專利名稱：青霉屬真菌m1及其在提高人參或西洋參發酵過程中皂苷類化合物產量中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種青霉屬真菌及其在發酵領域的新用途，特別涉及其在提高人參或西洋參發酵過程中皂苷類化合物產量中的新用途。屬于生物技術領域。
背景技術：
人參系五加科(Araliaceae)人參屬植物人參(Panax ginseng C. A. Mey)的干燥根及根莖，具有抗疲勞、延緩衰老、調節中樞神經系統、提高機體免疫力、改善心腦血管供血不足、抑制腫瘤細胞生長等多種作用。作為傳統的名貴中藥，人參中含有的人參皂苷類成分具有多方面顯著的藥理活性。西洋參為五加科人參屬植物西洋參(Panax quinquefoliumL.)的干燥根，原產于北美州的加拿大和美國，后經引種進入我國，具有補氣養陰，清熱生津·的功效，用于氣虛陰虧，內熱，咳喘痰血，虛熱煩倦，消渴，口燥咽干等癥，能夠降血糖、降血月旨、強心、健胃及抗衰老等，在保健和治療上應用廣泛，其主要有效成分亦為人參皂苷類成分。目前，人參皂苷主要從人參和西洋參等植物中分離獲取，由于人參和西洋參二者自身的生理特性，無論野生還是栽培通常需要四到六年才能收獲藥用，并且容易受到氣候、栽培條件及病蟲害的影響，逐漸呈現栽培土地短缺、價格日趨昂貴的態勢。應用微生物發酵法提高人參皂苷的產量，與化學法和酶法等相比，反應周期短，成本低，條件容易控制。本研究利用功能真菌對人參與西洋參藥材進行發酵培養，并對發酵前后的皂苷含量進行分析比較，能夠顯著提高兩種藥材發酵產物中皂苷類成分的含量，可為人參和西洋參藥材資源的充分開發和綜合利用提供新方法、新途徑。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠提高人參或西洋參發酵過程中皂苷類化合物產量的方法，以及一株能夠提高人參或西洋參發酵過程中皂苷類化合物產量的菌株，為此，本發明采用了以下技術手段本發明利用功能真菌對人參或西洋參藥材進行發酵培養，并對發酵前后的皂苷類化合物的含量進行分析比較，最終得到了一株能夠顯著提高兩種藥材發酵過程中皂苷類化合物的產量的菌株，經鑒定該菌株為青霉屬真菌(Penicillium sp.),命名為青霉屬真菌Ml,分類命名為青霉(Penicillium sp.),該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCC NO. 6359，保藏日期為2012年7月13日。將該菌株用于人參或西洋參的發酵生產，結果發現接種了該菌株的發酵產物中皂苷類化合物的產量相較于沒有接種菌種之前藥材中皂苷類化合物的含量得到了很大提高，因此，本發明提出了青霉屬真菌(Penicillium sp.)在提高人參或西洋參發酵過程中阜苷類化合物產量中的應用。
在本發明中，優選的，所述的青霉屬真菌為青霉屬真菌Ml，該菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCCN0. 6359。在本發明中，所述的人參或西洋參發酵產物是指人參的根發酵產物、根莖發酵產物、葉發酵產物或莖發酵產物；或西洋參的根發酵產物、根莖發酵產物、葉發酵產物或莖發酵產物。進一步的，本發明還提出了一種提高人參或西洋參發酵過程中皂苷類化合物產量的方法，其特征在于包括以下步驟稱取一定量的人參或西洋參藥材粉末，置于錐形瓶中，加入蒸餾水潤濕藥材，濕熱滅菌，冷卻后接入青霉屬真菌種子液，20-37°C無菌暗培養3-24天。在本發明中，優選的，所述的一種提高人參或西洋參發酵過程中皂苷類化合物產量的方法，是按照以下步驟進行的稱取一定量的人參或西洋參藥材粉末，置于錐形瓶中， 按照每克人參或西洋參藥材粉末加入O. 5-1. 5ml蒸餾水的量加入蒸餾水潤濕藥材(即加入的蒸餾水的體積(ml)與人參或西洋參藥材粉末的重量(g)比為O. 5-1. 5:1)，121°C濕熱滅菌30分鐘，冷卻后按照每克人參或西洋參藥材粉末(未加蒸餾水潤濕之前的固體粉末)加入O. 25-0. 75ml的量接入青霉屬真菌種子液，20°C無菌暗培養6_21天；其中，所述的青霉屬真菌種子液是按照以下方法制備得到無菌條件下將保存的青霉屬真菌菌種從試管中接入PDA平板培養基，28°C暗培養4天，用直徑6mm的無菌打孔器，在長勢良好的菌落邊緣處打孔，取菌餅接種于裝有IOOmlPDA液體培養基的250mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩培養箱120_130r/min，28°C培養2_5天，備用。更優選的，所述的一種提高人參或西洋參發酵過程中皂苷類化合物產量的方法，是按照以下步驟進行的稱取一定量的人參或西洋參藥材粉末，置于錐形瓶中，按照每克人參或西洋參藥材粉末加入Iml蒸餾水的量加入蒸餾水潤濕藥材(即加入的蒸餾水的體積(ml)與人參或西洋參藥材粉末的重量(g)比為1:1)，121 °C濕熱滅菌30分鐘，冷卻后按照每克人參或西洋參藥材粉末加入O. 5ml的量接入青霉屬真菌種子液，20°C無菌暗培養12天；其中，所述的青霉屬真菌種子液是按照以下方法制備得到無菌條件下將保存的青霉屬真菌菌種從試管中接入PDA平板培養基，28°C暗培養4天，用直徑6mm的無菌打孔器，在長勢良好的菌落邊緣處打孔，取菌餅接種于裝有IOOmlPDA液體培養基的250mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩培養箱120r/min，28°C培養5天，備用。在本發明中，優選的，所述的青霉屬真菌為青霉屬真菌Ml，該菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCCN0. 6359。在本發明中，優選的，所述的濕熱滅菌為121°C濕熱滅菌30min。在本發明中，優選的，所述的人參或西洋參藥材包括人參的根、根莖、葉以及莖，還包括西洋參的根、根莖、葉以及莖。利用本發明的方法制備得到人參或西洋參的發酵產物，經檢測其中所含有的總皂苷以及單體皂苷的產量相較于未接種青霉屬真菌種子液的人參或西洋參的藥材粉末都有極顯著的提高。


圖I為青霉屬真菌Ml的菌落形態(正面)；圖2為青霉屬真菌Ml的菌落形態(反面)；圖3為顯微鏡下所觀察到的青霉屬真菌Ml的菌絲形態圖；圖4為顯微鏡下所觀察到的青霉屬真菌Ml的分生孢子梗及孢子形態圖；圖5為菌株Ml擴增產物電泳圖譜； 圖6為青霉屬真菌Ml與其他菌株的聚類結果；圖7為人參總皂苷紫外吸收光譜掃描圖；圖8為接種真菌Ml后人參藥材發酵產物中六種單體皂苷含量變化趨勢圖；圖9為人參藥材接種Ml菌后發酵產物中六種單體皂苷的HPLC色譜圖；注a M1菌第O天的發酵產物；b M1菌第18天的發酵產物；1飛依次為人參皂苷 Rgl、Re、Rbl、Re、Rb2 和 Rd ；圖10為接種真菌Ml后人參藥材發酵產物單體皂苷含量測定結果；圖11為西洋參藥材的Ml菌發酵產物中人參總皂苷含量變化趨勢圖；圖12為西洋參藥材的Ml菌發酵產物中皂苷含量HPLC測定色譜圖；注a_人參皂苷標準品；b_Ml菌液；c_j依次為M1菌第0、3、6、9、12、15、18、21天的發酵產物；1 6依次為人參皂苷Rgl、Re、Rbl、Rc、Rb2和Rd ;7_8號峰只存在于Ml菌發酵產物中的新物質；9號峰只存在于西洋參藥材和Ml菌初期發酵產物中的物質；圖13為接種真菌Ml后西洋參藥材發酵產物中單體皂苷含量變化趨勢圖；圖14為西洋參葉的Ml菌發酵產物中總皂苷含量變化趨勢圖；圖15為西洋參莖的Ml菌發酵產物中總皂苷含量變化趨勢圖。
具體實施例方式下面通過實驗并結合實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。本領域普通技術人員理解，在本發明權利要求所限定的精神和范圍內可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發明的保護范圍內。實施例I真菌Ml的分離純化I實驗儀器及材料I. I 材料人參藥材購自哈藥集團世一堂制藥有限公司，經黑龍江中醫藥大學生藥學教研室都曉偉教授鑒定為五加科植物人參(Panax ginseng C. A. Mey)的干燥根及根莖。I. 2 儀器AB204-N型電子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司);手提式壓力蒸汽消毒器(無錫市長江醫療器械有限公司)；100級潔凈工作臺(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；SPX-150C型恒溫恒濕箱(上海博迅實業有限公司設備廠)。I. 3用具及試劑用具剪刀，鑷子，紗布，濾紙，脫脂棉，培養皿，試管等。試劑鹿糖,分析純,天津市化學試劑一廠；葡萄糖，分析純，天津市化學試劑一廠；瓊脂，分析純，日本產；乙醇，分析純，北京益利精細化學品有限公司；輕質液狀石蠟，藥用，吉林市吉化江城油脂化工有限責任公司。I. 4馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基(PDA)的制備馬鈴薯(去皮)200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水IOOOmL,將馬鈴薯去皮，切成約2cm3的小塊，放入1500mL的燒杯中，加入IOOOmL蒸餾水煮沸30min，注意用玻璃棒攪拌以防糊底，然后用雙層紗布過濾，取其濾液加水補足至1000mL。分裝后加葡萄糖和瓊脂，121°C濕熱滅菌30min。 2實驗方法2. I真菌的分離將人參藥材在28°C、80%濕度條件下進行發酵培養，取不同時期培養物，隨機挑取少量菌絲接種于PDA平板培養基上，每個培養皿內接種3點，同時做3個平行樣。接種好的培養皿置于28°C恒溫培養箱中暗培養5天，每天觀察記錄。另取3個不接種菌絲的空白培養皿，置于28°C恒溫培養箱中暗培養7天，每天觀察記錄，作為空白對照組。2. 2真菌的純化待接種點處長出新菌絲后，根據長出菌落的形態、大小、顏色的不同，挑取菌落邊緣的菌絲，接于新的平板上進行培養，繼續觀察。采用三點法逐步純化，培養數日后，觀察菌落的形態及顏色是否均勻，邊緣是否整齊，確定是否純化。2. 3真菌菌種保存將多次純化的菌種，移至試管PDA斜面培養基上，28°C下暗培養5天，待觀察沒有污染后，加入無菌液體石蠟，液面高于培養基上緣Icm左右，對菌株編號后，放于4°C的冰箱中保存。3實驗結果與分析從人參培養物中分離出的真菌，經初步純化后，菌落表面形態顏色均一，邊緣整齊。對照組無雜菌長出，其菌圖見圖I。實施例2活性真菌的菌種鑒定一、活性真菌的形態學鑒定I實驗材料I. I實驗材料人參中分離得到的真菌Ml。I. 2儀器試劑Motic BA-400數碼顯微圖像系統，麥克奧迪公司；乳酸，化學純，天津市凱通化學試劑有限公司；苯酚，化學純，吉林吉化公司；甘油，化學純，吉林吉化公司；水溶苯胺蘭，上海標本模型廠。2實驗方法2. I菌株的形態學鑒定2. I. I標本片的制備2. I. I. I 載片培養取直徑7cm左右圓形濾紙一張，鋪放于一個直徑9cm的平皿底部，上放一 U形玻棒，其上再平放一張干凈的載玻片與一張蓋玻片，蓋好平皿蓋進行滅菌。挑取真菌孢子接入盛有滅菌水的試管中，搖振試管制成孢子懸液備用。用滅菌滴管吸取滅菌后融化的真菌固體培養基少許，滴于上述滅菌平皿內的載玻片中央，并以接種環將孢子懸液接種在培養基四周，加上蓋玻片，并輕輕壓貼一下。，在濾紙上滴加滅菌后的20%甘油液3 4ml，以防止培養過程中培養基干燥，然后蓋上平皿蓋，放在28°C的培養箱內培養，定期取出在顯微鏡下觀察，記錄孢子萌發、菌絲的生長、孢子囊柄與孢子囊孢形成的過程、孢子著生狀態等。2. I. 3. 2 挑片觀察在載玻片上加一滴乳酸苯酚液棉蘭染色液，用接種針從生長有真菌的平板中挑取帶有孢子的真菌菌絲，放入載玻片上的液滴中，并且用針尖將其分散開，蓋好蓋玻片即得載片標本。(乳酸苯酹液制備苯酹IOg,乳酸IOg,甘油20g,蒸懼水IOml,將水與苯酹混合直到溶解，然后加入乳酸和甘油)。2. I. 3. 3 插片培養插片法將真菌接種在瓊脂平板上，將滅菌的蓋玻片45度角插于固體培養基中，使真菌菌絲沿著培養基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻片上。觀察時，輕輕取出蓋玻片，置于載玻片上直接鏡檢。3實驗結果與分析3. I菌株Ml形態特征菌落形態菌株Ml接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養基上，28°C，暗培養4天，觀察到整個菌落致密扁平，直徑2. 6cm,正面呈灰綠色短毛狀，菌絲平伏，邊緣整齊，表面具有·放射狀皺紋，背面暗黃色，見圖1，圖2。個體形態顯微鏡下顯示，菌絲纖細分枝，有隔，無色透明；菌絲發生直立的分生孢子梗；梗的頂端具有指狀分枝，每枝頂端生有一串孢子，形成掃帚狀見圖3，圖4。二、功能真菌的分子生物學鑒定I實驗材料實驗材料人參發酵物中分離得到的真菌Ml。實驗儀器Motic BA-400數碼顯微圖像系統，麥克奧迪公司；XS105 Dual Range型電子分析天平，瑞士 METTLER TOLEDO公司；Allegra 64R型高速冷凍離心機，美國BECKMAN COULTER公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；NN-GT347H型微波爐，Panasonic公司；DYY11B型三恒電泳儀、DYCP-31A型電泳槽,北京市六一儀器廠；ThermalCycler PCR擴增儀，德國印pendorf公司；WFH_201BT型可見反射透射儀，上海精科實業有限公司；微量移液槍，dragon-med。實驗試劑引物W0508077ITS1 (序列5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，)，W0508078ITS4 (序列5’ -TCCTCCGCT TATTGATATGC-3’)，(三博遠志)6 X DNA loadingbuffer、TE 緩沖液、Marker TIANGENTaq酶、dNTP、10 XBuffer、MgCl2，上海生工生物工程技術服務有限公司瓊脂糖、EB (溴化乙錠)，北京鼎國生物技術有限公司。Tris-飽和酚，生物級，哈爾濱市德美生物技術有限公司2實驗方法
2. I菌株基因組DNA的提取(I)取活性真菌斜面培養的菌種，接種于PDA液體培養基，28°C，130r/min振蕩培養3天。2層紗布過濾出菌絲，用無菌水洗2次，再用滅菌生理鹽水洗2次，無菌濾紙吸去菌體表面水分，獲得菌絲體； (2)將收集的菌絲加液氮研磨，置于含有700μ I DNA提取緩沖液[200mMTris-HCl(PH=8. O),25mM EDTA(PH=8. 0),250mM NaCl，0. 5%SDS (PH=7. 5)]的 I. 5ml離心管中，用微量移液槍混勻，37°C水浴30min ；(3) 12000r/min離心5min，將上清液移入新的離心管中；(4)加入等體積酹-氯仿(1:1),混勻5min, 12000r/min離心5min,將上清液移入新的離心管；(5)加入等體積氯仿，混勻，12000r/min離心2min，將上層溶液移入新的離心管中；(6)加入2倍體積冰乙醇，-20 V放置2小時；(7)取放置后的DNA提取液，12000r/min離心5min，去上清液，加入70%乙醇，清洗沉淀2次，12000r/min離心2min ；(8)去上清液，揮干溶劑，加入75μ I I XTE溶解沉淀即為DNA模板。(9) DNA模板置于_20°C保存備用。2.2PCR擴增反應在超凈工作臺內配制PCR擴增試劑，擴增的反應體系如下
體積(μι)
Taq 酶(0_5υ/μ1) 0.5 IOxPCR緩沖液5
引物 1(10μΜ)2
引物 2 ( ΙΟμΜ)2
dNTP ( 2.5mM )0.4
模板DNA3
MgC123
去離子水34.1PCR反應程序如下I、起始變性 94°C 5min,2、變性 94°C30s，3、退火 55°C30s，4、延伸 72°C lmin,5、延伸 72°C lOmin。2-4步驟進行30個循環PCR擴增后，取擴增產物5 μ L，用I. 5%瓊脂糖凝膠，I X TAE緩沖液(pH7.6，4mol/L Tris-HCl，2. 5ml 加 O. 05mol/L EDTA5ml，調 ρΗ8· O,定容至 250ml)，在 120V/cm 下電泳，約45min后,在紫外分析儀上檢測條帶。2. 3PCR擴增產物的序列測定與數據處理PCR擴增產物由上海英駿生物技術有限公司北京測序部純化測序。將測序結果與GeneBank中已知序列進行比較分析,從Genebank數據庫中獲得相關種屬的ITS序列信息，應用CLUSTAL XI. 83軟件進行多序列比對，將計算結果導入PHYLIP軟件，構建系統進化樹。3實驗結果與分析3. IPCR擴增產物的電泳檢測采用PCR技術對Ml真菌進行DNA中特異ITS序列擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后大約在700bp處可以看到清晰的條帶，表明目的序列得到擴增，菌株Ml擴增產物電泳圖譜如圖5所示。3.2rDNA 序列測定電泳結果顯示，提取的植物樣本rDNA只有一個條帶，純度很高，經過純化的基因組DNA的純度也完全可以滿足下一步的PCR擴增。對菌株的基因組DNA的PCR純化產物進行測序，序列如SEQ ID NO. I所示。3. 3序列分析登陸hppt://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/ 網站，將測序結果與 GeneBank 中已知序列進行比較分析，從Genebank數據庫中獲得相關種屬的ITS序列信息見表I。表I本發明所使用的ITS序列的GeneBank登錄號

權利要求
1.青霉屬真菌(Penicilliumsp.)在提高人參或西洋參發酵過程中阜苷類化合物產量中的應用。
2.如權利要求I所述的應用，其特征在于所述的青霉屬真菌為青霉屬真菌M1，該菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCCNO. 6359。
3.如權利要求I或2所述的應用，其特征在于所述的人參或西洋參發酵產物是指人參的根發酵產物、根莖發酵產物、葉發酵產物或莖發酵產物；或西洋參的根發酵產物、根莖發酵產物、葉發酵產物或莖發酵產物。
4.一株青霉屬真菌，命名為青霉屬真菌Ml，所述菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC NO. 6359。
5.一種提高人參或西洋參發酵過程中皂苷類化合物產量的方法，其特征在于包括以下步驟 稱取一定量的人參或西洋參藥材粉末，置于錐形瓶中，加入蒸餾水潤濕藥材，濕熱滅菌，冷卻后接入青霉屬真菌種子液，20-37°C無菌暗培養3-24天。
6.如權利要求5所述的方法,其特征在于稱取一定量的人參或西洋參藥材粉末，置于錐形瓶中，按照每克人參或西洋參藥材粉末加入O. 5-1. 5ml蒸餾水的量加入蒸餾水潤濕藥材，121°C濕熱滅菌30分鐘，冷卻后按照每克人參或西洋參藥材粉末加入O. 25-0. 75ml的量接入青霉屬真菌種子液，20°C無菌暗培養6-21天； 其中，所述的青霉屬真菌種子液是按照以下方法制備得到 無菌條件下將保存的青霉屬真菌菌種從試管中接入PDA平板培養基，28°C暗培養4天，用直徑6mm的無菌打孔器，在長勢良好的菌落邊緣處打孔，取菌餅接種于裝有100ml PDA液體培養基的250mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩培養箱120-130r/min，28°C培養2_5天，備用。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于稱取一定量的人參或西洋參藥材粉末，置于錐形瓶中，按照每克人參或西洋參藥材粉末加入Iml蒸餾水的量加入蒸餾水潤濕藥材，121°C濕熱滅菌30分鐘，冷卻后按照每克人參或西洋參藥材粉末加入O. 5ml的量接入青霉屬真菌種子液，20°C無菌暗培養12天； 其中，所述的青霉屬真菌種子液是按照以下方法制備得到 無菌條件下將保存的青霉屬真菌菌種從試管中接入PDA平板培養基，28°C暗培養4天，用直徑6mm的無菌打孔器，在長勢良好的菌落邊緣處打孔，取菌餅接種于裝有100ml PDA液體培養基的250mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩培養箱120r/min，28°C培養5天，備用。
8.如權利要求5-7任一項所述的方法，其特征在于所述的青霉屬真菌為青霉屬真菌M1，該菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC NO. 6359。
9.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述的濕熱滅菌為121°C濕熱滅菌30min。
10.如權利要求5-7任一項所述的方法,其特征在于所述的人參或西洋參藥材包括人參的根、根莖、葉以及莖，還包括西洋參的根、根莖、葉以及莖。
全文摘要
本發明公開了一株青霉屬真菌M1及其在提高人參或西洋參發酵過程中皂苷類化合物產量中的應用，屬于生物技術領域。本發明利用功能真菌對人參或西洋參藥材進行發酵培養，并對發酵前后的皂苷類化合物的含量進行分析比較，最終得到了一株能夠顯著提高兩種藥材發酵過程中皂苷類化合物產量的菌株，經鑒定該菌株為青霉屬真菌(Penicillium sp.)，命名為青霉屬真菌M1，該菌株保藏編號為CGMCC NO.6359。將該菌株用于人參或西洋參的發酵生產，結果發現接種該菌株的發酵產物中皂苷類化合物的含量得到很大提高，因此，本發明的提出使得青霉屬真菌在提高人參或西洋參發酵過程中人參皂苷類化合物產量方面將有廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/80GK102943103SQ20121037107
公開日2013年2月27日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者都曉偉, 陳照宇 申請人:都曉偉