專利名稱：：通過淀粉和木聚糖的降解酶的表達開發能進行淀粉和木聚糖的醇發酵的耐熱酵母多形漢...的制作方法
技術領域：
：本申請涉及通過發酵進行纖維素乙醇生產的領域，具體地涉及淀粉和木聚糖碳源的發酵，更具體地涉及用于通過淀粉和木聚糖發酵進行乙醇生產的重組多形漢遜酵母(H.poIymorpha)菌株,并且還更具體地涉及分泌重組的α淀粉酶和葡糖淀粉酶、和/或木糖水解酶和木糖苷酶以通過在含淀粉和木聚糖的培養基上進行發酵實現乙醇生產的多形漢遜酵母菌株。前言由可再生原料如植物生物質進行燃料乙醇生產具有重要的經濟學和生態學意義。植物木質纖維素具有作為目前生物乙醇生產中被廣泛應用的蔗糖和基于淀粉的多糖的替代性原料的潛力。木質纖維素和其他植物來源的多糖代表了一種可通過二氧化碳的生物轉化進行再生產的可再生的持續性能量來源。由植物生產的生物燃料勝過化石燃料的許多受追捧的環境益處之一是溫室氣體的顯著減少[6，24]。目前世界上生產的絕大多數的乙醇來源于淀粉或蔗糖。許多農作物中富含淀粉和糖類，但是當乙醇作為一種液體交通運輸燃料而擴大生產時，需要不與食物和動物飼料的使用直接競爭的原料。這些原料包括來自農業和林業上的木質纖維素副產品殘余物[14]。木質纖維素是來源于木材和農業殘余物的植物物質的通用術語。其主要包含木質素和纖維素以及大量的半纖維素，具有較少量的結構蛋白和有機溶劑可萃取的物質[14]。半纖維素是由作為骨架的木聚糖組成并且存在于植物細胞壁中的一種取代的多糖[11]。木質纖維素和淀粉加工成乙醇包括四個主要的單元操作預處理，水解，發酵和產物分離/純化。淀粉的生物轉化包括酶水解和所得的葡萄糖發酵成乙醇，伴隨動物飼料副產品的產生。由于木質纖維素具有較復雜的結構，并且在不同植物(谷類植物、軟木材、硬木材等)和同一植物(莖、殼、桿、穗軸、稻桿、葉、核等)中的組成具有很大不同，因此木質纖維素的水解較為困難[14]。木糖是在具有C5L-阿拉伯糖和其他C6糖類如葡萄糖、甘露糖、半乳糖作為主要己糖的半纖維素成分水解得到的主要的戊糖[11]。由于木質纖維素的工藝涉及許多步驟，且需要高能量投入，因此，木質纖維素作為原料的商業生機需要開發更直接且廉價的技術。糖類聚合物的直接微生物轉化(DMF，直接微生物發酵)是一種可使由木質纖維素生產生物乙醇的經濟效益提高的選擇。開發這項技術的關鍵先決條件之一是獲得能夠在高溫下直接使淀粉和木聚糖發酵成乙醇的微生物。目前DMF所涉及的水解酶的最佳溫度約為50°C，而目前由木質纖維素糖類和淀粉糖類進行生物乙醇生產所用的絕大部分微生物為嗜溫生物，其最佳生長和發酵溫度在28°C到40°C之間[6]。本實驗室的最近研究顯示耐熱的甲基營養型酵母多形漢遜酵母能夠在高溫(37-480C)下使D-木糖和D-葡萄糖發酵為乙醇。因為多形漢遜酵母生長和發酵的最佳溫度較高，所以它是用于DMF技術的深入開發的一個優秀候選者[3，26]。由于多形漢遜酵母不能利用淀粉和木聚糖作為碳源和能量來源，所以異源木聚糖降解酶基因和淀粉降解酶基因在這種酵母中的克隆和過表達是必需的。β-1，4木聚糖是存在于植物細胞壁的幾乎所有部分中的異質性多糖。β-1,4-連接的木糖單體形成主鏈，主鏈上連接有一些取代基[30]。木聚糖主鏈的水解由β_1，4木聚糖內切酶(1，4-β-D-木聚糖的木聚糖水解酶，EC3.2.1.8)和β-D-木糖苷酶(1，4-β-木聚糖的木糖水解酶，EC3.2.1.37)催化。β-木聚糖內切酶作用于木聚糖和木寡糖，主要產生木寡糖的混合物。β-D-木糖苷酶將木寡糖水解為D-木糖[19]。真菌木霉屬(Trichoderma)和曲霉屬(Aspergillus)分泌大量有效的木聚糖降解酶。里氏木霉(Trichodermareesei)是已知具有纖維素水解活性和木聚糖水解活性的一種絲狀嗜溫性真菌[3]。由這種真菌分泌的兩種主要可誘導型木聚糖內切酶為Xynl和Xyn2。Xyn2占木聚糖上培養的里氏木霉的總木聚糖水解活性的50%以上。曲霉屬的成員也是纖維素水解酶和木聚糖水解酶的有效生產者。編碼804個氨基酸的β-木糖苷酶的黑曲霉(A.niger)的xlnD基因在酵母中被成功表達[19]。淀粉由兩種高分子量成分組成直鏈淀粉和支鏈淀粉。直鏈淀粉為較少的組分(20-30%)，是由α-1，4-連接的葡萄糖殘基和一些α-1,6支化點形成的一種直鏈多糖；而支鏈淀粉代表淀粉中的較多的成分(70-80%)，且高度分支[4]。淀粉由兩種分泌的淀粉酶降解α-淀粉酶和葡糖淀粉酶[25]。α-淀粉酶(1，4_a-D-葡聚糖的葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)催化淀粉和相似底物的α-1,4-葡萄糖苷鍵的淀粉內部裂解，釋放麥芽糖、寡糖和極限糊精。葡糖淀粉酶(1，4-a-D-葡聚糖葡萄糖水解酶，EC3.2.1.3)水解葡萄寡糖(glucooligosaccharide)和麥芽糖為D-葡萄糖。酵母西方許旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)生產分解淀粉的酶類,并使淀粉高效地發酵成乙醇[34]。由這種酵母分泌的α-淀粉酶是由SWA2基因編碼。GAMl基因編碼分泌性葡糖淀粉酶。一些從谷物顆粒如玉米的加工中得到的農業木質纖維素殘余物(如玉米纖維殼)含有大量的淀粉。因此建立能夠將淀粉和木質纖維素直接積極轉化成乙醇的微生物菌株具有重大的經濟意義。概述本文描述的是能夠直接使淀粉和木聚糖進行乙醇發酵的分解淀粉和木聚糖的多形漢遜酵母菌株。我們在此描述了通過將基因西方許旺酵母SWA2和GAM1，里氏木霉ΧΥΝ2和黑曲霉xlnD成功插入該酵母的染色體中并表達它們而構建菌株。同時，過表達丙酮酸脫羧酶(roc)的菌株經過基因工程改造而具有這些基因中的一個或多個。在每種情況中菌株都能夠單獨在含可溶性淀粉或可溶性木聚糖的培養基上生長，并且能夠以不同水平使可溶性淀粉或可溶性木聚糖發酵為乙醇。同時過表達roc的菌株給出比僅過表達SWA2和GAMl基因的菌株更高的乙醇滴度。本發明提供一種多形漢遜酵母菌株，所述多形漢遜酵母菌株包含編碼α-淀粉酶的至少一種基因和編碼葡糖淀粉酶的至少一種基因，所述基因與在所述多形漢遜酵母菌株中表達所述基因的至少一種啟動子可操作地連接，并且所述酶以充足的量自所述多形漢遜酵母菌株輸出到培養基中，從而允許所述多形漢遜酵母菌株在只含可溶性淀粉作為碳源的培養基中生長。在所述多形漢遜酵母菌株中，編碼所述α-淀粉酶和葡糖淀粉酶中至少其一的基因可以被整合入所述多形漢遜酵母的染色體中。在所述多形漢遜酵母菌株中，編碼所述α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的所述基因中的每一種均可以被整合入所述多形漢遜酵母的染色體中。在所述多形漢遜酵母菌株中，編碼所述α-淀粉酶或葡糖淀粉酶的所述基因中的至少一種可以是從西方許旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)菌株獲得。在所述多形漢遜酵母菌株中，編碼α-淀粉酶或所述葡糖淀粉酶的所述至少一種基因還可以包括與所述基因可操作地連接以終止所表達的基因的轉錄的終止子。在所述多形漢遜酵母菌株中，所述啟動子可以包括從多形漢遜酵母獲得的HpGAP啟動子。在所述多形漢遜酵母菌株中，所述α-淀粉酶基因和葡糖淀粉酶的基因中的每一種都可以與從多形漢遜酵母獲得的HpGAP啟動子可操作地連接。所述多形漢遜酵母菌株還可以包括編碼丙酮酸脫羧酶的基因，所述編碼丙酮酸脫羧酶的基因與在所述多形漢遜酵母菌株中表達所述丙酮酸脫羧酶的至少一種啟動子可操作地連接。本發明還提供一種制造乙醇的方法，所述方法包括使多形漢遜酵母菌株在促使所述多形漢遜酵母制造乙醇的條件下生長在含可溶性淀粉的培養基中。本發明還提供一種多形漢遜酵母菌株，所述多形漢遜酵母菌株包含編碼木聚糖內切酶的至少一種基因和編碼木糖苷酶的至少一種基因，所述基因與在所述多形漢遜酵母菌株中表達所述基因的至少一種啟動子可操作地連接，并且所述酶以充足的量自所述多形漢遜酵母菌株輸出到培養基中，從而允許所述多形漢遜酵母菌株在只含可溶性木聚糖作為碳源的培養基中生長。在所述多形漢遜酵母菌株中，編碼所述木聚糖內切酶和木糖苷酶中至少其一的基因可以被整合入所述多形漢遜酵母的染色體中。所述多形漢遜酵母菌株中，編碼所述木聚糖內切酶和木糖苷酶的所述基因中的每一種均被整合入所述多形漢遜酵母的染色體中。在所述多形漢遜酵母菌株中，編碼所述木聚糖內切酶或木糖苷酶的所述基因中的至少一種可以是從選自由黑曲霉(Aspergillusniger)和里氏木霉(Trichodermareseei)所組成的組的菌株獲得。在所述多形漢遜酵母菌株中，編碼所述木聚糖內切酶或所述木糖苷酶的所述至少一種基因還可以包括與所述基因可操作地連接以終止所表達的基因的轉錄的終止子。在所述多形漢遜酵母菌株中，所述啟動子可以包括從多形漢遜酵母獲得的HpGAP啟動子。所述多形漢遜酵母菌株還可以包括編碼丙酮酸脫羧酶的基因，所述編碼丙酮酸脫羧酶的基因與在所述多形漢遜酵母菌株中表達所述丙酮酸脫羧酶的至少一種啟動子可操作地連接。本發明還提供一種制造乙醇的方法，所述方法包括使多形漢遜酵母菌株在促使所述多形漢遜酵母制造乙醇的條件下生長在含可溶性木聚糖的培養基中。本發明還提供一種多形漢遜酵母菌株，所述多形漢遜酵母菌株包含編碼α-淀粉酶的至少一種基因、編碼葡糖淀粉酶的至少一種基因、編碼木聚糖內切酶的至少一種基因和編碼木糖苷酶的至少一種基因，每個基因都與在所述多形漢遜酵母菌株中表達所述基因的至少一種啟動子可操作地連接，并且所述酶以充足的量自所述多形漢遜酵母菌株中輸出到培養基中，從而允許所述多形漢遜酵母菌株在只含可溶性淀粉或可溶性木聚糖作為碳源、或含兩者的單獨組合作為碳源的培養基中生長。所述多形漢遜酵母菌株還可以包括編碼丙酮酸脫羧酶的基因，所述編碼丙酮酸脫羧酶的基因與在所述多形漢遜酵母菌株中表達所述丙酮酸脫羧酶的至少一種啟動子可操作地連接。本發明還提供一種制造乙醇的方法，所述方法包括使多形漢遜酵母菌株在促使所述多形漢遜酵母制造乙醇的條件下生長在含可溶性淀粉的培養基中。本發明還提供一種重組核酸，所述重組核酸包含編碼α-淀粉酶的基因和編碼葡糖淀粉酶的基因中的至少一種，所述基因與從多形漢遜酵母獲得的HpGAP啟動子可操作地連接。所述重組核酸可以滿足以下至少一項a.所述α-淀粉酶由根據SEQID.NOI的核苷酸序列編碼；b.所述α-淀粉酶具有根據SEQID.NO2的氨基酸序列；c.所述葡糖淀粉酶由根據SEQID.NO3的核苷酸序列編碼；以及d.所述葡糖淀粉酶具有根據SEQID.NO4的氨基酸序列。本發明還提供一種重組核酸，所述重組核酸包含編碼木聚糖內切酶的基因和編碼β-木糖苷酶的基因中的至少一種，所述基因與從多形漢遜酵母獲得的HpGAP啟動子可操作地連接。所述重組核酸可以滿足以下至少一項e.所述β-木糖苷酶由根據SEQID.NO5的核苷酸序列編碼；f.所述β-木糖苷酶具有根據SEQID.NO6的氨基酸序列；g.所述木聚糖內切酶由根據SEQID.NO7的核苷酸序列編碼；以及h.所述木聚糖內切酶具有根據SEQID.NO8的氨基酸序列。在所述重組核酸中，編碼所述木糖苷酶和木聚糖內切酶的所述基因還與內源性連接于所述基因的終止子核苷酸序列可操作地連接。在所述重組核酸中，內源性連接于所述基因的所述終止子核苷酸序列是根據SEQIDΝ0:9和SEQIDNO10中的至少一項。圖1.質粒pGAMl(6.63kb)、pGAMlSWA2(9.lkb)、pORl(10.8kb)和pORll(IOkb)的線性圖譜。灰色框表示的是含LEU2基因的釀酒酵母(S.cerevisiae)基因組片段，綠色框表示的是HpGAP啟動子，HpAOX終止子橙色框，藍色框表示的是GAMl基因的0RF，SWA2基因的ORF:紅色框，氨基糖苷3-磷酸轉移酶基因(APH):黑色框。限制性位點H,HindIII；RV,EcoRV；K,KpnI；RI,EcoRI；SI,SalI；BI,BamHI；Bg,BglII；Sc,SacI;P，PstI;Sm，SmaI。圖2.質粒pK08-GAPpr(7.6kb)、pK08-GAPpr—SWA2(9.lkb)和pK08-GAPpr_XYN2(8.27kb)的線性圖譜。灰色框表示的是含LEU2基因的釀酒酵母基因組片段，黃色框表示的是HpGAP啟動子，HpAOX終止子藍色框，SWA2基因的ORF:紅色框，TrXYN2基因的ORF橙色框。限制性位點H,HindIII;Nd，NdeI；K,KpnI；RI,EcoRI；SI,SalI;BI，BamHI；Bg,BglII；Sc,SacI；P,PstI；Nt,NotI。圖3.質粒pXYN2(4·24kb)、pXYN2xlnD(7.6lkb)和p0R2(9.57kb)的線性圖譜。灰色框，含LEU2基因的釀酒酵母基因組片段；綠色框，HpGAP啟動子；橙色框，HpAOX終止子；藍色框，含黑曲霉xlnD基因ORF的片段；紅色框，含里氏木霉XYN2基因的ORF的片段。限制性位點H,HindIII；RV,EcoRV；K,KpnI；RI,EcoRI；SI,SalI；B,BamHI；Bg,BglII；Sc,SacI；P,PstI；Sm,SmaI；Xb,XbaI；Sp,SphI。圖4.含2%可溶性淀粉作為唯一碳源的YNB基本培養基中多形漢遜酵母重組體2Eth_leul-l/p0Rl#14’(A)和#7(B)在不同培養基pH下的乙醇生產量Ι-pH未校正；2-pH6；3-ρΗ5·5;48°C，135rpm。圖5.含3%或9%樺木木聚糖的YNB基本培養基中多形漢遜酵母重組菌株4952Eth-leul-l/p0R2在不同pH的培養基(A)和通氣條件(B)下的乙醇生產量。48°C。圖6.通過PCR對多形漢遜酵母轉化體的基因組DNA中HpGAP啟動子下的GAM1，SWA2,XYN2和xlnD基因進行證實。泳道##2，3:利用K43，Ko51引物對分析通過用質粒P0R2轉化獲得的轉化體，以顯示人工構建體與HpGAP啟動子和HpAOX終止子融合的里氏木霉ΧΥΝ20RF。泳道##4，5:利用Κ43，Κο47引物對分析由質粒p0R2獲得的轉化體，以顯示構建體與HpGAP啟動子融合的黑曲霉xlnD。泳道##6，7:利用K43，Ko49引物對分析由質粒pORl和pORll獲得的轉化體，以顯示構建體與HpGAPl啟動子融合的西方許旺酵母的GAMl0泳道##8，9:利用K43，Ko50引物對分析由質粒pORl和pORll獲得的轉化體，以顯示構建體與HpGAPl啟動子和HpAOX終止子融合的西方許旺酵母SWA2的ORF。泳道##1,10:DNA標準參照物。圖7.表達由HpGAPl啟動子驅動的西方許旺酵母SWA2基因和GAMl基因的多形漢遜酵母重組體形成的透明斑(halo)。由于SWA2基因和GAMl基因的天然啟動子的抑制，對照西方許旺酵母菌株在補充了葡萄糖的培養基上未產生斑(B)。第二個對照中的2Eth_leul-l菌株不能在以淀粉作為唯一碳源的培養基上生長(A)。圖8.含2%可溶性淀粉的YNB基本培養基中多形漢遜酵母重組菌株2Eth_leul_l/P0R1##7和14’的乙醇生產量，48°C，135rpm。圖9.重組菌株#7，14(4952EttTleul-l/p0Rl)，I，，2，，4，，2g(4952EttTleul-l/pORll)和受體菌株4952Eth_leul-l的培養基的SDS-PAGE分析。用8%的分離膠進行電泳，通過考馬斯染色和銀染顯示出蛋白條帶。A，葡糖淀粉酶的顯示；B，α-淀粉酶的顯示；α-淀粉酶的彌散條帶可能是糖基化的程度不同所造成。L，蛋白分子量標準參照物。圖10.多形漢遜酵母重組體##7，14(4952EttTleul-l/p0Rl)和多拷貝整合體##1，，2，，3，，4，和2g(4952Eth_leul_l/p0Rll)形成的透明斑。圖11.斑點印跡Southern雜交的結果顯示了多形漢遜酵母轉化體中編碼淀粉降解酶的基因的拷貝數。利用HpGAP啟動子作為探針。菌株l_wt(l拷貝標準)；2，3-##7，14(約3-4拷貝)；4，5，7-分別為##1’，2’，4’，(約6-8拷貝);6_#3，(3拷貝)。圖12.含3-4個淀粉酶基因拷貝的重組酵母菌株##7，14，6(4952Eth_leul-l/pORl)和含6-8個基因拷貝的##1’，2’，4’和2g(4952Eth_leul_l/p0Rll)的培養基中的α-淀粉酶(A)和葡糖淀粉酶(B)的比活性。圖13.多形漢遜酵母重組體2Eth-leul_l/p0Rl的乙醇生產量(#1:菌株##7和14的平均乙醇生產量)和2Etrieul-l/pORll(#2:菌株##1’，2’，4’，2g的平均乙醇生產量)的乙醇生產量。菌株在含3%可溶性淀粉的YNB基本培養基中進行培養，pH5.5，48°C，135rpm。圖14.含3%可溶性淀粉的基本培養基中，過表達淀粉分解酶基因和roCl基因的多形漢遜酵母菌株的乙醇生產量；48°C，135rpm。4’，轉化體4952Eth-leul_l/p0Rll(受體菌株，對照)；6p,10,12,轉化體4’/pIoxZeoloxPDClHpο圖15.由多形漢遜酵母重組體#6p(4，/ploxZeoloxPDClHp)及其衍生物整合體##1，2，2-1，3，4，5，7，9，10(6p/p0Rl)形成的透明斑。圖16.在47°C，限制性通氣條件下，含3%可溶性淀粉的基本培養基中，過表達淀粉降解酶和Pdclp的多形漢遜酵母菌株的乙醇生產量。4’，轉化體4952Eth_leul-l/p0Rll;6p，轉化體4’/ploxZeoloxPDClHp;3,4,5,轉化體6p/p0Rl。圖17.表達木聚糖內切酶基因和木糖苷酶基因的多形漢遜酵母重組體在以木聚糖作為唯一碳源的培養基上的生長。Α，表達木聚糖內切酶基因和β-木糖苷酶基因的重組菌株(菌株##6Χ和8Χ)在以木聚糖作為唯一碳源的固體培養基上的生長。B，在含3%來自樺木的木聚糖(BI)或2%木糖(Β2)的液體基本培養基中表達木聚糖內切酶基因和木糖苷酶基因的菌株在生長期間的生物質累積，48°C，240rpm。6X，8X，轉化體4952Eth_leul_l/p0R2。圖18.表達黑曲霉xlnD基因和里氏木霉XYN2基因的多形漢遜酵母重組體所形成的黃斑(A)或透明斑⑶。圖19.多形漢遜酵母在重組菌株4952Eth7pOR2##6X和8X的培養基中的木聚糖內切酶㈧和β_木糖苷酶⑶的比活性。圖20.Α.含與SWA2基因(SEQ.1DNOI)和多形漢遜酵母AOX終止子(雙下劃線)可操作地連接的多形漢遜酵母GAP啟動子(單下劃線)的重組構建體序列。B.來自西方許旺酵母的由SWA2基因編碼的α-淀粉酶的氨基酸序列(SEQ.1DΝ02)。圖21.Α.含與GAMl基因(SEQ.1DNO3)和多形漢遜酵母AOX終止子(雙下劃線)可操作地連接的多形漢遜酵母GAP啟動子(單下劃線)的重組構建體序列。B.來自西方許旺酵母的由GAMl基因編碼的葡糖淀粉酶(SEQ.1DNO4)的氨基酸序列。圖22.Α.含與黑曲霉的xlnD基因(SEQ.1DNO5)可操作地連接的多形漢遜酵母GAP啟動子(單下劃線)的重組構建體序列，該xlnD基因包括內源性終止子序列(SEQ.1DNO9，雙下劃線)。B.由xlnD基因編碼的β-木糖苷酶的氨基酸序列(SEQ.1DNO6)。圖23.Α.含與里氏木霉的Xyn2基因(SEQ.1DNO7)可操作地連接的多形漢遜酵母GAP啟動子(單下劃線)的重組構建體序列，該Xyn2基因包含內源性終止子序列(SEQ.1DNO10，雙下劃線)。B.由Xyn2基因編碼的β-木聚糖內切酶的氨基酸序列(SEQ.1DNO8)。方法、菌株和結果的詳述菌株和培養某利用異丙基蘋果酸脫氫酶缺陷的且不能在乙醇中生長的多形漢遜酵母菌株4952Eth_leul-l[14]作為受體，以分離淀粉降解重組體和木聚糖降解重組體。該菌株是NCYC495Ieul-1的衍生物[8]。在37°C或48°C使酵母菌株和轉化體在YPD(O.5%酵母提取物，1%蛋白胨，2%葡萄糖)培養基或基本培養基(無氨基酸的O.67%YNB,2%葡萄糖，3%可溶性淀粉(SigmaS2630-500G)或3%來自樺木的木聚糖(FlukaX0502-100G))上生長。對于4952Eth_leul-l菌株，培養基中再加入亮氨酸(40mg/L)。在YPD上選擇酵母轉化體時，加入O.2mg/L的G418(遺傳霉素)或150ug/ml的博萊霉素(zeocine)。利用大腸桿菌(E.coli)DH5α菌株[C>80dlacZΔΜ15,recAl,endAl,gyrA96,thi_l,hsdR17(rK、m+K),supE44,relAl,deoR,Δ(lac-ZYA-argF)U169]作為宿主進行質粒擴增。按以前所報道的那樣在37°C的LB培養基中培養該菌株[27]。轉化的大腸桿菌細胞在含100mg/L氨芐青霉素的培養基上進行培養。DNA摶術應用標準克隆技術[27]。利用WizardsPlusSV小量制備DNA純化系統(WizardsPlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem,Promega,Madison,WI,USA)從大腸桿菌中分離出質粒DNA。利用Wizards基因組DNA純化試劑盒(WizardsGenomicDNAPurificationKit,Promega,Madison,WI,USA)分離多形漢遜酵母、西方許旺酵母、里氏木霉和黑曲霉的基因組DNA。按照制造商說明書，使用限制性核酸內切酶，T4DNA連接酶和T4DNA聚合酶(Fermentas,Vilnius,Lithuania)。用0.8%的瓊脂糖凝膠(FisherScientific,FairLawn,NJ,USA)在IXTAE中分離DNA片段[27]。用DNA凝膠提取試劑盒(DNAGelExtractionKit,Millipore,Bedford,MA,USA)從凝膠中分離片段。TaqDNA聚合酶和高保真混合聚合酶(HighFidelityMixPolymerase,兩者均為Fermentas,Vilnius,Lithuania)分別用于分析性PCR和制備性PCR。在GeneAmpsPCRSystem9700循環變溫器(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)中進行PCR。通過電穿孔轉化多形漢遜酵母按以前所述進行[5]。攜帶西方許旺酵母的α-淀粉酶基因和葡糖淀粉酶基因的質粒的構建利用PCR將編碼葡糖淀粉酶的GAMl基因的開放閱讀框(ORF)和天然終止子(3.27kb)從西方許旺酵母菌株NRRLY-2470的基因組DNA中分離出來，所用引物為Ko48(CCCAAGCTTATGATTTTTCTGAAGCTG)和Ko49(GGAAGATCTTTCTTTACAAGACCAATG)。將HindIII和BglII的限制性位點加入到引物Κο48和Κο49中(下劃線所示為切割位點)。PCR產物用限制性核酸內切酶HindIII和BglII消化，然后置于被HindIII和BamHI消化后的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的強組成型啟動子(HpGAPpr)下。通過雙重連接的方式將構建體HpGAPpr+GAMl插入到質粒pUC57的BamHI位點。所得質粒被命名為pGAMl，并且在如下構建中用作載體(圖1)。利用PCR對編碼α-淀粉酶的SWA2基因的0RF(2kb)進行擴增，所用引物為SWAl(TAGTCGCATATGAGATTTTCAACTGAAGG)，SWA2(CTATTGATTGCAGATGCCAGATCCC)，以西方許旺酵母NRRLY-247的基因組DNA作為模板。將限制性位點NdeI加入到引物SWAl中。用NdeI對PCR產物的5’端進行消化，而補平3’端。將產物插入到質粒pK08-GAPpr中(圖2)。將SWA2基因的ORF置于HpGAPpr之下并與HpAOX終止子(HpAOXtr)融合。利用構建的質粒pK08-GAPpr_SWA2作為樽板，使用引物K43(CCGGATCCCAATTATCATTAATAATC),Ko51(CGCGGATCCAATCTTGCCTTTAAAATG)，通過PCR對含HpGAPpr+SWA2_0RF+HpA0Xtr的DNA片段進行擴增。所得PCR產物用限制性內切酶BamHI進行消化，然后插入到質粒PGAMl的BamHI位點中。將該構建質粒命名為pGAMlSWA2(圖1)。將釀酒酵母LEU2基因(選擇性標記物)插入到質粒PGAM1SWA2的PstI限制性位點中，并將所得構建體命名為PORl(圖1)。用限制性核酸內切酶PstI消化質粒pGLG61后從中分離在酵母中賦予對G418的抗性的氨基糖苷3-磷酸轉移酶基因(ΑΡΗ)。將含該基因的pGLG61[30]的Pst1-片段與攜帶重組基因GAM1、SWA2和細菌部分基因但是沒有釀酒酵母LEU2基因的質粒pORl的PstI部分相連接。所得質粒命名為PORll(圖1)。在多形漢遜酵母中表達的SWA2和GAMl重組構建體的序列分別如圖20和圖21所分別攜帶早.氏木霉與黑曲霉的木聚糖內切酶基因和P-木糖苷酶基因的質粒的構建編碼β-木糖苷酶的xlnD基因來自真菌黑曲霉。利用引物Ko46(TGCTCTAGAATGGCGCACTCAATGTCTCG)和Ko47(CCCGAGCTCAGCTATGCTAGCAAGCAGC)將xlnD基因的ORF與天然終止子(2.79kb)從黑曲霉菌株NRRL3的基因組DNA中分離出來。PCR產物用限制性內切酶SacI和XbaI(這些核酸內切酶的位點位于產物兩側)進行處理，然后置于HpGAPpr之下。將構建體HpGAPpr+xlnD插入到質粒pUC57的SacI位點。所得質粒命名為pxlnD，并在以后的構建中用作載體(圖3)。利用PCR對無內含子區域的編碼木聚糖內切酶(O.67kb)的XYN2基因的ORF進行擴增，所用引物為TRl(TTCTCACATATGGTTGCCTTTTCCAGCCCTCATCTGCGC)，TR2(CTAGTTGCTGACACTCTGTGAGGCAGAACCACTACCACC),TRir(GAGCCGCCAAAGTTGATGGGAGCAGAAGATCCAGTCGTC)，TRif(GACGACTGGATCTTCTGCTCCCATCAACTTTGGCGGCTC)，模板為里氏木霉NRRL11460的基因組DNA。PCR產物的5’端用NdeI進行消化，而3’端被補平。將產物插入到質粒pK08-GAPpr(圖2)中。將XYN2基因的ORF置于HpGAPpr之下，并用HpAOXtr終止。以所得質粒pK08_GAPpr_XYN2(圖2)作為模板，利用PCR對含HpGAPpr+0RF_XYN2+HpA0Xtr的DNA片段進行擴增，引物為K43(CCGGATCCCAATTATCATTAATAATC)、Ko50(GGAAGATCTAATCTTGCCTTTAAAATG)。所得PCR產物用限制性內切酶BamHI和Bgl11進行消化后插入到質粒pxlnD的BamHI位點中。所構建質粒被命名為pxlnDXYN2(圖3)。將釀酒酵母的LEU2基因插入到質粒pxlnDXYN2的PstI位點中，并且最終獲得質粒命名為p0R2(圖3)。在多形漢遜酵母中表達的XylD和XYL2重組構建體的序列分別如圖22和圖23所/Jnο篩選淀粉酶活性將用攜帶α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的基因的質粒轉化后所獲得的重組菌株接種于含2%可溶性淀粉(Sigma)作為碳源的基本培養基平板上，然后對重組菌體中的淀粉酶活性進行篩選。將平板在37°C下孵育兩天，然后保持在4°C過夜。淀粉降解酶的克隆可通過菌落周圍的透明斑來檢測[4，16]。篩詵木聚糖內切酶活件將相應的轉化體鋪板于含O.2%的4-0-甲基-D-葡萄糖醛_D_木聚糖-雷瑪唑亮藍(RBB)-木聚糖(Sigma)和2%的葡萄糖作為碳源的基本培養基上，然后對轉化體的木聚糖降解能力進行篩選。將平板在37°C下孵育3-4天。木聚糖內切酶將RBB-木聚糖剪切生成無色產物，在菌落的周圍形成透明斑[11，20]。篩詵β_木糖苷酶活件將相應的轉化體鋪板于含ImM對硝基苯基-β-D-木糖苷(PNPX)和2%的葡萄糖作為碳源的基本培養基上，然后對轉化體的β_木糖苷酶活性進行篩選。將平板在37°C下孵育1-3小時。通過菌落周圍所產生的黃斑對酶活性進行檢測[19]。α-淀粉酶和葡糖淀粉酶活性分析利用適度稀釋的無細胞培養物進行酶分析。利用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法對總淀粉酶活性進行測定。用200μI的O.4Μ含2%可溶性淀粉的醋酸鈉緩沖液(pH5.O)與50μI等份的培養上清在50°C下孵育30分鐘。將混合物煮沸10分鐘以終止反應。α-淀粉酶的I個活性單位的定義為，在同樣培養條件下每分鐘每毫升釋放Iμmol的還原糖所需的酶的量[17，22]。在葡糖淀粉酶活性的分析中，在30°C將O.9ml煮沸淀粉溶液保持在醋酸鈉緩沖液(pH5.5)中5分鐘，然后加入O.1ml的樣品，并將混合物孵育15分鐘。然后通過煮沸反應混合物10分鐘終止反應，并利用“Diagluc”分析試劑盒(UBT,Lviv,Ukraine)測定所生成的葡萄糖的濃度[9]。通過用總淀粉酶活性減去葡糖淀粉酶活性計算出α-淀粉酶的活性。葡糖淀粉酶的I個活性單位定義為每分鐘從底物釋放Iμmol的葡萄糖所需的酶的量[28]。g-木糖苷酶和木聚糖內切酶活性分析產酶培養物在3ml的YPD中過夜培養。通過離心收集細胞，并且上清液用于酶活性測定。用Bailey等報道的方法[I]在50°C時用1%的樺木木聚糖(Fluka)作為底物對β-1,4-木聚糖內切酶活性進行分析。用50mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.O)中的適度稀釋的無細胞培養物溶液作為酶源。通過二硝基水楊酸方法測定所釋放的糖的量[20]。利用濃度為5mM的生色底物PNPX對β-木糖苷酶進行定量。以上清作為β-木糖苷酶的來源進行活性測定分析。所有活性均以開特/ml來表示；一開特指每秒從樺木木聚糖或生色底物中產生Imol還原糖所需的酶的量[19]。乙醇牛產量分析對于乙醇生產量，在48°C、準好氧條件下在含3%可溶性淀粉或3%來自樺木的木聚糖的液體基本培養基中對多形漢遜酵母轉化體進行4天的培養。每24小時用“Alcotest”試劑盒測定培養基中的乙醇濃度[10]。pH和通氣對淀粉發酵為乙醇的效力的影響對所分離的轉化體將淀粉直接發酵成乙醇的最佳條件進行研究。在48°C下，用盛有50mlYPD培養基的125ml維形燒瓶在搖床InkubatorlOOOHeidolph(Schwabach,Germany)中對酵母菌株預培養48小時,振搖設置在220rpm。將該細胞以2mg/ml的濃度接種于50ml含3%馬鈴薯可溶性淀粉作為唯一碳源的基本培養基中。對淀粉發酵過程中培養基的pH對乙醇生產量的影響進行研究。α-淀粉酶的最佳pH為約6.O,且葡糖淀粉酶為5.2-5.5。用pH5.5和6.O的培養基進行發酵。用IM磷酸鉀緩沖液對培養基的PH進行調整。最優乙醇生產量是在pH為5.5的培養基中(圖4A&B)。研究了通氣對發酵效率的影響。對120rpm至180rpm的轉速進行檢測。當135rpm旋轉時獲得最高乙醇生產量。pH、通氣和底物濃度對木聚糖發酵為乙醇的效力的影響對所分離的轉化體將樺木木聚糖發酵成乙醇的最佳條件進行研究。在48°C下，用盛有50mlYPD培養基的125ml錐形燒瓶對酵母菌株預培養48小時，振搖設置在220rpm。然后在4000rpm下離心5分鐘除去細胞，洗滌并接種(濃度為2mg/ml)于50ml含3%或9%樺木木聚糖和O.05%葡萄糖作為碳源的基本培養基中。對木聚糖發酵過程中培養基的pH對乙醇生產量的影響進行研究。用PH4.5和5.8的培養基進行發酵。IM磷酸鉀緩沖液的溶液以在培養基中的O.1M終濃度對培養基的pH進行調整。培養基pH為5.8時獲得乙醇最優生產量(圖5A)。研究通氣對發酵效率的影響。對120rpm至180rpm的轉速進行檢測。在120rpm的情況下獲得最高乙醇生產量(圖5B)。較高的木聚糖濃度(9%)導致更好的乙醇生產量(圖5)。Southern印跡雜交按照產品手冊利用非放射性的AmershamECL直接核酸標記和檢測系統(GEHealthcare,USA)進行探針DNA的標記和雜交。定于定量的Southern斑點印記,將所制備的一系列稀釋的酵母基因組DNA在O.4MNaOH中變性，點在干燥尼龍膜上(HybondN+，AmershamPharmaciaBiotech)并用合適的DNA片段進行標記,然后用上述的AmershamECL檢測試劑盒進行顯示。用HpGAPpr作為探針。凝月交電泳用Laemmli的方法進行SDS_PAGE[19]。用銀染法和考馬斯亮藍染色法使無細胞提取物中的濃縮蛋白顯示。電泳凝膠和濃縮膠的濃度分別為12%和5%的聚丙烯酰胺。將20μI的Laemmli溶液加入到20μI的樣品中，然后取35μI的混合物注入到電泳凝膠中。MS多形漢猻酵母中西方許旺酵母的SWA2和GAMl某閔的表汰將多形漢遜酵母菌株4952Eth_leul_l作為受體，利用被SphI線性化的質粒PORl(質粒圖譜如圖1所示)進行轉化。轉化后細胞鋪板于補充了2%葡萄糖和1%可溶性淀粉的基本培養基上。在約140個轉化體中挑選出了形成最大淀粉降解透明斑的14個轉化體。通過PCR利用相應引物顯示這些轉化體中在HpGAPpr之下的SWA2基因和GAMl基因的存在(圖6)。轉化體能夠在可溶性淀粉上生長，并且在37°C和48°C時將底物發酵生成乙醇。通過菌落周圍的透明斑的形成顯示整合體中淀粉酶的有效分泌(圖7A&B)。在48°C，pH5.5條件下，所選出的最佳整合體(2Eth_leul-l/pORl#7)在含3%可溶性淀粉的基本培養基中發酵48小時后產出3g/L以上的乙醇(圖8)。為獲得具有增加的淀粉降解活性的多形漢遜酵母菌株，我們嘗試提高SWA2和GAMl的拷貝數。基于此目的使用了攜帶顯性標記(賦予對G418的抗性的APH基因)以及SWA2和GAMl基因的質粒pORll。將多形漢遜酵母菌株4952Eth_leul-l作為受體，利用被SphI線性化的質粒pORll進行轉化。轉化以后，細胞被鋪板于含O.2g/lG418的YPD培養基上。在所得約80個G418-抗性菌落中發現并挑選出5個穩定轉化體。通過PCR方法利用相應引物，顯示這些轉化體中在HpGAPpr之下的SWA2基因和GAMl基因的存在(圖6)。通過SDS-PAGE對這些菌株所生產的重組酶(α-淀粉酶和葡糖淀粉酶)進行驗證(圖9Α&Β)。用質粒pORll轉化后的分離物與早期從pORl質粒中分離的最佳轉化體相比，所形成的淀粉降解透明斑更大(圖10)。Southern雜交驗證了分離的轉化體中約存在6_8個拷貝的SWA2基因和GAMl基因(圖11)。與僅含3-4個拷貝淀粉酶基因的菌株相比，轉化體4952Eth_leul-l/p0Rll表現出了更高的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶活性(圖12Α&Β)。對分離的轉化體的乙醇淀粉發酵效力進行研究。與pORl轉化后早期分離的轉化體相比，這些轉化體顯示出了增高的乙醇生產量(72小時培養后，6.5g/L)。在pH5.5，48°C，135rpm條件下，在含3%可溶性淀粉的基本YNB培養基中進行發酵(圖13)。具有改良的淀粉發酵性質的多形漢遜酵母菌株的分離利用本實驗室早期構建的質粒ploxZeoloxroClHp獲得具有改良的淀粉降解性質的多形漢遜酵母菌株。在過表達丙酮酸脫羧酶基因(PDCl)后，這些菌株與對照菌株4952Eth_相比其特征在于乙醇生產量增高[14]。含HpGAPpr驅動的roCl基因的質粒ploxZeoloxroClHp經過BamHI線性化并用于早期分離的菌株#4’(4952Eth7pORl)的轉化。用補充150μg/ml博萊霉素的YH)培養基對博萊霉素抗性轉化體進行選擇。選出一些穩定的整合體用于進一步研究。對這些重組體的乙醇發酵效力進行研究。與4’菌株相比(至多4g/L;圖14)，所有轉化體均表現出較高水平的乙醇生產量(7-8g/L)。利用菌株#6(轉化體4’/ploxZeoloxroClHp，表現出最高水平的乙醇生產量)作為受體，用經過SphI線性化的質粒pORl進行轉化。在無亮氨酸的基本培養基中選擇Leu+轉化體，并使其穩定化。將穩定轉化體鋪板于補充2%可溶性淀粉的基本培養基上。與菌株#6相比形成了更大的透明斑的一些整合體被選擇用于進一步研究(圖15)。對這些重組體的乙醇發酵效力進行研究。與菌株#6相比時，所有轉化體均表現出較高水平的乙醇生產量(9-10g/L)。多形漢遜酵母中早.氏木霉XYN2基因和黑曲霉XLND基因的表達包含用HpGAPpr(圖3)驅動的里氏木霉XYN2基因和黑曲霉xlnD基因的質粒p0R2被SphI線性化并用于多形漢遜酵母菌株4952Eth_leul-l的轉化。Leu+轉化體被穩定化。通過PCR利用相應引物對轉化體中HpGAPpr之下的XYN2和xlnD基因的存在進行檢測(圖6)。轉化體能夠在木聚糖為唯一碳源生長(圖17，A、B1和B2)。木聚糖內切酶和β-木糖苷酶在整合體中的有效分泌是通過在分別含O.2%RBB-木聚糖或ImMPNPX的培養基上形成的透明斑或黃斑來顯示的(圖18A和18B)。對兩種酶的活性進行測定(圖19A和19B)。在37和48°C時，轉化體能夠以低效率將樺木木聚糖發酵為乙醇(約O.35g/L)。多形漢遜酵母中里氏木霉XYN2基因、黑曲霉XLND基因與西方許旺酵母SWA2基因和GAMl某因的共表汰在第一個實例中，將包含整合入多形漢遜酵母染色體的來自西方許旺酵母的α-淀粉酶基因和葡糖淀粉酶基因的轉化體4952Eth_leul-l/p0Rll用作宿主菌株。包含用HpGAPpr驅動的里氏木霉XYN2基因和黑曲霉xlnD基因的質粒p0R2被SphI線性化并用于轉化多形漢遜酵母菌株4952Eth_leul-l/p0Rll。按前述方法穩定轉化體。通過PCR利用相應引物檢測XYN2基因和xlnD基因的存在。轉化體能夠以可溶性淀粉和/或可溶性木聚糖作為唯一碳源生長。基本上按前述方法驗證所有四種酶的有效分泌。轉化體可在37°C和48V使含可溶性淀粉和樺木木聚糖的混合培養基發酵生成乙醇。在第二個實例中，具有已轉化到菌株中的α-淀粉酶基因和葡糖淀粉酶基因的前面所述的轉化體4’/ploxZeoloroClHp過表達PDC基因，用作宿主菌株。又一次，包含用HpGAPpr驅動的里氏木霉XYN2基因和黑曲霉xlnD基因的質粒p0R2被SphI線性化并用于多形漢遜酵母宿主菌株的轉化。按照前述方法穩定轉化體。通過PCR利用相應引物檢測XYN2和xlnD基因的存在。轉化體將能夠以可溶性淀粉和/或可溶性木聚糖作為唯一碳源生長。基本上按照前述方法驗證所有四種酶的有效分泌。與第一個實例中制備的轉化體相比，這些轉化體可在37°C和48°C使含可溶性淀粉和樺木木聚糖的混合培養基以更高水平發酵生成乙醇，這是由于宿主細胞中PDC酶的補合的(complimentary)過表達。討論由可再生植物材料進行燃料乙醇的生產具有巨大的經濟學和生態學意義。玉米纖維殼成分是來自容易大量獲得的玉米濕磨工業的副產物之一。該成分與其他加工副產物和來自乙醇發酵的釜餾物(Stillage)成分相混合和干燥來生產玉米麩質飼料。玉米纖維殼由35%的半纖維素、18%的纖維素和20%的淀粉組成(蛋白質、纖維油和木質素也包含在該材料中)[7]。木聚糖是半纖維素的主要成分。包括木聚糖和淀粉的酶水解在內的工業步驟是非常昂貴的。因此利用微生物將這些聚合物直接轉化成乙醇具有重要的經濟意義。為此目的，建立能夠在高溫下同時水解淀粉和木聚糖、并將所釋放的糖發酵為乙醇的微生物，對于由玉米生產燃料乙醇具有重要意義。葡萄糖和木糖分別是淀粉和木聚糖水解后釋放的主要糖類。多形漢遜酵母在高溫下將葡萄糖和木聚糖發酵為乙醇。但是多形漢遜酵母不能利用淀粉質材料和木聚糖作為唯一碳源并在其上生長。我們從西方許旺酵母中克隆了SWA2和GAMl兩種基因，它們分別編碼α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。這些酶均為淀粉水解所需。SWA2和GAMl基因在多形漢遜酵母中被成功表達。所分離的重組菌株能夠利用淀粉為唯一碳源進行生長。它們還能夠在48°C時使可溶性淀粉發酵為乙醇。我們顯示基因拷貝數的增加提高了重組菌株的淀粉水解能力和乙醇生產能力。分別編碼木聚糖內切酶和木糖苷酶的里氏木霉XYN2基因和黑曲霉xlnD基因在多形漢遜酵母中被克隆和表達。至少其中的兩種酶是木聚糖水解所需。所分離的整合體能夠利用木聚糖作為唯一碳源生長，并在37°C和48°C將其發酵為乙醇。所分離的菌株將木聚糖轉化為乙醇的低效力很可能是由于漢遜酵母菌株的原始的木聚糖乙醇發酵能力較低。所構建菌株在木聚糖發酵上進一步提高將需要木糖的乙醇發酵提高作為前提。這些菌株然后可作為受體用于構建有效的木聚糖降解重組體。參考文獻1.Bailey,M.J.，P.Biely，和Κ·Poutanen.1992.1nterlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity.(用于木聚糖酶活性分析的實驗室間檢測方法)J.Biotechnol.23:257-270.2.Banatj1.M.，P.NigamjD.singh，P.Marchantj和A.P.McHale.1998.Ethanolproductionatelevatedtemperaturesandalcoholconcentrations.Part1:yeastsingeneral.(高溫下的乙醇生產和酒精濃度。第一部分酵母概述)WorldJMicrobiolBiotechnol.14:809-821.3.Dmytrukj0·V.，A.Y.Voronovsky,C.A.Abbas,Κ.V.Dmytrukj0.P.1shchukj和A.A.Sibirny.2008.OverexpressionofbacterialxyloseisomeraseandyeasthostxylulokinaseimprovesxylosealcoholicfermentationinthethermotolerantyeastHansemulapolymorpha.(耐熱酵母多形漢遜酵母中細菌木糖異構酶和酵母宿主木酮糖激酶的過表達改善了木糖的醇發酵)FEMSYeastRes8:165-1734.EksteenjJ.M.，P.vanRensburgjR.R.CorderoOteroj和1.S.Pretorius.2003.StarchfermentationbyrecombinantSaccaromycescerevisiaestrainsexpressingthea-amylaseandglucoamylasegenesfromLipomyceskononenkoaeandSaccharomycopsisfibuligera.(由表達橘林油脂酵母和扣囊復膜孢酵母來源的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶基因的重組釀酒酵母菌株進行的淀粉發酵)Biotechnol.Bioengineer84:639-646.5.Faber,KNjP.HaimajW.Harder,M.Veenhuisj和G.Ab.1994.Highly-efficientelectrotransformationoftheyeastHansenulapolymorpha.(多形漢遜酵母的高效電轉化。)Curr.Genet.25:305-310.6.FujitajY.,和J.1to.2004.Synergisticsaccharification,anddirectfermentationtoethanol,ofamorphouscellulosebyuseofanengineeredyeaststraincodisplayingthreetypesofcellulolyticenzyme.(利用同時表現三種類型的纖維素分解酶的工程改造的酵母菌株對非晶型纖維素進行協同糖化和直接乙醇發酵)Appl.Environ.Microbiol.70:1207-1212.7.Gaspar，Μ·，G.Kalman，和K.Reczey.2007.Cornfiberasarawmaterialforhemicelluloseandethanolproduction.(玉米纖維作為半纖維素和乙醇生產的原材料)ProcessBiochem.42:1135-1139.8.GellissenjG.，G.KunzejC.GaillardinjJ.M.CreggjE.BerardijM.Veenhuisj和1.vanderKle1.2005.NewyeastexpressionplatformsbasedonmethylotrophicHansenulapolymorphaandPichiapastorisandondimorphicArxulaadeninivoransandYarrowialipolyticaacomparison.(基于甲基營養型多形漢遜酵母和巴斯德畢赤酵母與基于二形性Arxulaadeninivorans和解脂耶氏酵母的新型酵母表達平臺進行的比較)FEMSYeastRes.5:1079-1096.9.Gonchar,Μ.V.1998.Sensitivemethodforquantitativedeterminationofhydrogenperoxideandoxidasesubstratesinbiologicalsamples.(對生物樣品中的過氧化氫和氧化酶底物進行定量測定的靈敏方法)Ukr.Biokhim.Zh.70:157-163.10.Gonchar，M.V.，Μ·Μ·Maidan和A.A.Sibirny.2001.Anewoxidase-peroxidasekitforethanolassaysinalcoholicbeverages.(一種對酒精飲料進行乙醇分析的新型氧化酶_過氧化物酶試劑盒)FoodTechnol.Biotechnol.39:37-42.11.denHaanR.，和W.H.vanZyl.2001.DifferentialexpressionoftheTrichodermareeseiβ-xylanaseII(xyn2)geneinthexylose-fermentingyeastPichiastipitis.(里氏木霉β_木糖苷酶II(xyn2)基因在發酵木糖的酵母樹干畢赤酵母中的差異表達)ApplMicrobiolBiotechnol.57:521-527.12.Haki，G.D.，和S.K.Rakshit.2003.Developmentsinindustriallyimportantthermostableenzymes:areview.(工業中重要的熱穩定性酶的發展綜述)BioresourceTechnology.89:17-34.13.1shchukjO.P.，A.Y.Voronovsky,0·V.StasykjG.Ζ·GaydajΜ.V.Gonchar,C.A.Abbas,和A.A.Sibirny.2008.1mprovementofxylosehigh-temperaturefermentationinHansenulapolymorphaduetooverexpressionofthePDClgenecodingforpyruvatedecarboxylase.(多形漢遜酵母中由于編碼丙酮酸脫羧酶的PDCl基因的過表達改良了木糖的高溫發酵)FEMSYeastRes.1npress.14.Jeffries,T.W.,和Υ·S.Jin.2000.Ethanolandthermotoleranceinthebioconversionofxylosebyyeasts.(酵母的木糖生物轉化中的乙醇和耐熱性)Adv.Appl.Microbiol.47:221-268.15.KadamjK.L.，和S.L.Schmidt.1997.EvaluationofCandidaacidothermophiIuminethanolproductionfromlignocellulosicbiomass.(CandidaacidothermophiIum由木質纖維素生物質進行乙醇生產的評估)Appl.Microbiol.Biotechnol.48:709-713.16.KangjN.Y.，J.N.Park,J.Ε·Chin,H.B.Lee，S.Y.1mj和S.Ba1.2003.ConstructionofanamylolyticindustrialstrainofSaccharomycescerevisiaecontainingtheSchwanniomycesoccidentalisa-amylasegene.(含西方許旺酵母α-淀粉酶基因的釀酒酵母的淀粉降解工業菌株的構建)Biotechnol.Lett.25:1847-1851.17.KilicjD.,和B.Ozbek.2004.a-Amylaseinactivationbytemperatureduringstarchhydrolysis.(淀粉水解期間的溫度導致的α-淀粉酶失活)ProcessBiochem.39:1139—1144.18.KulkarnijN.,A.Shendyej和Μ·Rao.1999.Molecularandbiotechnologicalaspectsofxylanases.(木聚糖酶的分子和生物技術方面)FEMSMicrobiol.Rev.23:411-456.19.LaGrange,D.C.,1.S.Pretorius,M.Claeyssensj和W.Η·vanZyl.2001.DegradationofxylantoD-xylosebyrecombinantSaccharomycescerevisiaecoexpressingtheAspergillusnigerβ-xylosidase(xlnD)andtheTrichodermareeseixylanaseII(xyn2)genes.(共表達黑曲霉β-木糖苷酶基因(xlnD)和里氏木霉木聚糖酶II(xyn2)基因的重組釀酒酵母將木聚糖降解為D-木糖)Appl.Environ.Microbiol.67:5512-5519.20.LaGrange,D.C.,1.S.Pretorius,和W.Η·vanZyl.1996.ExpressionofaTrichodermareeseiβ-xylanasegene(XYN2)inSaccharomycescerevisiae.(里氏木霉β-木聚糖酶基因(ΧΥΝ2)在釀酒酵母中的表達)Appl.Environ.Microbiol.62:1036-1044.21.LaemmlijU.K.1970.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.(T4嗷菌體的頭部組裝期間結構蛋白的裂解)Nature.227:680-685.22.LiujZ.,G.Zhangj和S.Liu.2004.ConstructinganamylolyticbrewingyeastSaccharomycespastorianussuitableforacceleratedbrewing.(適合于力口速酉良造的淀粉降解釀酒酵母巴斯德酵母的構建)J.Biosc1.Bioeng.98:414-419.23.Marin,D.,A.Jimenezj和M.FernandezLobato.2001.ConstructionofanefficientamylolyticindustrialyeaststraincontainingDNAexclusivelyderivedfromyeast.(僅含酵母來源DNA的高效淀粉降解工業酵母菌株的構建)FEMSMicrobiol.Lett.201:249_253·24.Mosier，N.，和C.Wyman.2005.Featuresofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass.(預處理木質纖維素生物質的有前景的技術的特征)Bioresour.Technol.96:673-686.25.Piontek，M.，J.Hagedorn，C.P.Hollenberg，G.Gellissen，和A.W.M.Strasser.1998.TwonovelgeneexpressionsystemsbasedontheyeastsSchwanniomycesoccidentalisandPichiastipitis.(基于西方許旺酵母和畢赤酵母的兩種新穎的基因表達系統)Appl.Microbiol.Biotechnol.50:331-338.26.Ryabova,0.Β.,0.M.Chmil和Α·Α·Sibirny.2003.XyloseandcellobiosefermentationtoethanolbythethermotolerantmethylotrophicyeastHansenulapolymorpha.(木糖和纖維二糖由耐熱甲基營養型酵母多形漢遜酵母發酵為乙醇)FEMSYeastRes.4:157—164.27.Sambrook，J.，E.F.Fritsh，和T.Maniatis.MolecularCloning:ALaboratoryManual.(分子克隆實驗室手冊)ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork.1989.28.ShigechijΗ.，Y.FujitajJ.KohjM.UedacjH.Fukudaj和A.Kondo.2004.Energy-savingdirectethanolproductionfromlow-temperature-cookedcornstarchusingacell—surfaceengineeredyeaststrainco-displayingglucoamylaseanda-amylase.(利用共表現葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的具有工程改造的細胞表面的酵母菌株由低溫蒸煮的玉米淀粉進行節能的直接乙醇生產)Biochem.Eng.J.18:149-153.29.ShigechijH.，J.KohjΥ·FujitajΤ·MatsumotojY.BitojΜ.UedajΕ·SatohjH.Fukudaj和A.Kondo.2004.Directproductionofethanolfromrawcornstarchviafermentationbyuseofanovelsurface-engineeredyeaststraincodisplayingglucoamylaseanda-amylase.(利用共表現葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的具有新穎的工程改造的表面的酵母菌株由原料玉米淀粉經發酵進行直接的乙醇生產)Appl.Environ.Microbiol.70:5037-5040.30.Sohn，J.Η.，E.S.Choi,H.A.Kang,J.S.Rhee，M.0.Agaphonov,M.D.Ter-Avanesyanj和S.K.Rhee.1999.Adominantselectionsystemdesignedforcopynumber-controlledgeneintegrationinHansenulapolymorphaDL-L(用于多形漢遜酵母DL-1中拷貝數受控的基因的整合所設計的顯性選擇系統)ApplMicrobiolBiotechnol.51:800-807.31.TorronenjA.，L.R.MachjR.Massner,R.Gonzales,N.KalkkinenjA.Harkkij和C.P.Kubicek.1992.ThetwomajorxylanasesfromTrichodermareese1:characterizationofbothenzymesandgenes.(來自里氏木霉的兩種主要木聚糖酶酶和基因的表征)Biothechnology.10:1461-1465.32.UlgenjK.0.,andB.Saygih.2002.BioconversionofstarchintoethanolbyarecombinantSaccharomycescerevisiaestrainYPG-AB.(由重組釀酒酵母菌株YPG-AB進行的淀粉生成乙醇的生物轉化)ProcessBiochem.37:1157-1168.33.deVries,R.P.和J.Visser.2001.Asperillusenzymesinvolvedindegradationofplantcellwallpolysaccharides.(植物細胞壁多糖降解所涉及的黑曲霉的酶類)Microbiol.Mol.Biol.Rev.65:497-522.34.Wang,T.T.,L.L.Linj和W.H.Hsu.1989.CloningandexpressionofaSchwanniomycesoccidentalisa-amylasegeneinSaccharomycescerevisiae.(釀酒酵母中的西方許旺酵母α-淀粉酶基因的克隆和表達。)Appl.Environment.Microbiol.55:3167-3172.35.Zaldivar，J.，J.Nielsen，和LOlsson.2001.Fuelethanolproductionfromlignocellulose:achallengeformetabolicengineeringandprocessintegration.(由纖維木質素生產燃料乙醇對于代謝工程和工藝整合的挑戰)ApplMicrobiolBiotechnol.56:17-權利要求1.一種多形漢遜酵母菌株，所述多形漢遜酵母菌株包含編碼木聚糖內切酶的至少一種基因和編碼β-木糖苷酶的至少一種基因，所述基因與在所述多形漢遜酵母菌株中表達所述基因的至少一種啟動子可操作地連接，并且所述酶以充足的量自所述多形漢遜酵母菌株輸出到培養基中，從而允許所述多形漢遜酵母菌株在只含可溶性木聚糖作為碳源的培養基中生長。2.根據權利要求1所述的多形漢遜酵母菌株，其中編碼所述木聚糖內切酶和木糖苷酶中至少其一的基因被整合入所述多形漢遜酵母的染色體中。3.根據權利要求1所述的多形漢遜酵母菌株，其中編碼所述木聚糖內切酶和木糖苷酶的所述基因中的每一種均被整合入所述多形漢遜酵母的染色體中。4.根據權利要求1所述的多形漢遜酵母菌株，其中編碼所述木聚糖內切酶或木糖苷酶的所述基因中的至少一種是從選自由黑曲霉(Aspergillusniger)和里氏木霉(Trichodermareseei)所組成的組的菌株獲得。5.根據權利要求1所述的多形漢遜酵母菌株，編碼所述木聚糖內切酶或所述木糖苷酶的所述至少一種基因還包括與所述基因可操作地連接以終止所表達的基因的轉錄的終止子。6.根據權利要求1所述的多形漢遜酵母菌株，其中所述啟動子包括從多形漢遜酵母獲得的HpGAP啟動子。7.根據權利要求1所述的多形漢遜酵母菌株，所述多形漢遜酵母菌株還包括編碼丙酮酸脫羧酶的基因，所述編碼丙酮酸脫羧酶的基因與在所述多形漢遜酵母菌株中表達所述丙酮酸脫羧酶的至少一種啟動子可操作地連接。8.—種制造乙醇的方法，所述方法包括使權利要求1所述的多形漢遜酵母菌株在促使所述多形漢遜酵母制造乙醇的條件下生長在含可溶性木聚糖的培養基中。9.一種重組核酸，所述重組核酸包含編碼木聚糖內切酶的基因和編碼木糖苷酶的基因中的至少一種，所述基因與從多形漢遜酵母獲得的HpGAP啟動子可操作地連接。10.根據權利要求9所述的重組核酸，其中滿足以下至少一項e.所述β-木糖苷酶由根據SEQID.NO5的核苷酸序列編碼；f.所述β-木糖苷酶具有根據SEQID.NO6的氨基酸序列；g.所述木聚糖內切酶由根據SEQID.NO7的核苷酸序列編碼；以及h.所述木聚糖內切酶具有根據SEQID.NO8的氨基酸序列。11.根據權利要求9所述的重組核酸，其中編碼所述β-木糖苷酶和木聚糖內切酶的所述基因還與內源性連接于所述基因的終止子核苷酸序列可操作地連接。12.根據權利要求11所述的重組核酸，其中內源性連接于所述基因的所述終止子核苷酸序列是根據SEQIDNO9和SEQIDNO10中的至少一項。全文摘要在多形漢遜酵母中克隆和表達了來自酵母西方許旺酵母的分別編碼α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的基因SWA2和GAMl。通過將SWA2基因和GAMl基因與多形漢遜酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(HpGAP)的強組成型啟動子可操作地連接后整合入多形漢遜酵母的染色體中而實現該表達。所得轉化體獲得在包含可溶性淀粉作為唯一碳源的基本培養基上生長的能力，并可在高溫發酵下由淀粉生產乙醇，高達10g/L。編碼木聚糖內切酶的XYN2基因是從真菌里氏木霉獲得，并且編碼β-木糖苷酶的xlnD基因是從真菌黑曲霉獲得。在HpGAP啟動子的控制下通過將這些基因整合入多形漢遜酵母染色體中還實現這些基因的共表達。所得轉化體能夠在補充樺木木聚糖作為唯一碳源的基本培養基上生長。木聚糖降解酶的成功表達得到能夠在48℃將樺木木聚糖發酵為乙醇的受體菌株。另外上述基因在過表達丙酮酸脫羧酶基因的多形漢遜酵母菌株中的共表達進一步提高乙醇生產量。文檔編號C12P7/06GK103060216SQ20121035641公開日2013年4月24日申請日期2009年5月6日優先權日2008年5月6日發明者查爾斯·阿巴斯,安德烈·希博尼,安德烈·Y·沃羅諾夫斯基申請人:阿徹丹尼爾斯米德蘭德公司