專利名稱：一株具誘導大豆抗大豆胞囊線蟲的簡單芽孢桿菌及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物農藥技術領域，具體涉及一種具誘導大豆抗大豆胞囊線蟲的簡單芽孢桿菌及應用。
背景技術：
大豆胞囊線蟲病(Soybean Cyst Nematode,簡稱SCN)是由大豆胞囊線蟲Qieterodera glycines)侵染引起的,是危害世界大豆生產最嚴重的病害之一。該病害具有分布廣、危害重、寄主范圍寬、傳播途徑多、休眠體(胞囊)存活時間長等特點，是一種極難防治的土傳病害。近年來隨著我國大豆栽培面積的不斷擴大，大豆胞囊線蟲的分布也越來越廣，主要發生在東北和黃淮海等共14個省市自治區，大豆受其為害后一般減產20% 30%，重者可達70% 80%，甚至顆粒無收。大豆胞囊線蟲是土傳的定居性內寄生線蟲，侵染植株根系，成為目前世界各國大豆生產中的主要難題，化學防治使用的大多數殺線劑嚴重污染 環境，破壞生態平衡。近20年來，隨著可持續農業和有機農業的發展，人們已將防治線蟲病害的工作重點轉向了生物防治。大豆胞囊線蟲的生防因子有很多，包括真菌、細菌、病毒和原生動物等。利用植物根圍促生菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)防治大豆胞囊線蟲病害已有研究，Becker等1988年報道了假單胞菌屬(Pseudomonas)和芽孢桿菌屬{Bacillus)對根結線蟲病害有防治作用。Racke和Sikora 1992年報道了根際細菌sp.和B. cereus對防治南方根結線蟲(Meloidogyne incogni ia)、大豆胞囊線蟲(/fe teroderaglycines)、玉米胞囊線蟲(/feferoofera zeae)和燕麥胞囊線蟲QioterochrB avenae)幼蟲有效。芽孢桿菌屬切―sp.)的細菌能夠產生多種抗菌物質，包括脂肽類、肽類、磷脂類、類噬菌體顆粒和細菌素等，具有抗細菌、真菌、病毒和支原體的功能。而且，芽孢桿菌易于繁殖，適應環境能力強；絕大多數芽孢桿菌對人畜無毒，具有很強的環境適應性和環境友好性，因而在生物防治中起著重要的作用，具有很大的開發利用價值。相關研究表明簡單芽孢桿菌有促生和生防作用，其對于大白菜軟腐病的防治率高達到83%，同時增加大白菜產量50%，而簡單芽孢桿菌對大豆胞囊線蟲病的防治還尚未有報道。針對生產上存在這一問題，通過系統篩選獲得一株細菌，利用該菌或該菌的代謝產物處理大豆種子，可誘導大豆在種子萌發和生長期間產生對大豆胞囊線蟲的抗性，從而解決了大豆胞囊線蟲病的問題。

發明內容
本發明的目的是選擇一株菌株對大豆種子處理后可以誘導苗期大豆對胞囊線蟲產生明顯的抗性，將菌株按常規液體發酵培養后，可以用該菌的代謝產物，開發出處理大豆種子的種子處理劑，經過處理的大豆種子可以誘導大豆產生對大豆胞囊線蟲的抗性。本發明篩選獲得的一株細菌菌株是簡單芽孢桿菌(feci77m simplex) Sneb545,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址北京市朝陽區北辰西路I號中國科學院微生物研究所；保藏日期2012年10月11日；保藏登記入冊的編號CGMCC No. 6650。簡單芽孢桿菌{Bacillus 耶7α) Sneb545是從中國遼寧省沈陽市沈陽農業大學試驗田中篩選出的一株對大豆具有強誘導活性的細菌菌株。本發明通過研究發現，土壤細菌有很多株細菌都具有一定的誘導大豆抗胞囊線蟲的能力，從這些細菌中篩選出一株性狀相對較好的菌株——簡單芽孢桿菌{Bacillussimplex ) Sneb545進行了進一步的研究。本發明還涉及用于誘導大豆產生抗胞囊線蟲抗性的細菌代謝物，其是由本發明的細菌菌株簡單芽孢桿菌{Bacillus si耶/^r)Sneb545經過常規的液體發酵培養后獲得。本發明的細菌菌株簡單芽孢桿菌(Bacillus是通過培養皿培養后，再經擴大發酵培養來制備，其具體方法如下
I.培養皿培養
培養基配方為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基(NA):牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，蔗糖10g，瓊脂 17-20g，蒸餾水 1000mL。2.液體發酵培養
其中液體發酵培養基配方為以重量百分比計，酵母浸膏0. 1%-0. 2%、蛋白胨
0.5%-0. 6%、牛肉浸膏0. 3%-0. 4%、蔗糖1%_2%，余下為蒸餾水，pH為6. 8-7. O。將菌種接種到250mL三角瓶(每瓶裝IOOmL)液體培養基中，25°C 28°C下，搖床轉速以 150r · mirf1 180r · mirf1、發酵 2_3d,優選 3d。液體發酵的菌種可以通過大型發酵罐進行規模生產，其產品為發酵液或發酵液的制成品。本發明還涉及一種大豆種子處理劑，其包含有效量的本發明所述的簡單芽孢桿菌{Bacillus simplex) Sneb545本身或其代謝物作為有效活性成分。本發明的簡單芽孢桿菌(Bacillus或其代謝物具有對大豆的誘導活性，可用于大豆的種子處理，處理后的大豆對大豆胞囊線蟲的胞囊形成具有很好的抑制作用，解決了大豆胞囊線蟲病的難題。
具體實施例方式 為了更詳細地進一步闡明而不是為了限制本發明，給出了下列實施例。實施例I :簡單芽抱桿菌{Bacillus simplex) Sneb545的培養
首先對簡單芽孢桿菌咖Cillus W耶/^r)Sneb545菌株進行發酵培養，然后對發酵培養后的代謝產物進行大豆誘導活性試驗，確定其對大豆的誘導作用。將簡單芽孢桿菌、BacillusSneb545的菌體接種到培養基上,培養基配方為牛肉膏蛋白胨培養基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，蔗糖10g，瓊脂17-20g，加蒸餾水至 1000mL，25°C培養 2d。再將菌種接種到250mL三角瓶海瓶裝IOOmL)液體培養基中，培養基配方為以重量百分比計，酵母浸膏0. 1%-0. 2%、蛋白胨0. 5%-0. 6%、牛肉浸膏0. 3%-0. 4%、蔗糖1%_2%，余下為蒸懼水，pH為6. 8-7. O,發酵溫度為25_28°C,搖床轉速150r · mirT1 180r · mirT1、發酵時間2-3d。形成的發酵液或發酵液的制成品可以直接或間接處理大豆種子。被處理的大豆種子可以減輕由于大豆胞囊線蟲病害所造成的危害。實施例2 :簡單芽抱桿菌(Bacillus simplex、Sneb545的發酵基本同實施例1，不同之處是將液體培養的菌種接種到IOOOL的發酵罐進行發酵，在25°C下培養，pH為7.0，發酵3d。實施例3 :簡單芽孢桿菌{BacillusSneb545誘導大豆系統抗性的驗證利用裂根試驗設計(split-root system)探討了菌株Sneb545對大豆胞囊線蟲的
誘導系統抗性。裂根試驗中的挑戰根系和應答根系彼此在空間上完全隔離，應答根系中的Sneb545發酵液與大豆胞囊線蟲沒有直接接觸，菌株對線蟲的控制作用完全依賴于其對植株的誘導抗性。該測定方法可靠，已被廣泛應用于生防微生物對土傳病害的系統誘導抗性研究。I.制備試驗用制劑
按前述液體發酵培養方法制備簡單芽孢桿菌菌株Sneb545的發酵液，待備用。 2.制備試驗用線蟲
大豆胞囊線蟲(/feieroofera glycines):大豆胞囊線蟲3號生理小種取自沈陽農業大學北方線蟲研究所試驗基地。采用改良淘洗-過篩法從采取的土樣中分離胞囊，在體視鏡下挑取新鮮、飽滿、成熟、均一的胞囊。胞囊先用O. 5%次氯酸鈉溶液消毒3min，再用無菌水沖洗5次，放在含有少量無菌水的培養皿里，25 °C恒溫箱中培養，淺盤孵化15天后得到2齡幼蟲，將2齡幼蟲懸浮液調節到200頭/ml。3.制備試驗用種子
遼豆15 :由遼寧省農業科學院提供。4.種子處理方法
將大豆種子先用5%次氯酸鈉溶液表面消毒5min，再用無菌水沖洗5次。5試驗方法
采用溫室盆栽處理，取無大豆胞囊線蟲的土和沙，在干熱滅菌鍋中165°C，2h滅菌，然后以V(土)V (沙)為2 :1的比例混勻裝入16X 16cm塑料缽中。每缽中播種3粒遼豆15種子，待豆苗長至兩片子葉時，每缽留I株。將豆苗取出并洗凈，根系分為均等的兩部分。取3個同樣大小的塑料缽，成“品”字形放置，底部的塑料缽分別放于2個16cm直徑的盤托中。在頂部的塑料缽底部開2條IcmX 2cm，幼苗置于頂部的塑料缽中，使分開的根系分別通過2個裂縫到達下部的兩個塑料缽的土壤中，在底部兩個塑料缽中生長的根系分別為挑戰根系和應答根系，3個缽中裝入土壤基質固定植株。系統置于溫室(25°C、14h光照)，在挑戰根系的塑料缽中2cm表土以下接種Sneb545發酵液IOml,接種Sneb545發酵液I周后接種IOmlJ2懸浮液到應答根系。以無菌水為對照，共2個處理，3次重復。35d后調查應答根系缽中的土中的胞囊量和根內的大豆胞囊線蟲總數。5. I 土壤中胞囊的分離與計數每個土樣稱取200cc(即用IOOOmL燒杯盛水800mL，加土至IOOOmL)，采用淘洗一過篩一貝曼漏斗法收集胞囊，在體視解剖鏡下記錄胞囊
的數量。5. 2根內線蟲的染色與計數將根系用流水清洗干凈，稱根鮮重，然后用次氯酸鈉一酸性品紅染色法進行根內線蟲的染色，在體視顯微鏡下觀察記錄根內線蟲數量，并折成每克根鮮重線蟲的數量。5.3防治效果計算
胞囊抑制率 (％ )=
權利要求
1.一株處理大豆種子后具有誘導大豆抗大豆胞囊線蟲的細菌菌株，其特征在于該菌株為簡單芽孢桿菌Qiacillus已于2012年10月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 6650。
2.權利要求I所述的細菌菌株的液體發酵方法，其特征在于液體發酵培養基配方為以重量百分比計，酵母浸膏O. 1%-0. 2%、蛋白胨O. 5%-0. 6%、牛肉浸膏O. 3%-0. 4%、蔗糖1%_2%，余下為蒸餾水，pH為6. 8-7. 0，發酵溫度為25-28°C，搖床轉速150r · mirT1 180r · min \發酵時間 2_3d。
3.根據權利要求2所述的液體發酵方法，其特征在于所述的發酵時間為3d。
4.具有誘導大豆產生抗大豆胞囊線蟲抗性的發酵液原液的制備方法，其特征在于是由權利要求I所述的細菌菌株經過液體發酵后形成的，液體發酵培養基配方為以重量百分比計，酵母浸膏O. 1%-0. 2%、蛋白胨O. 5%-0. 6%、牛肉浸膏O. 3%-0. 4%、蔗糖1%_2%，余下為蒸懼水，pH為6. 8-7. O,發酵溫度為25_28°C,搖床轉速150r · mirT1 180r · mirT1、發酵時間 2-3d。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的發酵時間為3d。
6.一種大豆種子處理劑，其特征在于，包含有效量的根據權利要求2所述的液體發酵方法中所形成的發酵液原液，用于誘導大豆產生對大豆胞囊線蟲的抗性。
7.權利要求2所述液體發酵方法中形成的發酵液原液在誘導大豆抗大豆胞囊線蟲中的應用。
全文摘要
本發明涉及一株處理大豆種子后具誘導大豆產生對大豆胞囊線蟲抗性的簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)Sneb545的培養方法及其應用，屬于微生物農藥技術領域。本發明涉及的細菌菌株Sneb545，已于2012年10月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.6650。將菌株按常規液體發酵培養后，可以用該菌的代謝產物，開發出處理大豆種子的種子處理劑，經過處理的大豆種子可以誘導大豆產生對大豆胞囊線蟲的抗性。本發明的簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)Sneb545代謝物處理大豆種子后可以誘導大豆對苗期第一代胞囊線蟲產生明顯的抗性，對大豆胞囊線蟲胞囊的形成有明顯的抑制作用，是很有潛力的生防菌，為防治大豆胞囊線蟲病開辟了新思路。
文檔編號C12R1/07GK102925387SQ20121041420
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月26日 優先權日2012年10月26日
發明者段玉璽, 陳立杰, 朱曉峰, 王媛媛, 項鵬 申請人:沈陽農業大學