專利名稱：棉花黃萎病抗病相關基因GbVdr3及其應用的制作方法
技術領域：
本發明提供了一個棉花黃萎病抗性相關基因必KoW及其應用，涉及植物基因克隆以及功能分析，屬于植物基因工程領域。用于通過植物基因工程技術改善植物抗病性和其他有益生產性狀。背景技術：
棉花是重要的經濟作物，在我國國民經濟中占有重要的地位。棉花黃萎病是嚴重危害棉花生產的病害之一，在世界范圍內傳播危害，嚴重阻礙著棉花產業的穩步發展。由于棉花黃萎病是一種土傳維管束病害，所以防治難度很大，到目前為止，尚未有特效的防治藥劑，而種植抗病品種成為解決棉花黃萎病的經濟有效的途徑(崔淑芳，李俊蘭，金衛平等.棉花抗黃萎病種質資源的選育與鑒定.華北農學報，2006，21 (增刊)180-182)。但目前我國棉花品種的抗病性只能達到耐病水平，致使該病在環境條件合適的情況下連續流 行危害(張志剛，曾昭云，賀云新等.長江流域棉區黃萎病育種的對策與建議.江西棉花，2008，3(2):8-10)。據統計，近年來，棉花黃萎病的發生面積呈加重的趨勢，發病面積占棉花總面積的50%，每年損失皮棉7. 5 X 10 4 IOXlO4 t，直接經濟損失16 20億元(李鳳瑞，史加亮，楊秀鳳.棉花抗黃萎病研究進展及前景展望.山東農業科學，2009，
(9):57-59)。棉花黃萎病抗病種質資源的缺乏，是限制棉花抗病育種的主要因素。雖然我國擁有大量的棉花種質資源，但高抗黃萎病的資源均為不能直接利用的海島棉和野生棉(馬存，簡桂良，孫文姬.我國棉花黃萎病育種現狀、問題及對策.中國農業科學，1997，(302) :58-64)。并且，棉花黃萎病的發病機理比較復雜導致抗性品種的選育進展緩慢，遠遠達不到生產上對棉花抗病的需要。常規育種雖然取得了不少成果，但是抗病品種的選育需要的時間長、投入的資金多，而且培育出的新品種抗性也不是十分明顯，有些農藝性狀還不如感病品種。隨著植物轉基因技術的發展，應用遺傳轉化的方法不但可以獲得生物的定向變異，而且能夠打破物種之間的生殖隔離障礙，提高育種的可操作性和目的性，為創造新的種質資源開拓了無限廣闊的前景。利用轉基因生物技術將抗黃萎病基因性狀轉移到農藝性狀較好的陸地棉中，創造抗性強、產量和品質較高的新品種是現今棉花抗病育種的新熱點。目前，應用外源基因轉化來提高棉花黃萎病抗性的多為從其他植物中克隆得到的抗病相關基因。主要有幾丁質酶、β-1，3-葡聚糖酶、植物防衛素、硫素及葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GO)等外源抗病基因。幾丁質酶和β _1，3_葡聚糖酶可以阻礙病原菌的侵入，抑制其生長，是植物的主要防衛反應之一。真菌細胞壁的主要組成成分是幾丁質和β- 1，3-葡聚糖，幾丁質酶、β-1，3-葡聚糖酶可降解真菌的細胞壁。所以，轉基因植株受到病原菌侵染后會在短時間內大量的產生幾丁質酶和β- 1，3-葡聚糖酶來降解病原菌的細胞壁，從而使植株具有抗黃萎病的特性。蔡應繁等(2000)利用遺傳轉化法將幾丁質酶基因和β_1，3-葡聚糖酶基因導入棉花(蔡應繁，葉鵬盛，江懷忠等.抗真菌基因導入棉花創造高抗黃萎病材料研究.西南農業學報，2000，13 (4) : 45-49)。吳家和等(2004)獲得了遺傳性穩定且抗病性良好的轉β-1，3-葡聚糖酶基因和幾丁質酶基因的棉花植株(吳家和，張獻龍，羅曉麗等.轉幾丁質酶和葡聚糖酶基因棉花的獲得及其對黃萎病的抗性.遺傳學報，2004，31( 2) : 183- 188)。基因能夠編碼葡萄糖氧化酶，該酶能催化β -D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H2O2,而H2O2可以作為信號轉導物質誘導棉株系統抗性的獲得，也可直接抑制病原菌的生長。張寶紅等2001)、劉慧君等(2003)、王志興等(200)分別將Ο 基因導入棉花，轉基因植株對黃萎病的抗性明顯提高(張寶紅，姚長兵，鞏萬奎等.棉花葡萄糖氧化酶基因轉化棉花和抗性愈傷組織的獲得.棉花學報，2001，13( 2 ) : 78- 81;劉慧君，簡桂良，鄒亞飛.基因導入對棉花農藝性狀及抗病性的影響.分子植物育種，2003，1(5) : 669- 672 ;王志興，轉基因抗病棉花和抗蟲馬鈴薯株系的培育.中國科學院植物研究所博士后研究工作報告，2000)。另外，肖月華等(2000)從棉花中分離克隆了多個具有抗病功能的基因并篩選出了抗性優良的棉花種質材料(肖月華，羅明，裴炎等.棉花類LRR抗病蛋白(GhLRR-RL)基因的克隆及表達分析.遺傳學報，2000，29(7) :565-570)。竇道龍(2002)利用35S啟動子驅動從擬南芥中克隆得到飽NDRl和#/況7基因在陸地棉中表達，鑒定結果顯示轉基因植株的抗病性明顯增強(竇道龍.棉花抗黃萎病基因工程研究和防衛反應相關基因的克隆，中國農業科學院博士研究論文，2002)。多聚半乳糖醛酸酶是一種細胞壁降解酶，它在病原物致病過程中十分重要。James 等(2001)研究發現 PGIPs ( polygalacturonase inhibitor proteins,多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白)能夠有效的抑制大麗輪枝菌多聚半乳糖醛酸酶的活性，轉/ 基因植物能夠增強植物的抗病能力(James JT, Dubery IA. Inhibition of polygalacturonasefrom Verticillium dahliae by a poly-galacturonase inhibiting protein fromcotton. Phytochemistry, 2001, 57 ( 2) : 149-156)。Zhou 等(2001)克隆得到了蘿卜Rs-AFl基因并進行大麗輪枝菌的體外抑菌實驗，結果顯示對大麗輪枝菌的生長有明顯的抑制作用(Zhou XJ, Lu S，Xu YH, et al. A cotton cDNA (GaPR-10) encoding apathogenesis-related 10 protein with in vitro ribonuclease activity. Science,2002，162( 4) : 629-637)。在許多細胞生理生化過程中植物非共生血色素具有很重要的作用。QU ZL等(2005)從棉花中克隆得到了一個非共生血色素基因必描1，研究發現該基因在抗病反應中具有重要的作用(Qu ZL, Wang HY, Xia GX. GhH bl: a nonsymbiotichemoglobin gene of cotton responsive to infection by VerticiIliumdahliae.Biochim Biophys Acta, 2005, 1730( 2) : 103-113)。Kawchuk等(2001)從番茄抗黃萎病材料中克隆得到了抗黃萎病基因家族的2個成員基因 Ke7 和 KeJ (Kawchuk L, Hachey J, Lynch D, et al. Tomato Ve diseaseresistance genes encode cell surface-like receptors. Proc Natl Acad Sci USA,2001，98 (11) : 6511-6515)。&基因是第一個克隆得到的黃萎病抗性基因，將之轉化馬鈴薯后，轉基因馬鈴薯表現為抗黃萎病，但該基因還沒有應用于轉基因棉花抗病育種中。Ke基因屬于LRR-TM類抗病基因。該類基因編碼一種表面受體蛋白(Receptorlike proteins, RLPs),編碼蛋白由6個保守的結構域組成。結構域A是N端信號肽,結構域B由N端成熟蛋白和一個亮氨酸拉鏈LZ基序組成。結構域C由數量不等的LRR重 復單元組成，具有LxxLxxLxxLxLxx(N/C/T)x(x)LxGxIPxx保守序列，該結構域參與蛋白質的相互作用和配體識別。跨膜結構域E是由疏水性氨基酸構成的α螺旋，兩側的結構域則是由帶負電的胞外結構域D和帶正電的胞內結構域F組成,這兩個結構域對蛋白質在細胞膜上的定位和錨定起著重要的作用。LRR-TM類抗病基因還包括番茄抗葉霉菌C類基因(Dixon, M. S. , Hatzixanthis, Κ. , Jones , D. A. , Harrison, K. , &Jones,J. D. The tomato Cf-5 disease resistance gene and six homologs show pronouncedallelic variation in leucine-rich repeat copy number. Plant Cell, 1998, 10,1915-1925.),蘋果抗黑星病菌 ijenturia inaequalis)基因 ZfcrK/J (Vinatzer, B. A.,Patocchi, A. , Gianfranceschi,L. , et al. Apple contains receptor-like geneshomologous to the Cladosporium fulvum resistance gene family of tomato witha cluster of genes cosegregating with Vf apple scab resistance. MolecularPlant-Microbe Interactions, 2001, 14, 508-515.),擬南芥抗霜霉菌 iPeronosporapanasiiica)基因Tor, D Brown, A Cooper, et al. Arabidopsis downy mildewresistance gene RPP27 encodes a receptor-like protein similar to CLAVATA2 andtomato Cf-9. Plant Physiol, 2004, 135，1100-1112)以及番茄應答非致病綠色木霉菌{Trichoderma viride)激發子的抗病基因(Ron M, Avni A. The receptor for the fungal elicitor ethylene-inducing xylanase is a member of a resistance-likegene family in tomato. Plant Cell, 2004, 16: 1604-1615)。大量的研究已經證明，該類蛋白在植物抗病過程中起著重要的作用。棉花黃萎病抗性遺傳的研究涉及實驗材料、遺傳分析模式、病情分級標準、病原菌菌系和抗性鑒定方法等諸多方面，比較復雜。不同學者的研究成果是不同的。分析前人的結果，海島棉的抗病性對陸地棉的感病性為顯性，表現為單基因顯性或部分顯性控制的質量性狀遺傳。從陸地棉種內雜交來看，遺傳規律比較復雜在溫室或生長室單一菌系接種鑒定的情況下，抗性多為單基因遺傳；在田間病圃條件下鑒定，抗性多為微效多基因遺傳(房衛平，祝水金，季道藩.棉花黃萎病菌與抗黃萎病遺傳育種研究進展.棉花學報，2001，13 (2) : 116-120)。這就說明棉花基因組中可能存在多個抗病基因，這些抗病基因對不同的病原菌小種具有專一抗性。RLPs基因多以基因簇形式存在，這種結構特征為專一性識別病原菌小種成為可能。棉花黃萎病抗性基因GbVdr3的分離與功能研究為該類基因的深入研究以及進一步利用奠定基礎。

發明內容
技術問題
本發明的目的提供了一個能提高棉花黃萎病抗性的新基因GbVdr3，該基因編碼一個表面受體蛋白基因。該基因過量表達可以顯著提高受體植物對落葉型黃萎病的抗性，對非落葉型黃萎病抗性也略有提高。可以利用本發明基因構建成各種植物表達載體，應用于農業生物技術育種以提高作物抗病性狀。技術方案
本發明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一個棉花抗病相關基因必KoW，屬于植物基因工程領域，該基因來源于海島棉品種H7124，該品種對黃萎病具有較高的抗性。必K0W是下述核苷酸序列之一
I)序列表中SEQ ID NO. I所示的DNA序列或部份DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID NO. I限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件為在O. IXSSPE (15mM NaCl, ImM NaH2PO4, O. ImM EDTA)、O. IXSSC (15mM NaCl, I. 5mM檸檬酸鈉)、0· 1% SDS (十二烷基磺酸鈉)的溶液中，65°C條件下洗膜。序列表中的SEQ ID NO. I由3411個堿基組成，自5’端第81位堿基為轉錄起始位點，記為+1 ;第3207位堿基為轉錄終止位點。完整編碼框長度為3207個堿基，編碼蛋白為1068個氨基酸，分子量為119.85053KD，等電點為8. 53。結構域預測發現該基因編碼蛋白含有10個LRR保守結構域和2個LRRl 結構域，C端有I個跨膜結構域，N端有I個信號肽和I個LRRNT2結構域(圖I)。該基因編碼蛋白與番茄Vel和Vd的相似性為49% (圖
2)，將該基因命名為GbVdr3。本發明棉花黃萎病抗病相關基因GbVdr3的應用，該基因編碼一個表面受體蛋白，該蛋白具有含有10個LRR保守結構域和2個LRRl結構域，C端有I個跨膜結構域，N端有I個信號肽和I個LRRNT2結構域。該基因過量表達明顯提高受體植物對棉花黃萎病強致病力落葉型菌株V991的抗性，對棉花黃萎病強致病力非落葉型菌株Bp2的抗性也有一定的提聞。將必KoW與CaMV35S啟動子構建植物表達載體轉化擬南芥植株，轉基因植株抗病性鑒定結果表明該基因過量表達可以顯著提高植物對落葉型黃萎病菌的抗性，對非落葉型黃萎病菌的抗病性也有一定的提高。因此，可以利用本發明基因構建成各種植物表達載體，應用于農業生物技術育種以改良包括單子葉植物和雙子葉植物的抗病性狀。GbVdr3的功能研究可為揭示其表達調控機理以及具體功能打下基礎，還可應用于植物抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。有益效果
I.本發明獲得了一個全新的棉花黃萎病抗性相關基因必KoW。本發明獲得的必KoW基因是一個全新的受體蛋白類基因，BLAST搜索沒有與其高度同源的相似基因。通過轉基因分析發現此基因的過量表達可以顯著提高植物對落葉黃萎病菌的抗性，對非落葉型黃萎病菌的抗性也略有提高。對轉基因植物的抗病性鑒定結果顯示，在病原菌接種后15天，抗性作用十分明顯，對于落葉型黃萎病5個轉基因株系的平均病指僅為18. 4%，而對照達到51. 3% ;對于非落葉型黃萎病菌5個轉基因株系的平均病指為28. 1%，而對照達到33. 8%。黃萎病接種20天后，對于落葉型黃萎病菌5個轉基因株系的平均病指僅為35. 6%，而對照達到91. 3% ;對于非落葉型黃萎病菌5個轉基因株系的平均病指為69. 5%，而對照達到88. 8%。由抗病性鑒定結果可以得出，轉基因植株早期抗性效果明顯，但是隨著病原菌在植株體內的不斷繁殖與積累，轉基因植株也會表現一定的病癥，但是與對照相比，轉基因植株的抗性還是較為顯著。說明該基因是一個全新的黃萎病抗病相關基因。2.本發明有助于更好地了解抗病基因的作用機制。GbVdr3的克隆為進一步了解病原菌與抗病基因互作、抗病信號傳導通路奠定基礎。例如可以利用必VdrJ分離與之互作的黃萎病病原菌的致病因子，了解植物與病原菌的互作機理，從而明確植物的抗性信號傳導通路，所以必KoW的分離以及功能鑒定為研究抗病基因的作用機制奠定了基礎。3.本發明應用于抗病育種。必KoW抗性效果顯著，特別是對落葉型黃萎病菌表現為顯著抗病，在抗病育種中有較大的應用價值。
四

圖I必KoW的結構域預測。LRR、LRRl、LRRNT2均為富含亮氨酸重復序列。圖2必KoW、番茄VeJ和番茄VeZ的氨基酸序列相似性比較。VeJ (索取號AF272367_1), Ve2 (索取號AF365929_1 )。圖3必ri/rJ基因在棉花不同器官中的表達量分析 圖4必KoW過量表達載體的構建。圖5接種15天后GbVdr3轉基因株系的病指調查。WT為野生型植株；D4_1—D4_5為GbVdr3的轉基因株系。圖6接種20天后GbVdr3轉基因株系病指調查。WT為野生型植株；D4_1—D4-5為GbVdr3的轉基因株系。 五具體實施例方式 下述實施方式中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用引物序列均由上海英駿生物技術有限公司合成，所述百分含量均為質量百分含量。本實驗中基因來源于海島棉AarAaofefl1Si )品種H7124 (馬存，簡桂良，孫文姬.我國棉花抗黃萎病育種現狀、問題及對策.中國農業科學，1997，30(2) : 58-64)，該品種高抗黃萎病。擬南芥品種為哥倫比亞型(Lin X, Kaul S，Rounsley S，Shea TP, Benito MI, Town CD, FujiiCY, Mason T, Bowman CL, Barnstead M, Feldblyum TV, Buell CR, Ketchum KA, LeeJ, Ronning CM, Koo HL, Moffat KS, Cronin LA, Shen M, Pai G, Van Aken S, UmayamL, Tallon LJ, Gill JE, Adams MD, Carrera AJ, Creasy TH, Goodman HM, SomervilleCR, Copenhaver GP, Preuss D, Nierman WC, White 0, Eisen JA, Salzberg SL, FraserCM, Venter JC. Sequence and analysis of chromosome 2 of the plant Arabidopsisthaliana. Nature, 1999, 16, 402 (6763):761-768)。(一)棉花GbVdr3基因克隆以及序列分析
根據Gene Index中一段棉花EST序列(登錄號TC121084)設計引物5’ -TTCTGGTCCAATACCATCATTCT-3’，5’ -CTTAGATTCAGTACTCCAAGAGA-3，擴增陸地棉 DNA 模板，得到約IKb左右條帶，將該片段測序，發現其與原來的EST片段只有76%的相似度，該片段編碼I個全新的棉花表面受體蛋白基因，根據該片段設計引物通過染色體步移進一步得到了該基因的全長序列，將該基因命名為(專利棉花黃萎病抗病相關基因及其應用，申請號201110066390. 9)。由于這類表面受體蛋白基因在基因組中有很多相似序列，為了得到更多的這類基因，根據設計引物GhVdr2-F595 :5’ -CTTGATGGGGTGAATATTAGAGCA-3’，GhVdr2-R1021 :5’ -ATTGCCCAAGGTTACCGATAGAAT-3’ 擴增陸地棉DNA模板。用得到的約400bp片段作為探針篩選棉花BAC (細菌人工染色體組)文庫(構建文庫所用棉花品種為maxxa,文庫來源于Clemson University),共得到40個BAC陽性克隆。對陽性克隆D4進行序列分析發現，它含有I個具有完整閱讀框的表面受體蛋白基因，該基因編碼的氨基酸序列與具有82%的相似性。為了進一步得到H7124中該基因的序列，設計擴增基因全長的引物F389- BamHl: 5’- cttggatcccctcaacctagtgccattgttat-3，， R378I-Kpnl: 5，_ctaaggtaccagggtaatacaaggtggaaacag-3，。引物末端
分別帶有限制性內切酶ifeM I和辦7/7 I的識別位點，為構建植物表達載體做準備。用這對引物擴增H7124的DNA模板，在25 Li I,反應體系中加入DNA模板I U I，引物各5 nmo I，5 LI I 5XprimeSTAR buffer (Mg2+ plus)PCR 緩沖液，0· 2 mM dNTP, I U primeSTAR HS
DNA Polymerase (TaKaRa 公司)進行 PCR 擴增。PCR 擴增條件為94°C 3’ 后 94°C 45’’，56°C 45’ ’，72°C 3’，循環36次，再72°C延伸10’。PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠上檢測。得到約3. 5Kb片段，將該片段進行末端加A處理(北京天恩澤基因科技有限公司)并與pGEM-Teasy載體(Promega公司)連接。連接產物用DH5a (北京全式金生物技術有限公司)感受態細胞進行熱激轉化。測序由上海英駿生物工程公司進行。用DNA club進行基因開放閱讀框的確定，用DNAMAN進行序列比較分析，同時利用網上數據庫(http://www. ncbi. nlm.nih. gov/)進行BLAST分析。數據庫ExPASy(http://cn. expasy. org/)進行蛋白等電點以及分子量的相關分析。分析結果表明擴增得到的片段長度為由3411個堿基組成，自5’端第81位堿基為轉錄起始位點，記為+1 ;第3207位堿基為轉錄終止位點。完整編碼框長度為3207個堿基，編碼蛋白為1068個氨基酸，分子量為119.85053KD，等電點為8. 53。利用SMART (http://smart. embl~heidelberg. de/)進行蛋白結構預測和功能分析,發現該基因編碼蛋白含有10個LRR保守結構域和2個LRRl結構域，C端有I個跨膜結構域，N端有I個信號肽和I個LRRNT2結構域(圖I)。該基因編碼蛋白與番茄Vel和Vd的相似性為49%(圖2)，將該基因命名為必KoW。 (二)棉花GbVdr3在不同器官中的表達量分析
幼苗期，在海島棉品種H7124材料同一棉花植株上，采集植株的根、莖及葉片；成熟苗，在海島棉品種H7124材料同一棉花植株上，采集植株的莖、花及蕾，用CTAB法提取總RNA(駱萍，王國棟，陳曉亞.亞洲棉C4H同源cDNA的分離和表達特征分析.植物學報，2001，43(1) : 77-81)。用 RQl DNnase (Promega 公司)處理棉花各器官的總 RNA，參照 CL0NTECH公司的“SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit”的說明書中3’ RACE模板制備方法來制備 RT-PCR 模板。反轉錄引物為(5，-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTAC(T)30N-1N 3’)。用于熒光定量定量PCR的基因特異引物為GbVdr3F:5’ - TCAGGATTAAGTAGGGAAGGAGTT -3’，GbVdr3R:5’ - GTAATACAAGGTGGAAACAGAAGC-3’。根據棉花持家基因組蛋白設計的引物HF :5’- CAACGCTCCATCTTGTCCTT- 3’和 HR :5’- TGATCGTCTTTCCCGTAAGC-3’ 作為內參。采用SYBR Green I熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)進行熒光定量PCR分析必KoW的表達量。重復3次。PCR反應在定量PCR儀器(Crobett Rotor-Gene 6000)上進行，用2—ΔΔα方法計算基因在不同器官的的表達量。對必KoW在幼苗期葉、根和莖表達分析發現，在該時期葉片中的表達量最高，其次為根和莖；在成熟期莖、花及蕾中的表達分析發現，GbVdr3在花的表達量最高，莖次之，蕾的表達量最低(圖3)。(四)GbVdr3基因過量表達載體的構建以及植物轉化
通過測序證明了基因插入pGEM-T easy克隆載體(Promega公司)，并且有3207
個堿基的完整編碼框。用和治μ I雙酶切含有必KoW基因的陽性克隆質粒，回收3. 2Kb左右的目的片段。同時用BamH I和命I雙酶切植物雙元表達載體PCAMBIA2301(中國質粒載體菌株基因庫對外提供，http://biovector, blog. 163. com/),回收13Kb的目的片段，將兩個片段用T4 DNA ligase (Promega公司)于16°C過夜連接,并轉化大腸桿菌DH5a，獲得的陽性克隆即為含有CaMV 35S啟動子驅動必KoW基因片段的重組載體，命名為PCAMBIA2301-35S-(圖4)，用凍融法將重組載體轉化農桿菌菌株LBA4404(中國質粒
載體菌株基因庫，http://biovector. blog. 163. com/)。用花浸染方法(Clough S J, BentA F. Floral dip: A Simplified Method for Agrobacteria -Mediated Transformationof Arabidopsis thaliana. Plant J, 1998, 16:735-743)轉化擬南芥,分單株收獲擬南芥種子。將所有種子在含有25 mg/L卡那霉素的1/2 MS培養基上進行篩選，挑選綠色植株移栽至營養土中生長。用PCR方法分別在DNA和RNA水平上檢測目的基因是否轉入植物基因組以及是否正常轉錄。通過PCR鑒定，共獲得6株含有必KoW基因的轉化株，其中5株目的基因可以表達。收獲轉基因工程植株種子。將轉基因工程植株種子播種于含有25 mg/L卡那霉素的1/2 MS培養基。挑選綠色植株移栽至營養土中，用于抗病性鑒定。(五)Tl代轉化株的抗病性鑒定
對獲得的5個轉必KoW基因株系進行抗病性鑒定。將經含有25 mg/L卡那霉素的1/2MS培養基篩選獲得的生長正常的苗轉入營養土中，每盆移栽3-4株幼苗。待擬南芥生長I個月后進行抗病性鑒定。所用菌株分別為落葉型強致病力黃萎病菌V991和非落葉型強致病力黃萎病菌Bp2。病原菌經PDA平板活化后，從菌落邊緣挑取菌塊放入查氏培養液，25°C,180 r min培養5_6 d，用紗布過濾培養液，鏡檢并用血球計數板計數。接種方法為苗 期孢子懸浮液灌根法，每盆接種孢子數為I X107。每個轉基因株系每種病原菌的鑒定株數需大于24株，接種后每天觀察病害的發生情況，在14天后就可以明顯看見發病癥狀，主要表現為葉片黃化，萎蔫，生長延緩。病指按照以下標準進行鑒定，O級無病植株；I級0.
I % 25 %葉片發病的植株；2級25 % 50 %葉片發病的植株；3級50 % 75 %葉片發病的植株；4級75 %以上葉片發病的植株。病情指數=(各病級病株數X相應病級)/ (調查總棉株數X4) X 100%。對轉基因植物的抗病性鑒定結果顯示，病原菌接種15天后，對于落葉型黃萎病菌，5個轉基因株系的平均病指僅為18. 4%，而對照達到51. 3% ;對于非落葉型黃萎病菌，5個轉基因株系的平均病指僅為28. 1%，而對照達到33. 8% (圖5)。接種黃萎病20天后，對于落葉型黃萎病菌，5個轉基因株系的平均病指僅為35. 6%，而對照達到91. 3% ;對于非落葉型黃萎病菌，5個轉基因株系的平均病指為69. 5%，而對照達到88. 8%(圖6)。從植株的整個生長期來看，基因對落葉型黃萎病菌V991的抗性較好，對非落葉型黃萎病菌BP2的抗性不明顯。
基因 GbVdr3 序列ATGAGGATGTCACTCTTTTCATTGCTTTTCTTGAATTCTTTTGTATCGGTTATGCTTATTGTCAATGTGGTCTTCGTTTCGGCTCAATGTCAAAGTGATCAGAGACAGTTGTTGCTTCAGCTTGAAAGCAGCTTCAGCTACAATCAAACTTCATCAGGAAAGCTGGTGCCAGTGAAATGGAATCAAAGCACAGATTGTTGTTCCTGGGATGGTGTAAGTTGCGATGGAGGTGGTCATGTTATCGGTCTTGACTTGAACAGCAGATCAATTTCAAGTTCAATTGACGATTCAAGTAGTCTTTTCCTTCTTCAACGTCTTCAGTGGCTCAATTTGGCTTATAACGAATTCAAGCTAGCTTTTCCTACTGCGTTTGATAAGCTGGAGAATTTGAGTTATCTTAACTTGTCCTATGCTGGCTTTGAAGGACAAATTCCAATAGAGATATCACGCTTGACAAGGTTGGTCACTCTTGATTTATCTGTATCTTCACTTCTTGGAAGATCATTGAAACTTGAGAAGCCAAACCTAGAGATGCTTGTTCAAAATCTCACGAGGCTGAGATTTCTCTATCTTGATGGAGTAAATATATCAGCTACGGTGAACGAGTGGTGCAAGGCTTTATTGCCGCTGACTGAGTTGCAAGAATTGAGCATGTCCCGTTGTTATCTATCGGGACCTATACATTCTTCACTTTCCAATCTCCGATCTCTCTCGGTAATTCGCTTGGACAATAACAATTTGTCAGCTTCAGTTCCACAATTCTTTACAGAATTTGAAAATTTGACTTCCCTTCGTCTTAGTGCCACTGGGTTGCGTGGAAGACTCCCAGAAGAAATTTTCCAGATACCTACATTGCAAATTCTTGATTTGTCAACCAACAAATTACTCGAAGGTTCATTTCCAAATTTTCCTCTCAATGCTTCTCTTCGAACTCTCGCACTTAGTGGCACAAATTATGGGGGGCAAGTACCAGAATCTATTC V rrcrrc Cc^ Cc^ Cc^ V V Ce < < C Ccc V V rrc C < C < <c<cccrr<cc< < < < < < C < < < Crrccrrc < rrrrcrrc < recce^^^^^00<00^0^0^00^00^<0<^<^000§^^^<^00^0^<00<00^<0<0<<00^^<^0^<^^0^00<^0^^<0^<^^<<000^^000^^^0^<0^^000<^<0<00^0^0 ^^^^0^ 00^0<0<^<^^<^0<000<0<0<0^0^^<0<0^^0000<^<0^ 00§^0^<00^< ^0^0^0 <^0^0 ^0^00^000000<^0^^<00^000<<0<<0<0^^^<0^^00 0^^^^00^ 0^^00<000<000^0 000^<0<0<00^^0<^00 ^ 0 00^0^0
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權利要求
1.棉花黃萎病抗病相關基因必KoW及其應用，是下述核苷酸序列之一 1)序列表中SEQID NO. I所示的DNA序列； 2)可與序列表中SEQID NO. I限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據權利要求I所述的基因，其特征在于，與序列表中SEQID NO. I限定的DNA序列雜交的條件為O. IXSSPE或O. 1XSSC、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下洗膜。
3.根據權利要求I或2所述的基因，其特征在于，該基因編碼一個表面受體蛋白，該蛋白 > 含有10個LRR保守結構域和2個LRRl結構域，C端有I個跨膜結構域，N端有I個信號肽和I個LRRNT2結構域。
4.根據權利要求I或2所述的基因，其特征在于，該基因過量表達明顯提高受體植物對棉花黃萎病強致病力菌株V991的抗性。
5.含有權利要求I 4之一所述基因的表達載體。
6.含有權利要求I 4之一所述基因的宿主菌。
7.權利要求I 4之一所述基因在植物抗性改良中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
全文摘要
本發明涉及棉花黃萎病抗病相關基因GbVdr3的克隆及其應用，屬于生物技術領域。GbVdr3基因是從抗高抗黃萎病材料海島棉7124中獲得的一個表面受體蛋白基因，該基因編碼蛋白含有10個LRR保守結構域和2個LRR1結構域，C端有1個跨膜結構域，N端有1個信號肽和1個LRRNT2結構域。幼苗期GbVdr3基因在葉片中的表達量最高，其次為根和莖；成熟期GbVdr3在花的表達量最高，莖次之，蕾的表達量最低。GbVdr3基因過量表達株的黃萎病抗病性明顯增強，在病原菌接種20天后，對于V991平均病指僅為35.6%，而對照達到91.3%，對于Bp2的平均病指為69.5%，而對照達到88.8%。
文檔編號C12N1/15GK102851300SQ201210371258
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者張保龍, 楊郁文, 范曉慧, 任永哲 申請人:江蘇省農業科學院