒，本發明方法可根據特異引物和核酸內切酶來鑒定光敏核不育系。本發明的目的是通過以下方式實現的—種水稻光敏核不育系的分子檢測方法，包括如下步驟
a.抽提水稻葉片中基因組總DNA ;b.任選以下一對引物對提取的基因組總DNA進行PCR擴增；GC-Dl 正向引物GCATGCTTCACCAGCACGTCCA，反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG；GC-D2 正向引物CCCATATATCTTGTCCAGTGCT，反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG；c.將擴增產物用核酸內切酶進行酶切；如用引物GC-Dl擴增得到的PCR產物用核酸內切酶RsaI進行酶切；如用引物GC-D2擴增得到的PCR產物用核酸內切酶AccI進行酶切；d.由酶切產物的帶譜推出該基因的SNP如果是G，則該材料為光敏核不育系；SNP如果是C，則不是光敏核不育系。所述的步驟d中用RsaI酶切，如果SNP是G，得到381bp、224bp和108bp3個條帶；如果SNP是C，得到605bp和108bp2個條帶；用AccI酶切，如果SNP是G，無酶切產物；如果SNP是C，得到443bp和334bp2個條帶。一種水稻光敏核不育系的分子檢測試劑盒，包括引物GC-D I:正向引物GCATGCTTCACCAGCACGTCCA，反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG，和核酸內切酶RsaI;
或者引物GC-D2:正向引物CCCATATATCTTGTCCAGTGCT，反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG，和核酸內切酶AccI;或者以上兩對引物和兩種核酸內切酶。本發明的試劑盒還包括用于PCR擴增和酶切的常規試劑。本發明的技術效果在于1)本發明從分子水平建立了一個檢測光敏核不育系的方法及檢測工具，傳統的鑒定水稻育性的方法主要是根據花粉育性觀察來判斷的，但是水稻生育期長，因而從花粉育性來判別的話耗時長，也不利于材料的合理利用。本發明利用光敏核不育材料的野生型和突變體之間光敏基因的單核苷酸多肽性(SNP)來判斷其是否為光敏核不育系。這就可以直接在苗期來對光敏水稻材料的育性進行檢測。隨著育種的推迸，很多不育系的來源屬于光敏還是溫敏已變得模糊，通過本方法可準確地檢測出不育材料是否為光敏不育系或光敏不育來源，從而更好地引導育種。2)本發明中根據農墾58Spmsl2-l設計的2對引物和核酸內切酶可以準確地檢測出單堿基多態性位點。只需根據酶切產物就可檢測出該光敏基因的SNP是C還是G，從而鑒定該材料的育性，為光敏核不育系的鑒定提供了有力的鑒定依據。相對于其它單堿基多態性位點檢測方法，PCR-RFLP耗時短、操作簡単、不需測序，這樣就可以節約成本。
下面結合附圖和具體實施例對本發明作進ー步的說明，而不會造成對本發明的限制。


圖I為GC-D1、GC-D2引物對不同不育系及可育系對照組的PCR擴增結果。I:農墾 58; 2:農墾 58S;3:安農 N ;4 :安農 S-I ；5 :培矮 64S ；6 :雙 88S ；7 Y58S ；8 :株 1S。圖2為用RsaI和AccI兩種核酸內切酶對不同不育系及可育系對照組PCR產物的酶切結果。I:農墾58; 2:農墾58S;3:安農N;4 :安農S-I ；5 :培矮64S ；6 :雙88S ；7 Y58S ；8 :株 1S。
具體實施例方式實施例I : 選用的水稻材料為農墾58、農墾58S、安農N、安農S_l、培矮64S、雙88S、Y58S、株IS和農墾58SX農墾58的Fl種子(以上均是常見和公知的水稻品種，本領域技術人員均知曉這些品種是否屬于光敏不育植株)，按照常規DNA抽提方法從幼苗葉片中抽提出符合質量要求的基因組總DNA。選用GC-D1、GC-D2共2個引物進行PCR擴增和檢測，并分別用內切酶對PCR產物進行酶切和檢測。獲得的圖片結果與實驗預期完全一致，再根據野生型和突變型之間光敏基因的單堿基核苷酸差異，由酶切產物的帶譜推導出該基因的SNP是C還是G，最終從分子水平上檢測出水稻樣本是否為光敏不育植株。(I)水稻葉片DNA的抽提選用的水稻材料為農墾58、農墾58S、安農N、安農S_l、培矮64S、雙88S、Y58S、株IS和農墾58SX農墾58的Fl種子，8個材料葉片DNA的抽提均按照Murry等CTAB的方法。取O. 5g幼苗葉片放入研缽中，用液氮研磨至粉末狀，然后迅速轉移至I. 5ml離心管；加入 65°C預熱的 700 μ I 提取液(IOOmMTris-Hcl (ΡΗ8. O), 20mM EDTA (PH8. O)，I. 4M Nacl，2%CTAB，調至PH8. 0，加入2ml疏基こ醇，用超純水定容至1L)，輕輕混勻，在65°C水浴30 40min，冷卻至室溫；加入等體積的氯仿/異戊醇(24 :1)，溫和上下顛倒離心管數次；4°C、12000rpm離心IOmin ;取上清液，轉入新的離心管，并加等體積的氯仿/異戊醇，離心取上清，加入450 μ I預冷的異丙醇；-20°C放置I. 5h ;4°C、12000rpm離心IOmin ;用70%こ醇漂洗DNA沉淀2 3次，在超凈工作臺上風干，加入50 μ I TE溶解，_20°C保存備用。按照常規DNA抽提方法，可以從水稻葉片中抽提出符合質量要求的基因組總DNA。
(2) PCR擴增及檢測分析以不同材料的基因組DNA為模板，選用GC-Dl和GC-D2這2對引物。PCR擴增反應系統成分為2 X Buffer :10 μ I ；dNTP(2mM) :4 μ I ;引物(IOmM) 1. 2μ I ； Taq SI (lu/μ I)
O.4μ I ;模板DNA :1 μ I ；ddH20 :3. 4 μ 1，總體積20 μ I。擴增程序為94°C變性2分鐘，然后980C 10秒，520C 30秒，68°C I分鐘進行35個循環，降溫到4°C，完成PCR擴增程序。GC-Dl Forward primer GCATGCTTCACCAGCACGTCCAReverse primer TAGCTTGCTTCATCTTGGTATGProduct length 713bp。
GC-D2 Forward primer CCCATATATCTTGTCCAGTGCTReverse primer TAGCTTGCTTCATCTTGGTATGProduct length 777bp。瓊脂糖凝膠電泳1%的瓊 脂糖，120V電壓電泳30分鐘后，用凝膠成像儀拍照(圖I)。(3) PCR產物的酶切及分析用GC-Dl擴增得到的PCR產物用核酸內切酶RsaI (GT/AC)進行酶切；用GC-D2擴增得到的PCR產物用核酸內切酶AccI(GT/MKAC)進行酶切。酶切反應體系為=IOXBuffer 2μ I ;PCR 產物5μ I ;內切酶(均為 IOu/μ I) 0. 5μ I ；ddH20 :12. 5 μ 1，總體積 20 μ I。反應程序為37°C，4小吋。酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳(圖2)，獲得的結果與預期一致用RsaI (GT/AC)酶切，如果SNP是G，得到381bp、224bp和108bp這3個條帶；如果SNP是C，得到605bp和108bp2個條帶。用AccI (GT/MKAC)酶切，如果SNP是G，無酶切產物；如果SNP是C，得到443bp和334bp這2個條帶。實施例結果顯示，根據農墾58Spmsl2_l基因序列設計的2對引物和2個核酸內切酶通過PCR-RFLP方法能夠準確地推導出水稻材料中的SNP，從而用于檢測水稻光敏核不育
系O
權利要求
1.一種水稻光敏核不育系的分子檢測方法，其特征在于，包括如下步驟 a.抽提水稻葉片中基因組總DNA； b.任選以下一對引物對提取的基因組總DNA進行PCR擴增；GC-Dl 正向引物GCATGCTTCACCAGCACGTCCA, 反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG ；GC-D2 正向引物CCCATATATCTTGTCCAGTGCT， 反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG ； c.將擴增產物用核酸內切酶進行酶切； 如用弓I物GC-Dl擴增得到的PCR產物用核酸內切酶RsaI進行酶切；如用引物GC-D2擴增得到的PCR產物用核酸內切酶AccI進行酶切； d.由酶切產物的帶譜推出該基因的SNP如果是G，則該材料為光敏核不育系；SNP如果是C,則不是光敏核不育系。
2.根據權利要求I所述的水稻光敏核不育系的分子檢測方法，其特征在于， 所述的步驟d中用RsaI酶切，如果SNP是G，得到381bp、224bp和108bp3個條帶；如果SNP是C，得到605bp和108bp2個條帶； 用AccI酶切，如果SNP是G，無酶切產物；如果SNP是C，得到443bp和334bp2個條帶。
3.—種水稻光敏核不育系的分子檢測試劑盒，其特征在于，包括 引物GC-Dl 正向引物GCATGCTTCACCAGCACGTCCA, 反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG， 和核酸內切酶RsaI ； 或者引物GC-D2 正向引物CCCATATATCTTGTCCAGTGCT， 反向引物TAGCTTGCTTCATCTTGGTATG， 和核酸內切酶AccI ； 或者以上兩對引物和兩種核酸內切酶。
全文摘要
本發明公開了一種鑒別水稻光敏核不育基因pms12-1的分子標記方法和試劑盒，包括基因組DNA的提取、PCR擴增、擴增產物的酶切分析。根據pms12-1的序列設計了2對引物和2種核酸內切酶，以此引物通過PCR反應，再對擴增產物進行酶切分析，確定光敏基因的SNP類型，從而鑒定是否含有光敏核不育基因或者可育基因，并能進一步區別pms12-1基因的純合體和雜合體，達到快速簡便鑒定水稻光敏核不育系的目的，從而指導田間選育，加速育種進程。
文檔編號C12Q1/68GK102864227SQ20121035587
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月24日 優先權日2012年9月24日
發明者曹孟良, 李丁, 趙迎曦, 夏玉梅, 袁隆平, 高婧, 沈春修, 方真 申請人:湖南雜交水稻研究中心, 湖南隆平高科基因科技有限公司