專利名稱：一種篩選人腫瘤相關的自然反義轉錄子的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術、生物醫藥領域，具體地，本發明涉及一種篩選人腫瘤相關自然反義轉錄子的方法。
背景技術：
自然反義轉錄子(natural antisense transcripts,以下稱NAT)通常是指自然情況下生物體內生成的反義RNA(antisense RNA),它們與其對應的互補RNA(compIementaryRNA)通過互補堿基配對,形成雙鏈的自然正義-反義轉錄子(natural sense-antisensetranscript,以下稱NSAT)，引起靶基因的降解或翻譯抑制來調控靶基因的表達。NAT按照其作用方式分為兩種大多數NAT來源于與正義轉錄子相同的基因組位點，由編碼正義轉 錄子的相對鏈所編碼，稱為順式編碼NAT (cis-NAT)，這類分子與靶基因的序列完全互補；與此相反，來源于與正義轉錄子不同的基因組位點的NAT稱為反式編碼NAT (trans-NAT),它們與靶基因序列只是部分互補。近年人們在研究NAT時發現，NAT表達水平的改變與人類腫瘤的發生和轉移等密切相關，因此，NAT的異常表達被認為是研究腫瘤中不可忽視的重要因素。由于NAT的重要功能，目前國內外的多家研究機構對其進行了深入研究，發現自然界中可能存在的NAT遠遠超出我們最初的預期。這些研究大多采用生物信息學預測的方法，具有方便、快捷等優點，但所得結果不夠可靠，且不能在特定的細胞或組織中系統篩選差異表達的NAT分子。為解決這些方法的局限和不足，我們利用雙鏈RNA分子能夠耐受RNaseI的降解，而單鏈RNA分子會被RNase I降解的原理，將提取的總RNA用RNase I酶切后再進行逆轉錄反應，就可以將在細胞內與祀分子以雙鏈的NSAT (natural sense-antisense transcripts)形式存在的NAT分子從總RNA中分離出來，而且這種方法排除了人為干擾因素，理論上用該方法得到的NSAT應為自然條件下生物體內真實存在的。運用該原理，結合抑制性消減雜交等實驗方法，我們就可以快速系統地篩選人正常細胞及對應的腫瘤細胞或正常組織及對應的癌組織間差異表達的NAT分子，從而獲得人腫瘤相關的NAT分子。

發明內容
本發明的目的在于提供一種基于RNase保護分析及抑制性消減雜交的人腫瘤相關自然反義轉錄子的新型篩選方法。為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案一種篩選人腫瘤相關的自然反義轉錄子的方法，包含以下步驟I)提取人正常細胞和對應的腫瘤細胞總RNA ；2)分別加入過量的DNase I和RNase I，酶切步驟I)獲得的人正常細胞及對應的腫瘤細胞總RNA，然后通過酚/氯仿抽提回收；3)以步驟2)中的雙鏈RNA為模板，以隨機六引物及逆轉錄酶將其反轉錄為cDNA ；4)以隨機六引物為引物，用T4DNA聚合酶催化合成cDNA第二鏈并補平末端；
5)以Rsa I酶切雙鏈cDNA，得到帶有平末端的酶切產物，回收純化后加雙蒸水；6)將步驟5)的檢測子cDNA分為兩份，一份連接SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，一份連接SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；驅動子(Driver) cDNA不連接頭；7)用T4DNA聚合酶補平粘末端，采用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀純化后，加適量雙蒸水溶解；8)以正常細胞和癌細胞互為檢測子和驅動子進行雙向抑制性消減雜交；其中在正向消減中，以癌細胞為檢測子，以正常細胞為驅動子；在反向消減中，以正常細胞為檢測子，以癌細胞為驅動子；9)將步驟8)的雜交產物用緩沖液稀釋后作為模板進行兩輪PCR擴增；PCR的引物核苷酸序列對應于SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
10)將步驟9)PCR擴增后的正向和反向消減雜交產物純化，后與pGEM-T載體連接克隆，并分別構建正向和反向cDNA消減雜交文庫，鑒定出陽性克隆后進行測序；11)根據步驟10)所獲得的測序結果進行分析，確定候選的靶分子。進一步地，步驟I)之后還包括檢測所提取的總RNA的步驟。進一步地，步驟3)中酶切條件為37°C水浴中酶切30min。進一步地，步驟5)中酶切雙鏈cDNA時間為2h。進一步地，步驟5)中加雙蒸水調整濃度至300ng/y I。進一步地，步驟9)中兩輪PCR擴增循環次數分別為28和12。本發明還提供一種根據上述方法篩選的人腫瘤相關的自然反義轉錄子在制備檢測腫瘤試劑盒中的應用。本發明還提供一種根據上述方法篩選的人腫瘤相關的自然反義轉錄子在制備檢測腫瘤制劑中的應用。本發明的優點及有益效果本發明所述的基于RNase保護分析及抑制性消減雜交的人腫瘤相關自然反義轉錄子的新型篩選方法可用于系統、快速的篩選人腫瘤相關自然反義轉錄子，通過在多種正常細胞/癌細胞中的實驗證實，采用本方法能有效的篩選人腫瘤相關自然反義轉錄子。


圖I是本發明提供的一種篩選人腫瘤相關的自然反義轉錄子的方法流程示意圖；圖2是pGEM-T載體的圖譜；圖3A-3B是總RNA經RNase I酶切前后產物電泳示意圖，其中圖3A為酶切前電泳示意圖，圖3B為酶切后電泳示意圖；其中M為IOObp DNA梯狀電泳；圖4是文庫質粒酶切圖；其中M為IOObp DNA梯狀電泳；圖5A-5B是候選NATs分子ETl-AS測序結果圖，其中圖5A為測試結果第一頁，圖5B為測試結果第二頁；圖6是ETl-AS的表達對ETl mRNA表達水平的影響圖；其中柱I為pcDNAET-AS轉染Skov3細胞24h，柱2和柱3為pcDNAET-AS轉染Skov3細胞48h，柱4為野生型Skov3細胞，柱5為pcDNA3轉染Skov3細胞24h，柱6為pcDNA3轉染Skov3細胞48h ;圖7是ETl-AS的表達對ETl蛋白表達水平的影響圖；其中泳道I為野生型Skov3細胞，泳道2為Skov3細胞轉染pcDNA 3，泳道3為Skov3細胞轉染pcDNAET_AS24h ;泳道4為 Skov3 細胞轉染 pcDNAET-AS48h。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。如圖I所示，本發明提供的篩選人腫瘤相關的自然反義轉錄子的方法包含以下步驟I.細胞培養/組織標本材料的取材按各種細胞的優化培養條件培養目的細胞；如采用組織標本材料,則組織標本材 料應在術后立即直液氣中保存。2.總RNA的提取采用總RNA抽提試劑Trizol提取總RNA，操作步驟按Trizol試劑說明書進行。(I)在所得細胞中，按照I X IO7個細胞中加入Iml的Trizol試劑，反復吹打裂解細胞。如為組織，先加入適量Trizol試劑后用勻楽機進行研磨。(2)室溫放置5分鐘，使細胞充分裂解。(3)加入O. 5ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置5分鐘。(4) 40C，12000rpm離心15分鐘，液體分為三層。(5)取無色水相移至另一干凈EP管中，加等量異丙醇顛倒混勻，室溫放置10分鐘。(6) 4°C, 12000rpm 離心 10 分鐘，棄上清。(7)加入75 %乙醇洗滌RNA沉淀。(8)4°C，7500rpm離心5分鐘，棄上清。加入無水乙醇洗滌沉淀，利于盡快去除水分。(9)加入20 μ I 二乙基焦碳酸酯(DEPC)水溶解沉淀，紫外分光光度計測其濃度。3. RNA樣品的檢測(I)在一 RNase-free離心管中加入
RNA4.5μ1
5 X中醛凝膠電泳緩沖液2.0μ1
甲酸3.5μ1
￥酰胺10μ1
共20μ1(2)混合液在65°C加熱15min后立即置冰上2min，離心收集樣品，加入2 μ I上樣緩沖液后在甲醛變性凝膠中電泳45min，在紫外燈下觀察。觀察結果如圖3A所示。4.總 RNA 的 DNaseI 處理用上述方法大量提取的總RNA中會不可避免的有微量的基因組DNA污染，必須用DNaseI徹底消化樣品中的DNA。(I)在一 RNase-free離心管中加入
總 RNA3()μg
IO X DNase I (RNase-free)2μ1
RNasin (40 /μ1)Ιμ
DNase iIOU
RNase-free 水個:50μ1(2)混勻，瞬時離心，37°C水浴30min后，80°C加熱IOmin滅活DNase I。(3)加入150 μ I的RNase-free水，再加等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 24 1),充分混勻。(4) 12000rpm 離心 IOmin,取上層轉移到另一 RNase-free 的 I. 5ml 離心管。(5)加入40μ 1，4M的LiCl及600 μ I預冷無水乙醇，混勻，_20°C放置30min。(6)離心回收沉淀，用70%乙醇清洗沉淀，干燥后用50 μ I的RNase-free水溶解。(7)用1%甲醛變性凝膠電泳確認基因組DNA被消化，確認RNA的完整性。(8)取適量樣品稀釋后測定RNA的濃度。5.總 RNA 的 RNase I 處理(I)在一 RNase-free的離心管中，加入
總 RNAIOOpg
IOxRNase Ir 緩沖液10μ1
RNase IrIOU
RNase-free Jt至 ΙΟΟμΙ(2)混勻，瞬時離心，37°C保溫lh。然后在70°C加熱20min滅活RNaseIf。(3)取5 μ I進行1%甲醛變性凝膠電泳，確認23S，16S rRNA被完全降解。結果如圖3B所示。(4)加入100 μ I的RNase-free水，再加等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 24 1),混勻。(5) 12000rpm離心IOmin,將上清轉移至另一 RNase-free的離心管。(6)加入40μ 1，4M的LiCl及600 μ I預冷無水乙醇，混勻，_20°C放置30min。(7)離心回收沉淀，用70%乙醇清洗沉淀，干燥后用50 μ I RNase-free水溶解。6. cDNA第一鏈的合成以雙鏈RNA (dsRNA)變性后的單鏈RNA為模板，以隨機六引物(Promega合成)為引物，在逆轉錄酶(M-MuLV (RNase H-))的作用下生成cDNA。
(I)在一 RNase-free的離心管中，加入
125η§/μ1隨機引物2μ1 0.2 δ/μ1 dsRNA10μ1 脫氧核糖核苷·:磷酸(dNTP)(各IOmM)Ιμ只13μ1(2)混合物80°C加熱IOmin后立即置冰上，離心收集后加入5X第一鏈緩沖液4μ1
O. IM 二硫蘇糖醇(DTT)2μ I共19 μ I (3)輕輕混勻，25°C放置 2min。(4)加 I μ I (200 單位)M-MuLV (RNase H-)，混勻后 25°C放置 IOmin0(5 ) 42 °C 水浴加熱 50min。(6) 70°C加熱 15min 終止反應。(7)加 I μ I (2 單位)RNase H，37O保溫 20min。(8) 95°C加熱 5min,滅活 RNase H。(9)加入等體積的酚/氯仿，充分混勻。(10) 13000rpm離心IOmin后，取上層于另一離心管中。(11)加入1/10體積的3M醋酸鈉(NaAC，pH5. 2)及3倍體積的無水乙醇，混勻后 _20°C放置 30min。(12)離心回收沉淀，70%乙醇清洗，干燥后用50 μ I雙蒸水(ddH20)溶解。7. cDNA第二鏈合成及末端補平(I)在一 RNase-free的離心管中，加入
2.5 X第.....:鏈緩沖液 40μ1 cDNA 片段200μδ 隨機六引物2μ1
加 H2OΦ； ΙΟΟμΙ(2) 70°C保溫lOmin，點動離心，置于冰浴。(3)在樣品管中加入T4DNA聚合酶2μ 1，37°C保溫lOmin。(4)加入 4μ l，500mM 的乙二胺四乙酸(EDTA)。(5)等體積加入酹\氯仿\異戍醇，抽上清，12000rpm離心3min。(6)上清液轉移至一干凈試管，加2體積的乙醇，1/10體積的乙酸鈉，-20°C保溫30min沉淀，12000rpm離心15min,收集沉淀,70%乙醇洗沉淀,干燥,采用Tris-EDTA復溶。8. RsaI 酶切雙鏈 cDNA
(I)檢測子(Tester)和驅動子(Driver) cDNA經37°C過夜酶切，酶切體系為雙鏈cDNA (ds cDNA)43. 5 μ IIOXRsa 限制緩沖液 5. O μ IRsa I (IOU/ μ I)I. 5μ I(2)每管用2· 5 μ I EDTA/肝糖(Glycogen)混合物終止反應。(3)加入50 μ I苯酚/氯仿/異戊醇(25 :24:1)抽提，并沉淀出酶切后的cDNA雙 鏈，溶解于5. 5μ I雙蒸水中。9.接頭連接酶切消化的Tester雙鏈cDNA分為兩份，一份與SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列連接，另一份與SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列連接，具體步驟如下(I)取 I μ I 酶切的 Tester dscDNA，用 5 μ lddH20 稀釋。(2)連接反應液(Ligation Master Mix)的制備如下無菌水(sterileH2O)3 μ I5X連接緩沖液2μ1T4DNA 連接酶(Ligase)I μ I(3)在兩個EP管中分別加入如下試劑
成分Tester 1-1Tester 1-2
diluted Tester cDNA2μ12μΙ
SEQ ID NO: 5 (IOUm)2μ1/
SEQ ID NO: 6 (IOUm)I2μ1
連接緩沖液6μ〖6μ1
設終體積10μ1ΙΟμΙ(4)在另一離心管中混合I. 5 μ I的Testerl-I和I. 5 μ I的Testerl-2,連接反應完成后即為本實驗所需要的unsubtracted tester controll-c。(5)輕微離心，16°C過夜連接。(6)加入I μ I的20XEDTA/Glycogen Mix，終止反應；72°C溫育5min使連接酶失活。(7)取 I μ I unsubtracted tester controll_c,用 Iml ddH20 稀釋，該樣品將用來進行PCR檢測。(8)所有樣品放入_20°C保存。10.第一次雜交(I)每個雜交反應的體系為
成分’Μ合1卜站Ifli合樸品2
Rsa digested Driver cDNA1.5μ11.5μ1
Testerl-I (連接 SEQ ID NO: 5 序列) 1.5 P II
Testerl-2 (連接 SEQ ID NO: 6 序列)I1,5μ1
4 X Hybridzaion BufferΙμ ipl
fi終體積4μ!4μ1(2)每個反應管中加一滴礦物油覆蓋，短暫離心。(3) 98°C變性 5min，使 DNA 充分變性。(4)68°C雜交10小時(雜交時間不少于6小時，也不能超過12小時)，完成后立即進行第二次雜交。11.第二次雜交(I)配制第二次雜交混合液Driver cDNAI μ I4XHybridzaion Buffer I μ I無菌水2μ1(2)取I μ I混合液加一滴礦物油覆蓋后于PCR儀上98°C變性I. 5min。(3)將移液器調到15 μ 1，輕輕將槍頭伸入混合樣品2中礦物油與液面交界出，小心將樣品吸出，并吸入少許空氣；用同樣的方法吸入新鮮的變性Driver，此時混合樣品2和新鮮變性Driver在槍頭內由一段氣體柱分開，將這一狀態的混合物打入裝有混合樣品I的離心管中，用槍頭混勻，短暫離心。(4)68°C保溫過夜。(5)加入 200 μ I 的 dilution buffer 后 68°C保溫 7min。12.兩次PCR擴增(I)第一次擴增反應體系為
IOxTaq poly川erase Buffer 2μ1 dNTPs (IOuM)0.4μ1SEQ ID NO; I (IOuM) Ιμ
Taq polymerase C 2υ/μΙ)0.5μ1
ddH2014.!u!
第. 次雜交產_2μ1終休枳20μ1第一次擴增程序為
步驟 I75 °CSmin
步驟 2940CSOsec
步驟 3660C30sec
步驟 472 0CLSmin
步驟5循環步驟2三十四次
步驟 672 0C5min
步驟7 4°C保溫產物10倍稀釋作為第二次PCR的模板。(2)第二次擴增反應體系為
IOxTaq polymerase Buffer2μ1
dNTPs (IOuM)0.4μ1
SEQ ID NO: 8 (IOuM)ΙμSEQIDNO: 9 (IOuM) Ιμ
Taq polymerase (2U/ P I)0.5μ1
ddH20〗3.1μ1. 10倍稀釋后的第-·次PCR產物 2μ1
終體枳20μ1第二次擴增反應程序為歩驟 I94*C 3Osec
步驟 268 °C 30sec
步驟 372 °C 1.5min
步驟4循環步驟〗十七次
歩SI 572 wC 5 mm
步驟64eC保溫13. PCR產物與T載體的連接在一 50 μ I離心管中，加入
pGEM-T vector0.5μΙ
Τ4 DNA Iigase0.5μ1
10χΤ4 DNA ligase Buffer2μ1
PCR純化產物Πμ 14.連接產物的“化及NATs文庫的構建(I)連接產物65°C加熱IOmin滅活T4DNA連接酶。(2)取新鮮制備或_70°C保存的感受態細胞100 μ 1，置于冰上，完全解凍后，將細胞均勻懸浮。(3)加入10 μ I連接液,輕輕混勻。(4)于冰上放置30min。(5) 42°C水浴熱激60s，迅速置冰上。(6)加入 900 μ I 的 LB，37°C振蕩培養 lh。(7) 8000印111離心31^11，用槍頭吸掉60(^1上清液，用剩余的LB液將細胞懸浮。(8)加入 4 μ I 的 O. 5M IPTG 和 20 μ I 的 20mg/ml Χ-gal 與菌液混勻。將菌液涂布于Amp抗性平板,過夜培養后取2塊96孔培養板，向每孔中加入LB培養液150 μ 1，用滅菌牙簽挑取轉化平板上的白色克隆接種于對應的培養孔中，將培養板蓋好，置30°C培養18 24h，加入滅菌的50%甘油50 μ 1，振蕩混勻2min。封好蓋子后，置-80 V冰箱保存。文庫質粒酶切圖如圖4所示。15.克隆測序結果的生物信息學分析(I)從測序結果中去除克隆載體序列和上、下游引物序列，將得到的NATs分子序列編號保存，用NCBI的BLAST程序進行網上在線初步比對分析(網址http://www. ncbi.nlm. nih. gov/blast),初步確定同源的核苷酸序列在基因組的位點。(2)從網上(網址http://genome, ucsc. edu/cgi-bin/hgGateway)下載相應位點的核苷酸序列、內含子序列和注釋信息。
(3)用DNAStar軟件打開人的基因組序列文件，將NATs序列與之比對，進行NATs的基因組定位分析。16.對本方法有效性的驗證為驗證本方法的有效性，發明人在所篩選到的候選分子中，隨機選取ETl-AS進行實驗驗證。(I) RNA提取如前所述。(2)鏈特異性逆轉錄用ET-AS的鏈特異引物進行逆轉錄，引物核苷酸序列如下所示，其他條件如前所述。本實驗方案中所涉及的引物核苷酸序列引物I (SEQ ID NO: I):
5’-AAAACTGCAGCCAATCAATACTTAACACCA-3’引物2 (SEQ ID N0:2):5’-GCTCTAGAGCTTCGATTTTT ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ-β'ETl-ASRT and Forward 引物(SEQ ID NO: 3):5’-TATCTAACCTTGAAATCCCCCCCTG-3’Reverse 引物(SEQ ID NO:4):5’-CTGGGTGCTCAGTTGTCTAACCTGA-3’抑制性消減雜交所用低聚核苷酸Adaptors:adaptor I (SEQ ID NO: 5):5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'adaptor 2R (SEQ ID NO:6):5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'PCR 引物(SEQ ID NO: 7):5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'巢式PCR引物巢式引物I (SEQ ID N0:8):5，-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'巢式引物2 (SEQ ID N0:9):5' -AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'控制引物GAPDH 5’ 引物(SEQ ID NO:10):5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'GAPDH 3’ 引物(SEQ ID NO: 11):5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(3)PCR擴增:PCR 引物為 SEQ ID NO:7所示序列，PCR條件為 94°C，30s ；60°C,45s ；72°C,45s ；30 個循環。(4)克隆測序將PCR擴增產物克隆至pGEM-T載體，pGEM_T載體圖譜如圖2所示，由上海生工公司進行測序，測序結果如圖5A和圖5B。(5)構建ETl-AS的表達載體用Hindlll/BamHI分別雙酶切pcDNA3. 0，分別凝膠電泳回收目的片段后進行連接轉化，再進行陽性克隆鑒定，構建ETl-AS的表達載體pcDNAET-ASο(6) ETl-AS重組表達載體轉化Skov3細胞將重組質粒pcDNAET-AS用Lipofectamine 2000試劑轉染Skov3細胞。具體操作依照試劑盒附帶操作規程進行。以質粒pcDNA 3為陰性對照。(7) ETl-AS對ET-1表達調控的檢測A. real-time PCR :用Trizol法提取轉染24、48h后細胞的總RNA，并進行質量鑒定。按照逆轉錄試劑盒說明，冰上操作將不同時間點的RNA逆轉錄成cDNA。再以逆轉錄出 的cDNA為模板建立反應體系(按Takara公司SYBRPremix Ex Taq試劑盒說明書進行)。ET-I引物序列:SEQID NO: 12 :5，-GCCTCGTAGAAGTCTGGT-3，，(上游)，SEQID N0:13 :5，-AAATCAAGGACAGGGAAT-3，(下游)，SEQID NO: 14 (內參 GAPDH):5，-CCACATCGCTCAGACACCAT-3，(上游)，SEQID NO: 15:5，-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3，(下游)，反應條件為95°C，10s預變性；95°C，5s ；68°C,30s ;共25個循環進行。實驗采用3個復孔，結果見圖6。B. Western Blot分析細胞轉染24、48h后，裂解細胞，用Lowry法蛋白定量，高溫變性后進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉印至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST對PVDF膜進行封閉。第一抗體為兔單克隆抗體(I :1000稀釋)，第二抗體是辣根酶標記山羊抗兔IgG(l :10000稀釋)。內參beta actin的一抗及二抗同上述方法稀釋使用。Western發光檢測試劑孵育PVDF膜，暗室顯影，結果見圖7。(8)結果分析通過上述real-time PCR和Western Blot分析，證實了 ET1-AS的的表達能顯著的降低ET-I mRNA及蛋白的表達，證實ETl-AS可特異的作用于ET-I mRNA靶點，并抑制ET-I的表達，進而進一步證實了采用我們的篩選體系所得到的NATs分子是真實存在且具有相應生理功能的表I采用該方法從HepG2和L02細胞中篩選出的差異表達的候選NATs分子
權利要求
1.一種篩選人腫瘤相關的自然反義轉錄子的方法，其特征在于，包含以下步驟 1)提取人正常細胞和對應的腫瘤細胞總RNA； 2)分別加入過量的DNaseI和RNase I，酶切步驟I)獲得的人正常細胞及對應的腫瘤細胞總RNA，然后通過酚/氯仿抽提回收； 3)以步驟2)中的雙鏈RNA為模板，以隨機六引物及逆轉錄酶將其反轉錄為cDNA； 4)以隨機六引物為引物，用T4DNA聚合酶催化合成cDNA第二鏈并補平末端； 5)以RsaI酶切雙鏈cDNA，得到帶有平末端的酶切產物，回收純化后加雙蒸水； 6)將步驟5)的檢測子cDNA分為兩份，一份連接SEQID NO: 5所示的核苷酸序列，一份連接SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；驅動子(Driver) cDNA不連接頭； 7)用T4DNA聚合酶補平粘末端，采用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀純化后，加適量雙蒸水溶解； 8)以正常細胞和癌細胞互為檢測子和驅動子進行雙向抑制性消減雜交；其中在正向消減中，以癌細胞為檢測子，以正常細胞為驅動子；在反向消減中，以正常細胞為檢測子，以癌細胞為驅動子； 9)將步驟8)的雜交產物用緩沖液稀釋后作為模板進行兩輪PCR擴增；PCR的引物核苷酸序列對應于SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列； IO )將步驟9 )PCR擴增后的正向和反向消減雜交產物純化，后與pGEM-T載體連接克隆，并分別構建正向和反向cDNA消減雜交文庫，鑒定出陽性克隆后進行測序； 11)根據步驟10)所獲得的測序結果進行分析，確定候選的靶分子。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)之后還包括檢測所提取的總RNA的步驟。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟3)中酶切條件為37°C水浴中酶切30mino
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟5)中酶切雙鏈cDNA時間為2h。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟5)中加雙蒸水調整濃度至300ng/μ I。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟9)中兩輪PCR擴增循環次數分別為28 和 12。
7.根據權利要求I所述的方法篩選的人腫瘤相關的自然反義轉錄子在制備檢測腫瘤試劑盒中的應用。
8.根據權利要求I所述的方法篩選的人腫瘤相關的自然反義轉錄子在制備檢測腫瘤制劑中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種篩選人腫瘤相關的自然反義轉錄子的方法，該方法包括提取癌細胞/正常細胞總RNA；DNase I及RNase I酶切；逆轉錄成cDNA及雙鏈合成，加接頭；抑制性消減雜交，PCR產物克隆建庫，測序分析；對候選分子進行進一步實驗驗證等步驟。經在正常細胞和腫瘤細胞中應用驗證，證實該方法可系統、快速的篩選人腫瘤相關的自然反義轉錄子。
文檔編號C12N15/113GK102827844SQ20121036143
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月25日 優先權日2012年9月25日
發明者楊朝輝, 何鳳田, 張立 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學