專利名稱：一種添加擴增內標的食品中豬肉或雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測方法
技術領域：
本發明屬于食品安全檢測領域，涉及的是食品中動物源性成分的快速檢測，具體涉及一種添加擴增內標的食品中豬肉、雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測方法。
背景技術：
肉制品摻假是公眾關注的焦點問題之一。目前，肉類摻假主要表現在不法企業使用相對廉價的豬肉、雞肉等肉類，通過多種形式的深加工，冒充牛肉制品進行銷售，以謀取不當利益。摻假行為不僅侵犯了消費者的合法權益，而且極大打擊了公眾對于我國食品質量安全狀況的信心。因此，對于摻假牛肉制品中較常出現的豬肉和雞肉，建立科學、準確快速的檢測方法已十分必要。以聚合酶鏈反應(PCR)為基礎的技術已逐步成為了食品中肉類種屬鑒定的核心方 法。許多學者根據不同物種基因序列的差異位點設計特異性引物，利用PCR反應實現食品中特征基因片段的指數級擴增，繼而通過電泳檢測鑒別食品中可能的物種來源。近年來，實時熒光PCR技術的飛速發展大大提高了食品中物種鑒別的效率和靈敏度，并使得肉類含量的定量溯源成為可能。在目標基因選擇方面，動物細胞核基因組DNA序列具有高度的物種特異性，能夠保證檢測過程中不會出現物種間非特異性擴增而導致的交叉干擾；此外，目前對食品中動物源性的熒光定量PCR檢測研究均缺乏陽性擴增內標(IAC)對反應體系進行監控，無法避免檢測假陰性結果的產生，導致檢測結果不準確。目前國際上以細胞核基因DNA序列為目標基因，并添加有擴增內標的食品中動物源性熒光定量PCR檢測方法尚未見報道。因此，建立添加有擴增內標的食品中豬肉和雞肉的熒光定量PCR快速檢測方法將對食品安全的快速監管具有重要的創新性實踐意義。

發明內容
本發明從豬和雞細胞核基因中的物種特異性序列出發，探索并完善了快速檢測食品中豬肉和雞肉的Taqman熒光定量PCR檢測方法。一種添加擴增內標的食品中豬肉和雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測方法，包括以下步驟(1)應用根據豬的beta actin基因及雞的transforming growthfactor基因設計擴增引物和Taqman探針，分別使用熒光基團FAM、HEX作為探針的發光基團；(2)設計構建含有陽性擴增內標DNA的重組質粒并設計相應探針；(3)以含有待檢DNA模板、含有陽性擴增內標DNA的重組質粒，陽性擴增內標DNA的Taqman探針，以及設計合成的豬beta actin基因擴增引物和Taqman探針，或雞transforming growth factor基因擴增引物和Taqman探針的熒光定量PCR反應體系進行熒光定量PCR反應；(4)應用ABI7500Software SDS1. 4對實驗結果進行分析處理，以Ct值小于36的擴增作為檢測的陽性結果；其中步驟(2)所述的設計構建含有陽性擴增內標DNA的重組質粒的方法為使用DNA隨機生成軟件產生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后沒有出現與之同源的DNA片段，在這段隨機DNA序列上、下游分別連接上目標物種的擴增引物序列，從而形成針對豬檢測體系和雞檢測體系長度分別為98bp和94bp的陽性擴增內標DNA序列；將這兩段擴增內標DNA序列委托人工基因合成，合成片段分別連接載體pGH，轉化感受態細胞DH5 α，小量提取并測序驗證，得到分別針對豬肉和雞肉檢測體系的含有陽性擴增內標DNA的重組質粒。本發明根據Genbank中豬的beta actin基因(登錄號為DQ452569. I)和雞的transforming growth factor基因(登錄號為AY685072. I)設計了用于突光定量PCR檢測的擴增引物和Taqman探針，分別使用熒光基團FAM、HEX作為探針的發光基團。引物與探針序列見表I。表I熒光定量PCR引物與探針序列
權利要求
1.一種添加擴增內標的食品中豬肉或雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(I)應用根據豬的beta actin基因或雞的transforminggrowth factor基因設計擴增引物和Taqman探針,分別使用突光基團FAM、HEX作為探針的發光基團；(2)設計構建含有陽性擴增內標DNA的重組質粒并設計相應探針；(3)以含有待檢DNA模板，含有陽性擴增內標DNA的重組質粒，陽性擴增內標DNA的Taqman探針，以及設計合成的豬beta actin基因擴增引物和Taqman探針，或雞transforming growth factor基因擴增引物和Taqman探針的熒光定量PCR反應體系進行熒光定量PCR反應；(4)應用ABI 7500SoftwareSDSl. 4對實驗結果進行分析處理，以Ct值小于36的擴增作為檢測的陽性結果；其中步驟(2)所述的設計構建含有陽性擴增內標DNA的重組質粒的方法為使用DNA隨機生成軟件產生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后沒有出現與之同源的DNA片段，在這段隨機DNA序列上、下游分別連接上目標物種的擴增引物序列，從而形成針對豬檢測體系和雞檢測體系長度分別為98bp和94bp的陽性擴增內標DNA序列；將這兩段擴增內標DNA序列委托人工基因合成，合成片段分別連接載體pGH，轉化感受態細胞DH5 α，小量提取并測序驗證，得到分別針對豬肉和雞肉檢測體系的含有陽性擴增內標DNA的重組質粒。
2.根據權利要求I所述的一種添加有擴增內標的用于檢測食品中豬肉或雞肉成分的Taqman探針熒光定量PCR法，其特征在于 豬beta actin基因擴增上游引物為SEQ ID NO. 1，下游引物為SEQ ID NO. 2，探針為 5’ -FAM-ACAGTAGGTCTGACGTGACTCCCCGA-BHQ 1-3’ ； 雞transforming growth factor基因擴增上游引物為SEQ ID NO. 3,下游引物為SEQID NO. 4，探針為 5’ -HEX-CTGCCAAGCTCTGCCACTCCTCTG-BHQ 1-3’ ； 針對豬檢測體系的陽性擴增內標DNA序列SEQ ID NO. 5 ； 針對雞檢測體系的陽性擴增內標DNA序列SEQ ID NO. 6 ； 陽性擴增內標 DNA 的 Taqman 探針為5’ -CY5-ATGACCAAAGCCTCCGGGCGTAG-BHQ3-3’。
3.根據權利要求I所述的一種添加擴增內標的食品中豬肉或雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測方法，其特征是，所述熒光定量PCR反應體系為20 μ L反應體系包含模板DNA和含有陽性擴增內標DNA的重組質粒各2 μ L，Premix Ex Taq 10 μ L，靶基因探針溶液和擴增內標探針溶液各O. 4μ M，ROX校正溶液O. 4 μ L，豬和雞擴增體系中引物濃度分別為 O. 2 μ M 和 O. 6μΜ。
4.根據權利要求I所述的一種添加擴增內標的食品中豬肉或雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測方法，其特征在于，所述熒光定量PCR反應條件為95°C 30s，40個循環的 950C 5s 和 600C 34s。
5.權利要求I所述的一種添加擴增內標的食品中豬肉、雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測方法在食品質量控制和質量安全檢測中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種添加擴增內標的食品中豬肉或雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測方法。具體方法為分別基于動物細胞核基因設計引物和探針；人工合成一段競爭型擴增內標及相應的探針，建立內標熒光定量PCR體系，應用ABI 7500 Software SDS 1.4對實驗結果進行分析處理，以Ct值小于36的擴增作為檢測的陽性結果。本發明檢測方法具有良好的針對目標物種的特異性的同時通過實時監控PCR反應以避免假陰性檢測結果的產生，為食品中動物源性成分鑒定探索了新的途徑，具有準確穩定、操作方便等有益效果。
文檔編號C12Q1/68GK102864243SQ201210390500
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月15日 優先權日2012年10月15日
發明者黃明, 何瑋玲, 楊靜, 徐幸蓮, 周光宏 申請人:南京農業大學