專(zhuān)利名稱(chēng)：一種奶山羊plzf基因及其促雄性生殖干細(xì)胞自我更新的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及生殖細(xì)胞自我更新相關(guān)基因，特別涉及一種奶山羊PLZF基因及其促雄性生殖干細(xì)胞自我更新的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生包括精原干細(xì)胞(雄性生殖干細(xì)胞)的增殖、分化、發(fā)育等一系列細(xì)胞形態(tài)和生理功能的改變，最終生成精子的整個(gè)過(guò)程。其中雄性生殖干細(xì)胞的自我更新是精子發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，也是雄性動(dòng)物終生產(chǎn)生精子的基礎(chǔ)。PLZF是POZ家族的新成員，是人類(lèi)精子發(fā)生過(guò)程自我更新的關(guān)鍵調(diào)控因子，在睪丸組織特異性表達(dá)。PLZF是一個(gè)近期被人們發(fā)現(xiàn)并重視的新基因(Buaas Fff, Kirsh AL，Sharma M，McLean DJj Morris 幾，Griswold MD，de Rooij DGj Braun RE. PLZF isrequired in adult male germ cells for stem cell self-renewal. Nature genetics2004，36(6):647-52;Costoya JA，Hobbs RMj Barna M，et al. Essential role of PLZF inmaintenance of spermatogonial stem cells. Nature Genetics 2004，36(6):653-9.)。PLZF即早幼粒細(xì)胞白血病鋒指蛋白(promyelocytic leukemia zinc finger),是由中國(guó)學(xué)者在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)并克隆的基因，亦是我國(guó)學(xué)者在國(guó)內(nèi)自行發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)人類(lèi)疾病相關(guān)基因(Chen Zj Brand NJj Chen A, Chen SJj Tong JHj Wang ZYj Waxman S，ZelentA.Fusion between a novel Kruppel-Iike zinc finger gene and the retinoicacid receptor-alpha locus due to a variant t (11;17)translocation associatedwith acute promyelocytic leukaemia. The EMBO Journal 1993，12(3):1161-7;ChenSJjZelent A，Tong JHjet al. Rearrangements of the retinoic acid receptor alphaand promyelocytic leukemia zinc finger genes resulting from t (11;17) (q23;q21)in a patient with acute promyelocytic leukemia. The Journal of ClinicalInvestigation 1993，91 (5):2260-7.)。PLZF功能的缺失擾亂了精原干細(xì)胞(SSCs)增殖與分化之間的平衡，使之由增殖轉(zhuǎn)向分化。PLZF為成年雄性動(dòng)物的精原干細(xì)胞自我更新所必需的，PLZF有助于精原干細(xì)胞在雄性生殖腺中駐留。PLZF定向敲除導(dǎo)致雄性不育，PLZF在單個(gè)、成對(duì)或結(jié)成鏈狀的未分化的精原細(xì)胞中均有表達(dá)(Buaas Fff, Kirsh AL, Sharma M, et al. PLZF is required inadult male germ cells for stem cell self-renewal. Nat Genet 2004, 36:647-652. X干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體。已有研究證實(shí)干細(xì)胞可以在體外分化為早期生殖細(xì)胞，甚至進(jìn)一步分化為卵母細(xì)胞或精子(HUbnerK，F(xiàn)uhrmann G，Christenson LKj et al. Derivation of oocytes from mouse embryonicstem cells[J]. Science，2003，300:1251 - 1256;Geijsen N，Horoschak M，Kim K，etal. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stemcells[J]. Nature, 2004，427:148 - 154.)。
雖然至今建立了多種用于雄性生殖干細(xì)胞體外增殖和分化的研究體系，Knockout實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了許多調(diào)控自我更新的關(guān)鍵基因和蛋白，但是還不能完全實(shí)現(xiàn)建立體外進(jìn)行自我更新和精子發(fā)生的研究模型，體外很難控制雄性生殖干細(xì)胞自我更新的起始。因此，通過(guò)構(gòu)建一些增殖多能性關(guān)鍵基因的真核表達(dá)載體，利用其修飾體外培養(yǎng)雄性生殖干細(xì)胞，探索功能基因之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)相關(guān)調(diào)控自我更新的信號(hào)途徑，進(jìn)而揭示自我更新過(guò)程基因之間相互作用的分子機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種奶山羊PLZF基因及其促雄性生殖干細(xì)胞自我更新的應(yīng)用，將外源PLZF基因轉(zhuǎn)染雄性生殖干細(xì)胞可促其進(jìn)行自我更新，可研究PLZF對(duì)雄性生殖干細(xì)胞特異基因表達(dá)的調(diào)控作用。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn) 一種奶山羊PLZF基因，該基因序列如SEQ. ID. NO. I所不。一種奶山羊PLZF基因，其基因的CDS序列如SEQ. ID. NO. 2所示。 一種奶山羊PLZF基因的融合基因，在奶山羊PLZF基因的下游連接熒光報(bào)告基因。所述的奶山羊PLZF基因的融合基因，還在熒光標(biāo)記基因的下游連接抗生素篩選基因。一種基于奶山羊PLZF基因序列構(gòu)建的表達(dá)載體，包含SEQ. ID. NO. 2所示的PLZF基因CDS序列，在PLZF基因序列的下游連接熒光標(biāo)記基因GFP，在GFP的下游連接抗生素篩選基因 IcanYneolrtj所述的基于PLZF基因序列構(gòu)建的表達(dá)載體為pPLZF-IRES2-EGFP表達(dá)載體，通過(guò)Ecor I和BamH I酶切位點(diǎn)將PLZF基因克隆到pIRES2_EGFP表達(dá)載體。奶山羊PLZF基因序列轉(zhuǎn)染到雄性生殖干細(xì)胞中以促進(jìn)雄性生殖干細(xì)胞自我更新的應(yīng)用。一種促進(jìn)奶山羊雄性生殖干細(xì)胞自我更新的方法，包括以下步驟I)克隆如SEQ. ID. NO. I所示的奶山羊PLZF基因序列，并將PLZF基因序列通過(guò)Ecor I和BamH I酶切位點(diǎn)克隆到pIRES2_EGFP表達(dá)載體中，得到pPLZF_IRES2_EGFP表達(dá)載體；2)將待轉(zhuǎn)染的奶山羊雄性生殖干細(xì)胞與PPLZF-IRES2-EGFP表達(dá)載體共同孵育，將pPLZF-IRES2-EGFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到雄性生殖干細(xì)胞之中；轉(zhuǎn)染后3 4h，將奶山羊雄性生殖干細(xì)胞在基本培養(yǎng)基上添加其體積10%的胎牛血清和1%的非必需氨基酸，以及O. lmmol/L的β -巰基乙醇和2mmol/L的L-谷氨酰胺進(jìn)行培養(yǎng)；所述的基本培養(yǎng)液為DMEM/F12培養(yǎng)液或H-DMEM培養(yǎng)液；并在熒光顯微鏡下對(duì)熒光標(biāo)記基因進(jìn)行觀察，篩選啟動(dòng)自我更新相關(guān)基因表達(dá)水平增高的細(xì)胞。還以人的293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染作為對(duì)照，該細(xì)胞所采用的基本培養(yǎng)液為H-DMEM培養(yǎng)液。所述的啟動(dòng)自我更新相關(guān)基因?yàn)镻CNA、C-MYC, 0CT4、PLZF, CDK2和CYCINA1。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果
I、本發(fā)明克隆了奶山羊的PLZF基因，其CD區(qū)大小為2022bp(SEQ. ID. NO. 2)，在其CDS序列的保守性達(dá)90%以上；該基因可促進(jìn)雄性生殖干細(xì)胞自我更新。2、本發(fā)明在克隆奶山羊的PLZF基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了 pPLZF_IRES2_EGFP重組載體，利用PPLZF-IRES2-EGFP重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)增多。pPLZF-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染293T后，細(xì)胞形態(tài)也未發(fā)生顯著變化，但是增殖和多能性 標(biāo)記基因的表達(dá)水平略有上調(diào)，表明細(xì)胞有進(jìn)入自我更新的趨勢(shì)；轉(zhuǎn)染奶山羊雄性生殖干細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，啟動(dòng)自我更新相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著增高。


圖I是PCR擴(kuò)增的PLZF基因的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2是Ecor I和BamH I雙酶切鑒定陽(yáng)性重組載體pPLZF_IRES2_EGFP ；圖3是奶山羊PLZF基因⑶S序列與人、牛、綿羊、大鼠、小鼠、山羊等物種序列比較所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；圖4是熒光顯微鏡觀察重組載體pPLZF-IRES2-EGFP在293T細(xì)胞的表達(dá)；圖5是熒光顯微鏡觀察重組載體PPLZF-IRES2-EGFP在奶山羊雄性生殖干細(xì)胞的表達(dá)后增殖多能性基因的表達(dá)；圖6是奶山羊雄性生殖干細(xì)胞轉(zhuǎn)染pPLZF-IRES2-EGFP 48h后生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記基因表達(dá)的RT-PCR結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。I、奶山羊PLZF基因的克隆及載體構(gòu)建首先提取奶山羊睪丸組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，作為擴(kuò)增的模板；用電子克隆技術(shù)結(jié)合Primer Premier 5. O引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,并選擇合適的限制性內(nèi)切酶，具體設(shè)計(jì)以下引物上游引物RRtRaattCRCCRRtRRtRatttRCtaaC下游引物attRRatccccatcRcttctcctcctRct上游引物中劃線部分為Ecor I酶切位點(diǎn)，下游引物中下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)；PLZF基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為15 μ L，其中包括10Xbuffer I. 5 μ L，MgCl2(25mmol/L) I. 6μ L, dNTP (2. 5mmol/L) I. 2μ L, Taq DNA 聚合酶 0· I μ L，上、下游引物(10 μ mol/L)各 O. 3 μ L，cDNA 模板 O. 5 μ L, ddH20 9· 5 μ L。反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸90s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C補(bǔ)延伸10min，4°C保存。回收并純化PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在約2320bp (檢測(cè)結(jié)果如圖I所示)處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，得到奶山羊的PLZF基因；然后將PCR產(chǎn)物、pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體(Addgene)分別用Ecor I和BamH I雙酶切后連接，將PLZF基因克隆入pIRES2_EGFP真核表達(dá)載體，構(gòu)建重組載體PPLZF-IRES2-EGFP。將重組載體pPLZF-IRES2-EGFP進(jìn)行Ecor I和BamH I雙酶切鑒定，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，雙酶切鑒定結(jié)果如圖2所示，在2320bp和5300bp處出現(xiàn)目的條帶，也即克隆到的PLZF基因目標(biāo)片段和酶切之后剩余的PIRES2-EGFP載體骨架。通過(guò)挑取多個(gè)單克隆酶切驗(yàn)證后測(cè)序，大小和序列一致，測(cè)序后得到PLZF基因序列，核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。將奶山羊PLZF基因中的⑶S序列，如SEQ. ID. NO. 2所示(⑶S序列是編碼一段蛋白產(chǎn)物的序列，各物種之間CDS區(qū)的高度相似，也就意味它們翻譯出的蛋白所構(gòu)成的氨基酸更為相似，發(fā)揮的功能也更為相似，即蛋白的功能更為保守)。與GenBank上公布的人、牛、山羊、綿羊、小鼠、大鼠等物種的PLZF基因⑶S序列比較，用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖3所示。生物信息學(xué)分析表明PLZF基因的CDS序列在多個(gè)物種高度保守，也就是說(shuō)PLZF蛋白在各物種中的功能較為保守。 2、重組載體的轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的觀察將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞及奶山羊雄性生殖干細(xì)胞用O. 25%胰蛋白酶消化吹打成單細(xì)胞懸液，接種到鋪有明膠的24孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)細(xì)胞至約70%時(shí)融合，按照Fermentas公司的TurboFect 轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行pPLZF_IRES2_EGFP重組載體的轉(zhuǎn)染。具體為將2μ g載體加入300μ I opti-MEM培養(yǎng)液中，再加入4 μ I TurboFect轉(zhuǎn)染試齊[J，溫和混勻。室溫孵育20min后，將TurboFect/DNA混合物均勻加入培養(yǎng)皿內(nèi)。轉(zhuǎn)染后3-4h, 293T的培養(yǎng)基更換為H-DMEM+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+10%體積濃度的胎牛血清培養(yǎng)；奶山羊雄性生殖干細(xì)胞的培養(yǎng)基更換為DMEM/F12+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+10%體積濃度的胎牛血清。轉(zhuǎn)染后，在熒光顯微鏡下，293T和奶山羊生殖細(xì)胞中均觀察到綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。隨時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)增多。pPLZF-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染293T(圖4)后，細(xì)胞形態(tài)并未發(fā)生顯著變化，但只有轉(zhuǎn)染了 PLZF重組載體的細(xì)胞出現(xiàn)GFP綠色熒光，并且在這些細(xì)胞中能檢測(cè)到PLZF的表達(dá)(圖4e-g)，表明所構(gòu)建的重組載體pPLZF-IRES2-EGFP能順利轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并表達(dá)PLZF蛋白。圖4中的對(duì)照轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP的293T，分別為在明場(chǎng)和熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果；圖4中轉(zhuǎn)PLZF中無(wú)熒光點(diǎn)的圖為未轉(zhuǎn)進(jìn)去的293T，出現(xiàn)熒光點(diǎn)的圖為轉(zhuǎn)染PLZF重組載體的293T細(xì)胞。pPLZF-IRES2-EGFP重組載體轉(zhuǎn)染奶山羊雄性生殖干細(xì)胞后，熒光觀察結(jié)果如5所示，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，轉(zhuǎn)染重組載體的細(xì)胞為上皮樣，對(duì)照組細(xì)胞呈纖維狀。圖5提示轉(zhuǎn)了 PLZF后細(xì)胞啟動(dòng)自我更新相關(guān)基因PCNA、C-MYC、0CT4、PLZF的表達(dá)水平顯著增高。所述的自我更新、增殖多能性以及周期相關(guān)基因采用RT-PCR來(lái)檢測(cè)，擴(kuò)增反應(yīng)體系為 15 μ L :其中包括10 X buffer I. 5 μ LjMgCl2 (25mmol/L) I. 6 μ L，dNTP (2. 5mmol/L)I. 2μ L, Taq DNA 聚合酶 0. I μ L，上、下游引物(10 μ mol/L)各 O. 3 μ L，cDNA 模板 0· 5 μ L，ddH20 9. 5 μ L0
反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，退火30s，72°C延伸90s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C補(bǔ)延伸10min，4°C保存。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，轉(zhuǎn)染pPLZF-IRES2-EGFP的細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞 的卩0應(yīng)、0]^(、0(^4、？1^ 、0)1(2、0￥(1嫩1的表達(dá)水平顯著增高。說(shuō)明PLZF基因可作用于一系列增殖和多能性的基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)哺乳動(dòng)物生殖干細(xì)胞的自我更新。
權(quán)利要求
1.一種奶山羊PLZF基因，其特征在于，其基因序列如SEQ. ID. NO. I所示。
2.一種奶山羊PLZF基因，其特征在于，該基因的⑶S序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3.一種奶山羊PLZF基因的融合基因，其特征在于，在奶山羊PLZF基因的下游連接熒光報(bào)告基因。
4.如權(quán)利要求3所述的奶山羊PLZF基因的融合基因，其特征在于，還在熒光標(biāo)記基因的下游連接抗生素篩選基因。
5.一種基于奶山羊PLZF基因序列構(gòu)建的表達(dá)載體，其特征在于，包含SEQ. ID. NO. 2所示的PLZF基因⑶S序列，在PLZF基因序列的下游連接熒光標(biāo)記基因GFP，在GFP的下游連接抗生素篩選基因kanVnec/。
6.如權(quán)利要求5所述的基于奶山羊PLZF基因序列構(gòu)建的表達(dá)載體，其特征在于，所述的基于PLZF基因序列構(gòu)建的表達(dá)載體為pPLZF-IRES2-EGFP表達(dá)載體，通過(guò)Ecor I和BamHI酶切位點(diǎn)將PLZF基因克隆到pIRES2-EGFP表達(dá)載體。
7.奶山羊PLZF基因序列轉(zhuǎn)染到奶山羊雄性生殖干細(xì)胞中以促進(jìn)其自我更新的應(yīng)用。
8.一種促進(jìn)奶山羊雄性生殖干細(xì)胞自我更新的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)克隆如SEQ.ID. NO. I所示的奶山羊PLZF基因序列，并將PLZF基因序列通過(guò)Ecor I和BamH I酶切位點(diǎn)克隆到pIRES2_EGFP表達(dá)載體中，得到pPLZF_IRES2_EGFP表達(dá)載體； 2)將待轉(zhuǎn)染的奶山羊雄性生殖干細(xì)胞與pPLZF-IRES2-EGFP表達(dá)載體共同孵育，將PPLZF-IRES2-EGFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到雄性生殖干細(xì)胞之中； 轉(zhuǎn)染后3 4h，將奶山羊雄性生殖干細(xì)胞在基本培養(yǎng)基上添加其體積10%的胎牛血清和1%的非必需氨基酸，以及O. lmmol/L的β -巰基乙醇和2mmol/L的L-谷氨酰胺進(jìn)行培養(yǎng)；所述的基本培養(yǎng)液為DMEM/F12培養(yǎng)液或H-DMEM培養(yǎng)液； 并在熒光顯微鏡下對(duì)熒光標(biāo)記基因進(jìn)行觀察，篩選啟動(dòng)自我更新相關(guān)基因表達(dá)水平增高的細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8所述的促進(jìn)奶山羊雄性生殖干細(xì)胞自我更新的方法，其特征在于，還以人的293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染作為對(duì)照，該細(xì)胞所采用的基本培養(yǎng)液為H-DMEM培養(yǎng)液。
10.如權(quán)利要求8所述的促進(jìn)奶山羊雄性生殖干細(xì)胞自我更新的方法，其特征在于，所述的啟動(dòng)自我更新相關(guān)基因?yàn)镻CNA、C-MYC, 0CT4、PLZF, CDK2和CYCINA1。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種奶山羊PLZF基因及其促雄性生殖干細(xì)胞自我更新的應(yīng)用，該基因的CDS序列如SEQ.ID.NO.1所示。基于奶山羊PLZF基因序列構(gòu)建的表達(dá)載體，包含SEQ.ID.NO.1所示的PLZF基因CDS序列，在PLZF基因序列的下游連接熒光標(biāo)記基因GFP，在GFP的下游連接抗生素篩選基因kanr/neor。奶山羊PLZF基因序列轉(zhuǎn)染到雄性生殖干細(xì)胞中以促進(jìn)雄性生殖干細(xì)胞自我更新的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102888407SQ20121037673
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月8日
發(fā)明者宋文聰, 華進(jìn)聯(lián) 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)