一種膠原蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物活性物質(zhì)提取領(lǐng)域，采用魚鱗為原料，胃蛋白酶酶解后得到膠原蛋白粗品，通過HPLC優(yōu)化條件得到合適的流動相和柱分離條件，進(jìn)一步放大到工業(yè)制備級液相色譜分離系統(tǒng)，精制得到高純度的膠原蛋白。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是，粗品使用工業(yè)制備級液相色譜分離制備所需物質(zhì)，可達(dá)到較好的分離提純效果，所需溶劑成本低，操作簡單，周期短，效率高，純度可達(dá)99.5%以上。
【專利說明】一種膠原蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高純度膠原蛋白的工業(yè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原蛋白是結(jié)締組織中極其重要的一種結(jié)構(gòu)蛋白，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、營養(yǎng)保健品、生物肥料以及醫(yī)用材料等領(lǐng)域。它廣泛存在于動物的骨、腱、肌鞘、韌帶、肌膜、軟骨和皮膚中。魚鱗含有豐富的蛋白質(zhì)和鈣、磷等礦物質(zhì)，主要由蛋白質(zhì)和羥基磷灰石組成，其中蛋白質(zhì)占魚鱗總重的50%~70%，主要為膠原蛋白和角蛋白，可見魚鱗是非常好的膠原蛋白生產(chǎn)原料。目前國外對從海洋魚類魚鱗中提取膠原蛋白的工藝已較成熟，其膠原蛋白的提取率達(dá)到了 25%~55%，并已運(yùn)用于工業(yè)化生產(chǎn)。而國內(nèi)有關(guān)魚鱗中提取膠原蛋白的研究還處于起始階段，劉慶慧等對魚鱗中提取膠原蛋白進(jìn)行了初步的研究。而對淡水魚魚鱗膠原蛋白的研究，僅有Kimura，S.對鯉魚魚鱗的提取及肽鏈組成進(jìn)行了研究報道，且仍為采用傳統(tǒng)的乙酸作提取劑，提取率不高。尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于針對目前在制備膠原蛋白過程中所存在的工藝復(fù)雜以及純度不高的問題，提供一種制備高純度膠原蛋白的新方法。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
一種膠原蛋白的制備方法，采用魚鱗為原料，制備型高效液相色譜法制備高純度膠原蛋白，它包括以下步驟:
(1)將魚鱗洗凈后，在酸性條件下，用胃蛋白酶酶解24h，調(diào)至中性，凍干，得膠原蛋白粗·品;
(2)用甲醇溶解膠原蛋白粗品，采用HPLC優(yōu)化膠原蛋白的最佳分離洗脫條件，將其等比例放大，應(yīng)用在填充十八烷基反相硅膠填料的動態(tài)軸向壓縮柱上進(jìn)行分離，在線收集膠原蛋白對應(yīng)譜帶的餾分；
(3)將步驟(2)中收集的對應(yīng)譜帶洗脫液減壓干燥，即可得到色譜純?yōu)?9.5%的膠原蛋白。
[0005]本發(fā)明的有益效果是選用動態(tài)軸向壓縮柱來制備膠原蛋白，過程簡單、易控制，工藝技術(shù)簡化，生產(chǎn)成本低，適用于大規(guī)模制備。高效液相色譜測定中，總雜質(zhì)峰小于0.5%，單一雜質(zhì)峰不超過0.3%。此產(chǎn)品完全符合歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)。
【具體實(shí)施方式】
[0006]實(shí)施例1
1.將魚鱗洗凈后，在酸性條件下，用1%胃蛋白酶酶解(W/V)24h，調(diào)至中性，凍干，得膠原蛋白粗品；
2.將膠原蛋白粗品注入動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)，動態(tài)軸向壓縮柱尺寸為Φ50X 250mm，十八烷基反相硅膠填料粒徑為10 μ m，上樣量500mg，流動相流速為80ml/min。分離初期，流動相甲醇與水體積比范圍為30/70-85/15，洗脫60min后，流動相甲醇與水的體積比切換為95/5，洗脫至80min，使后端雜質(zhì)沖洗出來，一個分離周期結(jié)束。采用的紫外光度檢測器的檢測波長為230nm，收集保留時間在43飛Omin的餾分，經(jīng)HPLC分析純度≥ 99.6%。
[0007]實(shí)施例2
1.將魚鱗洗凈后，在酸性條件下，用1%胃蛋白酶酶解(W/V)24h，調(diào)至中性，凍干，得膠原蛋白粗品；
2.將膠原蛋白粗品注入動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)，動態(tài)軸向壓縮柱尺寸為Φ 50 X 250mm，十八烷基反相硅膠填料粒徑為10 μ m，上樣量lg，流動相流速為80ml/min。分離初期，流動相甲醇與水體積比范圍為30/70-85/15，洗脫60min后，流動相甲醇與水的體積比切換為95/5，洗脫至80min，使后端雜質(zhì)沖洗出來，一個分離周期結(jié)束。采用的紫外光度檢測器的檢測波長為230nm，收集保留時間在41.5^52min的餾分，經(jīng)HPLC分析純度≥ 99.5%。
[0008]實(shí)施例3
1.將魚鱗洗凈后，在酸性條件下，用1%胃蛋白酶酶解(W/V)24h，調(diào)至中性，凍干，得膠原蛋白粗品；
2.將膠原蛋白粗品注入動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)，動態(tài)軸向壓縮柱尺寸為Φ 50 X 250mm，十八烷基反相硅膠填料粒徑為10 μ m，上樣量2g，流動相流速為100ml/min。分離初期，流動相甲醇與水體積比范圍為40/60-90/10，洗脫60min后，流動相甲醇與水的體積比切換為95/5，洗脫至80min，使后端雜質(zhì)沖洗出來，一個分離周期結(jié)束。采用的紫外光度檢測器的檢測波長為230nm，收集保留時間在4(T58min的餾分，經(jīng)HPLC分析純度≥ 99.5%。
【權(quán)利要求】
1.一種膠原蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將魚鱗洗凈后，在酸性條件下，用胃蛋白酶酶解24h，調(diào)至中性，凍干，得膠原蛋白粗品; (2)將過濾后的膠原蛋白粗品通過進(jìn)樣泵或者進(jìn)樣閥注入動態(tài)軸向壓縮制備色譜系統(tǒng)； (3)采用甲醇和水做流動相，梯度洗脫，將色譜峰對應(yīng)的流出液進(jìn)行減壓干燥，即可得到高純度的膠原蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:所述步驟(2)中，在制備色譜系統(tǒng)中，采用動態(tài)軸向壓縮柱，規(guī)格為Φ50Χ250πιπ~Φ150Χ250πιπι，且所填充固定相為十八烷基反相硅膠填料，粒徑為10 μ m~45 μ m。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:所述步驟(3)中，梯度洗脫時，流動相甲醇與水的體積比(V/V)范圍為3:7~ 9:1。
【文檔編號】C12P21/06GK103789380SQ201210426852
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月31日
【發(fā)明者】居延娟, 張宇, 王冰冰 申請人:江蘇漢邦科技有限公司