專利名稱：一種油菜隱性核不育基因區段的分子標記與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于油菜育種技術領域。具體涉及一種控制甘藍型油菜隱性核不育育性基因(BnMS3/ms3與&iRf/rf)區段分子標記，同時還涉及一種控制甘藍型油菜隱性核不育性基因區段分子標記在選育油菜隱性核不育系與臨保系中的用途。
背景技術：
雜種優勢利用被認為是提高作物產量、改善品質的有效途徑，而良好的授粉控制系統是雜種優勢利用的關鍵所在。目前雜種優勢利用途徑主要有人工去雄、化學殺雄、自交不親和、雄性不育等，其中雄性不育應用最為廣泛。植物在有性繁殖的過程中不能產生正常花粉的遺傳現象稱為雄性不育，雄性不育可以分為細胞質雄性不育(CMQ和細胞核雄性不育(GMS)。細胞質雄性不育為人類所知已有100多年的歷史，并且在水稻、玉米、油菜等作物中廣泛的用于雜交種生產。目前，世界上可以用于油菜雜種優勢利用的CMS系統有ogu、 kos、tour和波里馬。其中，波里馬CMS是目前國際上公認的最有實用價值的CMS系統，但是波里馬不育系育性受溫度的影響表現不穩定，制種風險較大，其應用受到了一定的限制。 甘藍型油菜細胞核雄性不育系由于育性表現穩定徹底，無胞質負效應，恢復源較為廣泛，近年來倍受育種家關注。目前國內外利用的油菜核不育系主要有以下四種類型顯性核不育、 兩對隱性基因控制的核不育、互作型核不育和轉基因核不育。中國四川省宜賓地區農科所 (1972)發現的宜3A是顯性核不育系的典型代表，由于顯性核不育恢復系較難選育，目前還沒有選育出大面積推廣的雙低雜交組合。S45A(潘濤等，1988)和117A(侯國佐等，1991) 是兩對隱性基因控制的核不育系的典型代表，由其選育而來的雜交種中已審定的有“蜀雜 6號” “蜀雜7號”、“油研7號”、“油研8號”和“油研9號”等。該類系統主要缺陷是不育系中存在50%的可育株，在制種時需要在初花期人工拔除其中50%的可育株，不僅增加了制種的成本，而且往往由于可育株清除不徹底，影響制種純度，增加了生產的風險。涂金星等O010)通過圖位克隆的方法克隆了 S45A的恢復基因&1CYP704B，并通過進一步控制該基因的表達，繁殖甘藍型油菜100%轉基因不育系，突破了甘藍型油菜核不育系雜交制種存在50%可育株的障礙，但目前還未在生產上推廣。美國和加拿大利用煙草的1々四基因的啟動子和核糖核酸水解酶(barnase)基因構建成融合基因轉化甘藍型油菜，人工創造了新的核不育材料，并通過向該材料中導入抗除草劑基因后達到了機械化作業。但是該系統用到的不育系和恢復系均為轉基因材料，目前仍處于專利保護期內。9012A(陳鳳祥等，1998)和 20118A (孫超才等，2004)均屬于互作型核不育系，該不育系最大的優點是可通過引入臨保系獲得100%的不育系，在實現三系化配套時避免了制種過程中拔除50%可育株的麻煩， 在油菜核不育系統研究領域取得了重大進展。以其為材料選育的品種中，已審定的雜交種有“皖油14號”(陳鳳樣等，2002)、“皖油18號，(陳鳳祥等，2003)和“滬油雜1號”(孫超才等，2004)等組合。陳鳳祥等也由于這項重大的突破獲得了 2007年度國家科技進步二等獎。由于該系統具有較大的應用潛力，但由于該系統應用的關鍵在于選育純合不育系兩型系與同型臨保系，應用傳統的雜交測交選育所需時間長，工作量極大。應用分子標記結合回交轉育是目前用于對單基因控制或者幾個基因控制的性狀轉育的快捷有效的辦法。開發與不育基因連鎖的分子標記用于該不育系統不育系與臨保系的分子標記輔助轉育，具有重要意義。目前對該系統控制育性的關鍵基因BnMs3與^irf(Bnesp)的研究較多，柯麗萍等(2005)、黃鎮等(2007)、何俊平等(2009)先后實現了 BnMs3的初定位和精細定位，謝彥周等Q007)、肖麓等(2008)、徐正華等Q009)也先后對&irf (Bnesp)進行了相關研究。在定位的過程中開發了很多的分子標記，部分標記已被驗證可以應用于標記輔助育種，但由于沒有基因內的分子標記，在選擇的效率和準確性上還存在一定的局限性。

發明內容
本發明的目是在于提供了一種油菜隱性核不育基因區段的分子標記，控制甘藍型油菜隱性核不育育性的基因BnMs3與^irf(Bnesp)基因所在區段的核苷酸序列，該序列的獲得與公布，將加快BnMs3與&irf兩對基因的克隆，為從分子水平和代謝水平研究油菜隱性核不育育性控制機制奠定了基礎，并為開發與這兩個基因的功能標記和與之連鎖的可用于分子標記輔助選擇的標記提供了序列參考。本發明的另一個的目是在于提供了一種控制甘藍型油菜隱性核不育育性基因區段的分子標記在甘藍型油菜隱性核不育系與臨保系分子標記輔助轉育中的應用。這些基因區段IOKB物理距離以內的分子標記的應用，將使油菜隱性核不育系與臨保系的分子標記輔助轉育更快，更準，更有效。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施—種控制甘藍型油菜隱性核不育育性的基因區段的核苷酸序列及分子標記的制備方法，其步驟是1、申請人所在單位通過對控制油菜隱性核不育基因BnMs3與&irf的初級定位與精細定位，分別將BnMs3與^irf(Bnesp)定位在甘藍型油菜N19和N7連鎖群上一段小于 0. 2cM的遺傳區間內。2、通過標記篩選結合Southern雜交篩選Tapidor BAC文庫，分別獲得了包含 BnMS3 和 Bnrf 的目標克隆 JBnB043L23 與 JBnB089D05。3、通過目標BAC的局部測序(華大基因)和進一步開發標記與比較測序相結合的方法獲得了 BnMs3與^irf(Bnesp)的候選基因區段的核苷酸序列。序列信息如下l)BnMs3基因區段的核苷酸序列為序列表中SEQ. 1中所示的DNA序列；2)Bnms3基因區段的核苷酸序列為序列表中SEQ. 2中所示的DNA序列；3)BnRf基因區段的核苷酸序列為序列表中SEQ. 3中所示的DNA序列；4)Bnrf基因區段的核苷酸序列為序列表中SEQ. 4中所示的DNA序列。4、根據步驟3所提供的BnMs3與等位隱性基因Bnms3基因區段核苷酸序列之間存在的差異以及&iRf與等位隱性基因&irf基因區段核苷酸序列之間存在的差異，分別開發設計引物，最終開發出BnMs3與&iRf兩個不育基因區段的分子標記多對(表1)。表1 本發明在目標基因區段開發的SCAR分子標記特征
權利要求
1.一種油菜隱性核不育基因區段的分子標記，其特征在于所述的分子標記為 GAGGGTTACAATGGAGGTAC/ CTTGCTATCTGAGAAACAACG。
2.一種油菜隱性核不育基因區段的分子標記，其特征在于所述的分子標記為 GAGGGTTACAATGGAGGTAC/TATCAACCAAATAAACAATGATC。
3.一種油菜隱性核不育基因區段的分子標記，其特征在于所述的分子標記為 ATCTCAAATCTTTCAGCTGATGA/GTTCTCTAATACTATATGCGATA。
4.一種油菜隱性核不育基因區段的分子標記，其特征在于所述的分子標記為 GCGGTCACAAGAGGAGGTAA/CAGCCTCAATCCCAGTCTTC。
5.一種油菜隱性核不育基因區段的分子標記，其特征在于所述的分子標記為 ACACAACTGTGCGGTTTTGTGACT/AGTACCCAGTTTCAGACAGCCTA。
6.一種油菜隱性核不育基因區段的分子標記，其特征在于所述的分子標記為 CTCAAGAAGGCTGGTGCATCCGGA/TGGCTACTTCCCCAACAATCACT。
7.一種油菜隱性核不育基因區段的分子標記，其特征在于所述的分子標記為 CTCAAGAAGGCTGGTGCATCCGGA/AAAGATAACCAAAACACACTCGG。
8.一種油菜隱性核不育基因區段的分子標記，其特征在于所述的分子標記為 AGACATCATTGACGCTGCTG/TGAAGATCTTGTGTCTAGCAATG。
9.權利要求1至8任意一項所述的一種油菜隱性核不育基因區段的分子標記在甘藍型油菜隱性核不育系分子標記輔助轉育中的應用。
10.權利要求1至8任意一項所述的一種油菜隱性核不育基因區段的分子標記在甘藍型油菜隱性核臨保系分子標記輔助轉育中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種油菜隱性核不育基因區段的分子標記與應用，其步驟A、通過對控制油菜隱性核不育基因BnMs3與Bnrf的定位，將BnMs3與Bnrf定位在甘藍型油菜N19和N7連鎖群上一段小于0.2cM的遺傳區間；B、通過標記篩選結合Southern雜交篩選TapidorBAC文庫，獲得了包含BnMS3和Bnrf的目標克隆JBnB043L23與JBnB089D05；C、通過目標BAC的測序獲得了BnMs3與Bnrf的候選基因區段的核苷酸序列；D、根據C步驟的BnMs3與等位隱性基因Bnms3基因區段核苷酸序列之間的差異以及BnRf與等位隱性基因Bnrf基因區段核苷酸序列之間的差異，開發設計引物，開發出BnMs3與BnRf不育基因區段的分子標記。分子標記在甘藍型油菜隱性核不育系與臨保系分子標記輔助轉育中的應用，使油菜隱性核不育系與臨保系的分子標記輔助轉育更快，更準，更有效。
文檔編號C12Q1/68GK102286474SQ20111013689
公開日2011年12月21日 申請日期2011年5月25日 優先權日2011年5月25日
發明者李季, 楊光圣, 洪登峰, 董發明 申請人:華中農業大學