專利名稱：一種生產l-乳酸的方法及其專用金橙黃微小桿菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生產L-乳酸的方法及其專用金橙黃微小桿菌。
背景技術：
乳酸(Lactic Acid)又名ニ羥基丙酸，是世界三大有機酸之一。作為ー種傳統的多用途精細化學品，乳酸可作為酸味劑、芳香剤、防腐剤、植物生長調節劑、生物可降解性材料、藥物和農藥等，應用于食品、制藥、釀造、制革、紡織、環保和農業中。微生物發酵法生產乳酸，生產成本低，產品安全性高，而且能專ー性的得到光學純乳酸，是大規模生產乳酸的主要方法。乳酸發酵過程中，由于不斷生產產物而使發酵液的酸度逐漸上升，導致菌體生長和產酸都受到嚴重的抑制，為此要加入碳酸鈣等中和劑進行中和。在乳酸的提取和純化過程中，要加入硫酸對乳酸鈣進行酸化，從而生成乳酸和不溶性的硫酸鈣。碳酸鈣作為中和劑的發酵エ藝增加了分離提取的成本，造成嚴重的環境問題。如果能采用氫氧化鈉作為中和 齊U，可以避免下游純化處理生成的硫酸鈣殘渣，有利于降低環境污染。由于鈉離子對菌株的毒性，目前國內外利用氫氧化鈉作為中和劑進行的L-乳酸發酵都未能達到理想的效果。嗜鹽堿微生物是ー類在pH 9. 0以上也能生長的微生物類群。嗜鹽堿菌對鹽環境尤其是一價鹽離子環境具有很好的耐受性，一般能夠耐受10%以上的NaCl。這樣的生理優勢使其可以使用氫氧化鈉代替碳酸鈣作為中和劑來維持乳酸發酵過程中的PH，從而避免后續乳酸純化過程中產生的不溶性鈣鹽。楊大偉等人2010年報道了篩選獲得一株金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) LP3-3,在最佳發酵條件下L-乳酸產量為僅為16.27g/L。L-乳酸的生產成本是制約L-乳酸應用的關鍵因素之一。尋找能夠低成本清潔生產高濃度L-乳酸的技術成為研究的熱點。因此，獲得能夠適用于氫氧化鈉調酸エ藝條件下，產高濃度L-乳酸的菌株具有重要的實際エ業應用價值。

發明內容
本發明的目的是提供一株金橙黃微小桿菌及其在生產L-乳酸中的應用。本發明所提供的金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum)具體為金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1,是從內蒙古鄂爾多斯鹽堿湖湖邊取得的水樣中篩選得到的。該金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1已于2012年5月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJi址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC No. 6154。金澄黃微小桿菌(Exiguobacteriumaurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154 在營養瓊脂上菌落平坦，淡橙色，色素不擴散，幼齡培養物為桿菌，老齡培養物為球狀。革蘭氏陽性。不生孢，不抗酸。以周生鞭毛運動。兼性厭氧。嗜堿，能在PH 6. 5 11. 5生長。耐鹽，能在0-14%的NaCl條件下生長，10%的NaCl條件下不明顯抑制產酸。從葡萄糖、蔗糖、半乳糖和ー些其他糖產酸。接觸酶陽性，氧化酶陰性。還原硝酸鹽。水解明膠、淀粉和酪素。其16s rDNA序列如序列表中序列I所示。
本發明的再ー個目的是提供ー種菌劑。本發明所提供的菌劑的活性成分為所述金橙黃微小桿菌(Exiguobacteriumaurantiacum) 8—11—1CGMCC No. 6154。本發明的另ー個目的是提供一種生產L-乳酸的方法。本發明所提供的生產L-乳酸的方法是發酵培養所述金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154,或以其為 活性成分的所述菌劑，得到L-乳酸。在上述方法中，所述發酵培養的pH可為7. 5-10. 5，如7. 5-9. 5，或8. 5-9. 5。在本發明的一個實施例中，所述發酵培養的PH具體為8. 5。在上述方法中，調節所述發酵培養的pH的中和劑可為NaOH水溶液。所述NaOH水溶液具體為濃度10-20M的NaOH水溶液。在本發明的一個實施例中，所述NaOH水溶液的濃度具體為15M。在上述方法中，所述發酵培養的培養基中含有碳源和氮源；所述碳源為終濃度可為20克/升-150克/升的葡萄糖，如20-120克/升、20-80克/升、80-120克/升、或80克/升，在本發明的一個實施例中，具體為100克/升；所述氮源為終濃度為5克/升-50克/升(如5-20克/升)的酵母粉(如安琪酵母粉)，在本發明的一個實施例中，具體為20克/升。在上述方法中，所述發酵培養的培養基中還可含有終濃度大于0克/升小于等于0. 4克/升(如0. 2-0. 35克/升或0. 35克/升)的MgSO4 7H20、終濃度大于0克/升小于等于4克/升(如1-2克/升或2克/升)的K2HPO4 *3H20、終濃度為大于0克/升小于等于5克/升(如I如克/升)的CH3C00Na、終濃度大于0克/升小于等于0. 06g克/升(如0. 03克 / 升)的 MnSO4 H2O。根據實際需要，所述發酵培養的培養基中還可含有NaCl、Na2C03、和/或聚蛋白胨。在本發明的一個實施例中，所述發酵培養的培養基的溶劑為水，溶質為葡萄糖、酵母粉、K2HPO4 3H20、MgSO4 7H20、MnSO4 H2O, NaCl和Na2CO3 ;所述葡萄糖在所述培養基中的終濃度為80g/L，所述酵母粉在所述培養基中的終濃度為20g/L，所述K2HPO4 3H20在所述培養基中的終濃度為2g/L，所述MgSO4 7H20在所述培養基中的終濃度為0. 35g/L，所述MnSO4 H2O在所述培養基中的終濃度為0. 03g/L,所述NaCl在所述培養基中的終濃度為50g/L，所述Na2CO3在所述培養基中的終濃度為10g/L ;所述培養基的pH為8. 5。該培養基的制備過程中將其他溶質溶于溶劑水中高溫滅菌后，再將高溫滅菌的Na2CO3溶液加入其中。在上述方法中，所述發酵培養的溫度可為30-42°C (如30-37°C或37_42°C)，在本發明的一個實施例中，具體為37°C;所述發酵培養的時間是12-72小時(如12-43h或12h或72h或26h)，在本發明的一個實施例中，具體為43h ;所述發酵培養的方式為旋轉震蕩培養，轉速為40-60轉/分鐘(如50轉/分鐘)，旋轉半徑為30-40mm (如38mm)。本發明的又ー個目的是提供所述菌劑的制備方法。該方法可包括如下步驟將所述金橙黃微小桿菌(Exiguobacteriumaurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154作為活性成分，得到所述菌劑。本發明利用金澄黃微小桿菌(Exiguobacteriumaurantiacum) 8-11-1CGMCCNo. 6154生產L-乳酸，以葡萄糖為底物，在37°C條件下直接發酵生產L-乳酸，43小時內，L-乳酸濃度為133克/升，光學純度大于99. 9%，轉化率大于93%。本發明所提供的金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-ll_lCGMCC No. 6154可用氫氧化鈉調酸,發酵生產高光學純L-乳酸，有利于降低L-乳酸純化成本，減少環境污染，具有重要的實際エ業應用價值。保藏說明菌種名稱金橙黃微小桿菌拉丁名(Exiguobacteriumaurantiacum)菌株編號8_1トI保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 保藏機構簡稱CGMCC地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號保藏日期2012年5月25日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 615

圖 I 為金澄黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154利用葡萄糖發酵生產L-乳酸的曲線。圖中所示的乳酸即表示L-乳酸。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中所涉及的各個參數的測定方法如下葡萄糖含量的測定發酵液離心后稀釋，采用生物傳感分析儀SBA-40C (山東省科學院生物研究所)測定。生物傳感分析儀SBA-40C是以固定化酶為傳感器的分析儀器，葡萄糖與氧氣、水在葡萄糖氧化酶的催化下生成葡萄糖酸和雙氧水。反應放出的雙氧水與白金一銀電極接觸，并產生電流信號，該電流信號與葡萄糖濃度成線性比例關系，通過測定電流信號強度可得出葡萄糖濃度。L-乳酸含量的測定采用Agilent 1260液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測定，有機酸柱(美國Bio-Rad公司，Aminex HPX-87H，ff(5um)4. 6IDX250_，有機酸分離用)，流動相為0. 005mol/L硫酸，流速0. 6ml/min,進樣量5 u L，紫外檢測器，檢測波長210nm，操作溫度65°C。L-乳酸標準品為Sigma-Aldrich公司產品，貨號為L1750。L-乳酸光學純度的測定采用Agilent 1260液相色譜儀，配備手性分離柱(日本三菱化學公司，MCI GEL-CRS I Off, 4. 6mm IDX 50mm，光學異構體分離用)。具體操作條件為2mM的硫酸銅作為流動相，流速0. 5ml/min,進樣量10 U 1，紫外檢測器，檢測波長254nm，操作溫度25°C。利用L-乳酸和D-乳酸標準品做出標準曲線，再根據標準曲線計算出發酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量。光學純度(optical purity)是衡量旋光性樣品中一個對映體超過另ー個對映體的量的量度，它可用對映體過量值(enantiomeric excess)表示。本發明中L-乳酸的光學純度按以下公式計算(L-乳酸含量-D-乳酸含量)+ (L-乳酸含量+D-乳酸含量)X 100%。
糖酸轉化率定義為L_乳酸產量(克/升)+總葡萄糖的消耗量(克/升)X 100%。下述實施例中所用到的酵母粉均購自安琪酵母股份有限公司；聚蛋白胨(polypeptone)購自日本制藥株式會社，產品目錄號394-00115。實施例I、金澄黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1的分離篩選和鑒定本實施例中所用到的培養基組成如下篩選培養基(g/L):葡萄糖20. 0，酵母粉5.0，聚蛋白胨5.0，K2HPO4 *3H20 1.0,MgSO4 *7H20 0. 2，NaCl 50，蒸餾水900ml，115°C高溫滅菌10分鐘后加入高溫滅菌的10%(w/V) Na2CO3IOOml, pH 為 10. O。
固體培養基在篩選培養基的基礎上添加15g/L的瓊脂，pH為10. O。一、金澄黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1 的分離篩選從內蒙古鄂爾多斯鹽堿湖湖邊取得水樣。取4ml樣品接種于裝有50ml篩選培養基的IOOml三角瓶中，37°C活化培養3天，充分混勻后取樣用無菌水稀釋10，000倍涂布于固體培養基上，37°C培養一天，將長出的單菌落劃線接種到新的固體培養基平板上，在37°C條件下靜置培養24小吋，劃線純化后取單菌落接種到新的固體培養基平板上擴增培養，之后取菌接種到裝有50ml篩選培養基的IOOml三角瓶中，12小時培養結束時，取發酵液，6，000轉/分鐘，離心半徑為36mm，離心5分鐘，取上清液。測定上清液中L-乳酸濃度和L-乳酸的光學純度。得到一株L-乳酸產量和產率都較高、L-乳酸光學純度接近100%的菌株。將該菌株命名為8-11-1。ニ、金澄黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1 的鑒定從形態、生理生化特征和16s rDNA序列同源性幾個方面對步驟ー獲得的菌株8-11-1進行鑒定。其中，形態特征觀察和生理生化特性鑒定參見“伯杰細菌鑒定手冊”(第八版)和“常見細菌系統鑒定手冊”(東秀珠，蔡妙英等編著，北京科學出版社，2001. 2)中描述的方法。I、形態學鑒定經形態學鑒定，結果表明步驟一分離篩選得到的菌株8-11-1為革蘭氏陽性菌，幼齡培養物為桿菌，老培養物為球狀，I. l 1.2iimX1.4 3.2iim。不生孢，不抗酸。以周生鞭毛運動。兼性厭氧。在營養瓊脂上菌落平坦，淡橙色，色素不擴散。嗜堿，能在PH6.5
11.5生長。耐鹽，能夠在0-14% (w/v)的NaCl濃度下生長。2、生理生化特征鑒定經生理生化特征鑒定，結果表明步驟一分離篩選得到的菌株8-11-1可利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和ー些其他糖產酸，主要產物是乳酸、こ酸和甲酸。接觸酶陽性，氧化酶陰性。還原硝酸鹽。水解明膠、淀粉和酪素。能夠在30°C-45°C生長。3、16s rDNA序列同源性分析TE緩沖液10mmol/L的三輕甲基氨基甲燒(Tris)、lmmol/L的こニ胺四こ酸(EDTA)、用鹽酸調整pH為8. O。16s rDNA序列同源性分析的具體操作如下從固體培養的平板上取適量步驟一分離得到的菌株8-11-1加到50ul TE緩沖液中，95°C處理10分鐘，處理液作為模板。
以上述處理液做為模板，利用購自上海生エ生物工程有限公司的真細菌引物27f和1492r，進行PCR擴增。所述的27f引物序列為:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ;所述1492r引物序列為5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。在50 yl反應體系依次混勻下列試劑35. 75 u I H2O, 5 U I的PCR反應緩沖液，4 u I dNTP混合液，2 的27f弓丨物，2 的1492r弓丨物，I U I模板，0.25 U I Taq DNA聚合酶，混勻后離心5秒鐘。將混合物在94°C加熱5分鐘。94°C變性I分鐘，50°C退火I分鐘，72°C延伸2分鐘，總共30個循環。最后ー個循環后，于72°C下保溫10分鐘，使反應混合物擴增充分，得到菌株8-11-1的16S rRNA基因的PCR擴增產物，將產物測序。序列拼接及相似性分析使用DNAStar軟件完成，序列比對通過美國國家生物技術信息中心NCBI數據庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)在線完成。測序結果表明，步驟ー獲得的菌株8-11-1的16S rRNA基因序列長度為1465bp，如序列表中序列I所示。鑒于上述形態、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析結果，將步驟一分
離篩選得到的菌株8-11-1鑒定為金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum)。該金澄黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1已于2012年5月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC No. 6154。實施例2、金澄黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCCNo. 6154利用葡萄糖為碳源發酵生產L-乳酸的最佳反應溫度的測定(三角瓶)本實施例中所用的培養基的組成如下液體培養基(g/L):葡萄糖20.0，酵母粉5.0，聚蛋白胨5.0，K2HPO4 *3H20 1.0,MgSO4 *7H20 0. 2，NaCl 50，蒸餾水900ml，115°C高溫滅菌10分鐘后加入高溫滅菌的10%(w/V) Na2CO3IOOml,培養基初始pH值為10.0。固體平板培養基在上述液體培養基中添加15克/升的瓊脂。本發明發酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟(I)平板培養金澄黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-11-lCGMCCNo. 6154菌種接種于固體平板培養基上，37°C培養24小時；(2)種子培養將步驟(I)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接2環于裝有50ml液體培養基的IOOml三角瓶中，37°C靜置培養12小時，制得種子培養液；(3)發酵培養在裝有50ml液體培養基的IOOml三角瓶中接入3ml步驟(2)的種子養液，分別放置于30°C、37°C、42°C、50°C和60°C靜置培養26小時，結束發酵。發酵結束時，取發酵液，6，000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，根據上述方法檢測發酵液中生成的L-乳酸的濃度。實驗重復進行三次。結果顯示，30°C培養溫度下，L-乳酸產量為11克/升；37°C培養溫度下，L-乳酸產量為12克/升；42°C培養溫度下，L-乳酸產量為11克/升；50°C培養溫度下，L-乳酸產量為3克/升；60°C培養溫度下，L-乳酸產量為0克/升。以上結果顯示金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154 利用葡萄糖的最佳發酵溫度為37。。。實施例3、金澄黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCCNo. 6154在不同NaCl濃度條件下產酸情況(三角瓶)
本實施例中所用的培養基的組成如下液體培養基(g/L):葡萄糖20.0，酵母粉5.0，聚蛋白胨5.0，K2HPO4 *3H20 1.0,MgSO4 *7H20 0. 2，NaCl 50，蒸餾水900ml，115°C高溫滅菌10分鐘后加入高溫滅菌的10%(w/v) Na2CO3 100ml，培養基初始 pH 值為 10. O00固體平板培養基在上述液體培養基中添加15克/升的瓊脂。發酵培養基(g/L):葡萄糖20.0，酵母粉5，聚蛋白胨5.0，K2HPO4 *3H20 1.0，MgSO4 *7H20 0. 2，NaCl 0-200，蒸餾水900ml，115°C高溫滅菌10分鐘后加入高溫滅菌的10%(w/v) Na2CO3 IOOml 1，培養基初始 pH 值為 10. O。本發明發酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟( I)斜面培養同實施例2 ；(2)種子培養同實施例2 ；(3)發酵培養在裝有50ml含有不同NaCl濃度發酵培養基的IOOml三角瓶中接入3ml步驟(2)的種子養液，放置于37°C靜置培養72小吋，結束發酵。上述發酵培養基中NaCl 濃度分別為む/1):0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200。發酵結束時，取發酵液，6000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發酵液中L-乳酸濃度。實驗重復進行三次。在不同濃度NaCl條件下的產酸情況分別為0g/L的NaCl條件下，乳酸產量為15g/L ；50g/L的NaCl條件下，乳酸產量為16g/L ；100g/L的NaCl條件下，乳酸產量為14g/L ；120g/L的NaCl條件下，乳酸產量為2g/L ；140g/L的NaCl條件下，乳酸產量為lg/L ；NaCl濃度超過150g/L后,菌體不產酸。這ー結果表明，金橙黃微小桿菌(Exiguobacteriumaurantiacum)8-ll-lCGMCC No. 6154 可以最高耐受 140g/L 的 NaCl，并且在 100g/L 的 NaCl條件下，乳酸發酵水平沒有明顯降低，顯示了該菌良好的鈉鹽耐受能力，具有エ業應用潛力。實施例4、金澄黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCCNo. 6154直接利用葡萄糖發酵生產L-乳酸的最佳反應pH值的測定(發酵罐)本實施例中所用的培養基的組成如下液體培養基(克/升)葡萄糖20.0，酵母粉5，聚蛋白胨5.0，K2HPO4 *3H20 1.0， MgSO4 *7H20 0. 2，NaCl 50，蒸餾水900ml，115°C高溫滅菌10分鐘后加入高溫滅菌的10%(w/V) Na2CO3 100ml，培養基初始pH值為10. O。固體平板培養基在上述液體培養基中添加15克/升的瓊脂。發酵培養基(克/升):葡萄糖 120. 0，酵母粉20,K2HPO4 *3H20 2. 0，MgSO4 *7H200. 35，無水こ酸鈉I,MnSO4 .H2OO. 03,蒸懼水900ml, 115°C高溫滅菌10分鐘后加入高溫滅菌的10%(w/v) Na2CO3 100ml，調節培養基初始 pH 值為 6. 5,7. 5,8. 5,9. 5 或 10. 5。本發明發酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟( I)斜面培養同實施例2 ；(2)種子培養同實施例2 ；(3)發酵培養上海保興BIOTECH 5升發酵罐中加入配制為2. OL但定溶到I. 8升的發酵培養基，在發酵培養基中接入200ml步驟(2)獲得的種子培養液，使用3M的HCl和15M的NaOH溶液控制整個發酵過程中的pH值恒定為6. 5,7. 5,8. 5,9. 5或10. 5，37°C培養12小時，攪拌轉速50轉/分，攪拌半徑38mm。發酵結束時，取發酵液，6000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發酵液中L-乳酸濃度。實驗重復進行三次。在pH 6. 5的條件下，L-乳酸的發酵濃度為5. 3g/L ；pH 7. 5的條件下，L-乳酸的發酵濃度為37. Og/L ；pH 8. 5的條件下，L-乳酸的發酵濃度為58. 7g/L ；pH 9. 5的條件下，L-乳酸的發酵濃度為57. 7g/L ；pH 10. 5的條件下，L-乳酸的發酵濃度為9. 7g/L。這ー結果表明，金澄黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-ll_lCGMCC No. 6154利用葡萄糖為唯一碳源直接發酵生產L-乳酸的最佳控制pH值為8. 5-9. 5，從減少NaOH用量，控制生產成本的角度考慮，最佳的控制pH值為8. 5。實施例5、金澄黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCCNo. 6154利用葡萄糖單次補料發酵生產L-乳酸(發酵罐)
本實施例中所用的培養基的組成如下液體培養基(克/升)葡萄糖20. 0，酵母粉5. 0，聚蛋白胨5. 0，K2HPO4 3H20 1.0,MgSO4 *7H20 0. 2，NaCl 50，蒸餾水900ml，115°C高溫滅菌10分鐘后加入高溫滅菌的10%(w/V) Na2CO3 100ml，培養基初始pH值為10. O。固體平板培養基在上述液體培養基中添加15克/升的瓊脂。發酵培養基(克/ 升):葡萄糖 80.0，酵母粉 20，K2HPO4 3H20 2.0，MgSO4 7H200. 35,MnSO4 .H2OO. 03，NaCl 50，蒸餾水900ml，115°C高溫滅菌10分鐘后加入高溫滅菌的10% (w/V) Na2CO3 100ml，培養基初始pH值為8. 5。本發明發酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟(I)斜面培養同實施例2 ；(2)種子培養同實施例2 ；(3)發酵培養上海保興BIOTECH 5升發酵罐中加入配制為2. OL但定溶到I. 8升的發酵培養基，在發酵培養基中接入200ml步驟(2)獲得的種子培養液，使用3MHC1和15M的NaOH溶液控制整個發酵過程中的pH值恒定為8. 5 ;采用多次脈沖補料方式，具體為，初始葡萄糖濃度為80克/升，當發酵液中葡萄糖的濃度低于20克/升時，則一次加入800-1000克/升葡萄糖溶液使發酵液中葡萄糖濃度重新達到80克/升，在整個發酵過程中，需要多次補料操作。37°C培養43小吋，攪拌轉速50轉/分，攪拌半徑38mm。發酵結束吋，取發酵液，10, 000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液，按照上述檢測方法，檢測發酵液中L-乳酸濃度及其光學純度、糖酸轉化率。同時在發酵過程中，定時取樣，檢測發酵液中L-乳酸的濃度以及葡萄糖的消耗情況。實驗重復三次，結果取平均值。結果如圖I和表I所示，金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-11-1CGMCC No. 6154生產L-乳酸，以葡萄糖為底物，在37°C條件下直接發酵生產L-乳酸，43小時內，L-乳酸濃度為133克/升，光學純度大于99. 9%，轉化率超過93%。本發明所提供的金澄黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154 可用氫氧化鈉調酸，發酵生產高光學純L-乳酸，有利于降低L-乳酸純化成本，減少環境污染，具有重要的實際エ業應用價值。表I利用葡萄糖發酵L-乳酸3次重復實驗的結果
權利要求
1.金橙黃微小桿菌(Exiguobacteriumaurantiacum) 8-11-1,它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 6154。
2.一種菌劑，其特征在于所述菌劑的活性成分為權利要求I所述的金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-11-1CGMCC No. 6154。
3.一種生產L-乳酸的方法，是發酵培養權利要求I所述的金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154,或權利要求 2 所述的菌劑，得到L-乳酸。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述發酵培養的pH為7.5-10. 5。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于調節所述發酵培養的pH的中和劑為NaOH水溶液；所述NaOH水溶液具體為濃度10-20M的NaOH水溶液。
6.根據權利要求3-5中任一所述的方法,其特征在于所述發酵培養的培養基中含有碳源和氮源；所述碳源為終濃度為20克/升-150克/升的葡萄糖；所述氮源為終濃度為5克/升-50克/升的酵母粉。
7.根據權利要求6中所述的方法，其特征在于所述發酵培養的培養基中還含有終濃度大于0克/升小于等于0. 4克/升的MgSO4 7H20、終濃度大于0克/升小于等于4克/升的K2HPO4 3H20、終濃度為大于0克/升小于等于5克/升的CH3C00Na、終濃度大于0克/升小于等于0. 06g克/升的MnSO4 H2O0
8.根據權利要求7中所述的方法，其特征在于所述發酵培養的培養基，溶劑為水，溶質為葡萄糖、酵母粉、K2HPO4 3H20、MgSO4 7H20、MnSO4 H2O, NaCl 和 Na2CO3 ;所述葡萄糖在所述培養基中的終濃度為80g/L，所述酵母粉在所述培養基中的終濃度為20g/L，所述K2HPO4 3H20在所述培養基中的終濃度為2g/L，所述MgSO4 7H20在所述培養基中的終濃度為0. 35g/L，所述MnSO4 -H2O在所述培養基中的終濃度為0. 03g/L,所述NaCl在所述培養基中的終濃度為50g/L，所述Na2CO3在所述培養基中的終濃度為10g/L ;所述培養基的pH為8.5。
9.根據權利要求3-8中任一所述的方法，其特征在于所述發酵培養的溫度為30-420C ;所述發酵培養的時間是12-72小時；所述發酵培養的方式為旋轉震蕩培養，轉速為40-60轉/分鐘，旋轉半徑為30-40mm。
10.權利要求2所述菌劑的制備方法，包括如下步驟將權利要求I所述的金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum) 8-11-1CGMCC No. 6154 作為活性成分，得到所述菌齊U。
全文摘要
本發明公開了一種生產L-乳酸的方法及其專用金橙黃微小桿菌。本發明所提供的金橙黃微小桿菌具體為金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-11-1，它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No.6154。本發明所提供的金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-11-1CGMCC No.6154均有良好的鈉鹽耐受能力；以葡萄糖為底物，采用氫氧化鈉調酸方式，在37℃條件下利用其發酵生產L-乳酸，L-乳酸濃度達133克/升，光學純度大于99.9%，糖酸轉化率超過93%。本發明所提供的金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum)8-11-1CGMCC No.6154可采用氫氧化鈉調酸方式發酵生產高濃度、高光學純的L-乳酸，有利于降低乳酸純化成本，減少環境污染，具有重要的實際工業應用價值。
文檔編號C12R1/01GK102864105SQ20121035683
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月21日 優先權日2012年9月21日
發明者王愛妍, 薛燕芬, 姜旭, 王麗敏, 于波, 馬延和 申請人:中國科學院微生物研究所