專利名稱：細胞培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學和細胞生物學領域，尤其是包含哺乳動物rox1-陽性內胚層細胞的組合物及其產生、分離和使用此類細胞的方法。發明背景 人多能性干細胞(pluripotent stem cell),如胚胎干細胞(ES)和胚胎生殖細胞(EG)，于1994年首先從無成纖維細胞飼養層的培養物中分離(Bongso et al.，1994)，1997年從含成纖維細胞飼養層的培養物中分離(Hogan, 1997)。隨后Thomson、Reubinoff和Shamblott建立了采用有絲分裂失活的小鼠飼養層連續培養人ES和EG細胞的方法(Reubinoff et al., 2000;Shamblott et al., 1998;Thomson et al.，1998)。人ES和EG細胞(hESC)為研究人類早期發育和為治療性干預一些疾病狀態(如糖尿病和帕金森氏癥)提供了極難得的機會。例如，在采用細胞療法治療糖尿病的過程中，使用衍生自hSEC的產生胰島素的β細胞會比目前利用來自供者胰腺的細胞治療糖尿病有很大進步。但目前還不知道如何從hSEC得到產生胰島素的β細胞。因此，目前利用來自供者胰腺的胰島細胞治療糖尿病的細胞療法受限于缺乏移植所需的高質量胰島細胞。對單一I型糖尿病人的細胞治療需要移植大約8 X IO8胰島細胞(Shapiro et al., 2000; Shapiroet al., 2001a; Shapiro et al.，2001b)。一次成功移植所需的胰島細胞至少需要兩個健康供者的器官提供。而人胚胎干細胞為開發用于人類細胞治療的大量的高質量分化細胞提供了起始材料的來源。多能性和能夠維持hSEC細胞較長時間培養這兩個性質使其特別適合用于細胞治療。多能性是指hESC能夠分化為所有3種主要胚層(內胚層，中胚層和外胚層)的衍生物，進而在除胚胎外組織(如胎盤)和生殖細胞外還形成成熟器官的所有體細胞類型的能力。盡管多能性賦予了 hSEC特殊的用途，但這個性質也給這些細胞及其衍生物的研究和控制帶來挑戰。由于在分化hSEC培養基中會產生大量細胞類型，所以大部分細胞類型產生效率很低。而且，成功評價任一指定細胞類型的產生關鍵取決于定義合適的標志物。高效、定向的分化對hESCs的治療應用非常重要。解決上述問題對利用hSEC作為起始材料產生用于細胞治療的細胞非常有利。例如，為獲得胰島細胞移植治療所需的細胞材料的水平，有利的是在分化的最早期高效地使hESC定向為胰島/β細胞系。除了分化過程的高效定向，另外還有利的是在向胰島/β細胞系分化過程中分離和鑒定中間細胞類型，并利用這些細胞作為進一步分化的合適的前體細胞系。
發明概要本發明的實施方案涉及包含表達roXUPDX1-陽性)的內胚層細胞的組合物及產生該組合物的方法。其他實施方案涉及富含rox1-陽性內胚層細胞的細胞群以及產生該細胞群的方法。其它實施方案涉及增強內胚層細胞roxi的表達以及鑒別用于進一步分化PDXi陰性和/或rox1-陽性內胚層的因子的方法。在貫串本申請描述的組合物和方法的一些實施方案中，PDXl-陽性內胚層細胞是PDXl-陽性前腸/中腸內胚層細胞。在貫串本申請描述的組合物和方法的一些優選實施方案中，rox1-陽性內胚層細胞是rox1-陽性前腸內胚層細胞。在其他優選實施方案中，PDX1-陽性內胚層細胞是前腸末端的rox1-陽性內胚層細胞。本發明的一些實施方案涉及包含rox1-陽性前腸內胚層細胞的細胞培養物，其中PDXl-陽性前腸內胚層細胞是專能細胞(multipotent cell)，可以分化為衍生自腸管前部的細胞、組織或器官。在一些實施方案中，所述細胞培養物包含人細胞。在此人細胞培養物中，PDXl-陽性前腸內胚層細胞包含占培養物中人細胞的至少約2%、至少約5%、至少約10%或至少約25%。在一些實施方案中，計算所述至少約2%、至少約5%、至少約10%或至少約25%時沒有考慮所述培養物中的飼養細胞。在此處描述的一些細胞培養物的實施方案中，PDXl-陽性前腸內胚層細胞可表達選自同源框A13(H0XA13)基因、同源框C6 (H0XC6)基因和S0X17的標志物。在其他實施方案中，包含rox1-陽性前腸內胚層細胞的細胞培養物基本上不含內臟內胚層細胞、體壁內胚層細胞和/或神經細胞。在一些實施方案中，細胞培養物還包含以下物質的一種或幾種:類視黃醇化合物，如視黃酸(RA)，FGF-10或B27。本發明其他實施方案涉及富集的、分離的或基本上純的rox1-陽性前腸內胚層細胞群，其中rox1-陽性前腸內胚層細胞是專能細胞，可以分化為衍生自腸管前部的細胞、組織或器官。在一些實施方案中，PDXl-陽性前腸內胚層細胞衍生自多能性細胞，如人胚胎干細胞。本發明的其他實施方案涉及包含細胞的細胞群，其中至少約90%的細胞是rox1-陽性前腸內胚層細胞，其中rox1-陽性前腸內胚層細胞是專能細胞，可以分化為衍生自腸管前部的細胞、組織或器官。在優選實施方案中，細胞群中至少約95%的細胞是rox1-陽性前腸內胚層細胞。更優選的實施方案中，rox1-陽性前腸內胚層細胞在細胞群中的比例為至少約98%。本發明其它的實施方案涉及產生rox1-陽性前腸內胚層細胞的方法，此方法通過為包含基本上不表達roxi的定形內胚層細胞(PDX1-陰性定形內胚層細胞)的細胞培養物或細胞群提供前腸分化因子( 例如類視黃醇)來進行。類視黃醇(例如視黃酸)可以約0.01至50 μ M的濃度添加。在一些實施方案中，通過為細胞培養物或細胞群提供FGF-10和/或Β27增加rox1-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性細胞的分化。FGF-10可以約5ng/ml至約1000ng/ml的濃度添加。在一些實施方案中，B27以約0.1%至約20%的濃度添加到細胞培養物或細胞群中。FGF-10和/或B27可以與類視黃醇大致同時加到細胞培養物或細胞群中，或者每種因子也可以間隔幾小時分別添加。在一些實施方案中，類視黃醇添加至大約培養4天的rox1-陰性定形內胚層細胞培養物中。在一些實施方案中，類視黃醇添加至大約培養5天的rox1-陰性定形內胚層細胞培養物中。其它實施方案還涉及利用前腸分化因子進一步促進細胞培養物或細胞群中PDXl-陽性前腸內胚層細胞產生的方法，所述細胞培養物或細胞群已經與類視黃醇(如視黃酸)接觸。在這些實施方案中，為所述細胞培養物或細胞群提供活化素A和/或活化素B可促進rox1-陰性定形內胚層向rox1-陽性前腸內胚層的分化。活化素A和/或活化素B可以5ng/ml至1000ng/ml的濃度提供。其他實施方案涉及增加細胞培養物或細胞群中PDX1-陽性前腸內胚層細胞產生的方法，其通過在含有類視黃醇的培養基中分化roxi陰性細胞來進行，其中所述培養基之前被某些細胞類型的維持或生長條件化。這些細胞類型包括但不限于胚胎干細胞或其他多能性細胞，這些細胞已在含血清或生長因子TGFii超家族成員(如活化素A、活化素B、Nodal和/或骨形態發生蛋白BMP)的培養基中分化。在一些實施方案中，條件培養基以全部培養基的約1%至約100%添加到細胞培養物或細胞群中。TGF^超家族生長因子和/或條件培養基可以和類視黃醇大致同時添加到細胞培養物或細胞群中，或者每種因子也可以幾小時的間隔分別添加。本發明的實施方案涉及產生富含rox1-陽性前腸內胚層細胞的細胞群的方法。在一些實施方案中，這些方法包括獲得多能性細胞群的步驟，其中多能性細胞群中至少一個細胞包含至少一個受roxi啟動子控制的核酸拷貝。在一些實施方案中，所述核酸包含編碼綠色熒光蛋白或其生物學活性片段的序列。在其它實施方案中，該方法另外的步驟包括使所述多能性細胞分化以便產生rox1-陽性前腸內胚層細胞，以及使rox1-陽性細胞與roxi陰性細胞分離，其中該rox1-陽性前腸內胚層細胞是專能細胞，可以分化為衍生自腸管前部的細胞、組織或器官。此處所述方法的一些實施方案中，分化步驟還包括為所述多能性細胞群提供至少一種TGFP超家族的生長因子，其量足以促進所述多能性細胞向rox1-陰性定形內胚層細胞的分化，以及為該rox1-陰性定形內胚層細胞提供前腸分化因子，其量足以促進該rox1-陰性定形內胚層細胞向前腸的rox1-陽性內胚層細胞分化。本發明的一些實施方案涉及促進表達S0X-17(S0X_17陽性)的定形內胚層細胞中PDXi基因產物表達的方法， 其通過使這些細胞與足以促進roxi基因產物表達的量的分化因子接觸。在一些實施方案中，所述分化因子選自RA、FGF-10和B27。本發明的其它實施方案涉及鑒定能夠促進rox1-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞分化的分化因子的方法。在這些方法中，使rox1-陰性定形內胚層細胞與候選分化因子接觸，并確定與在與候選分化因子接觸前細胞群中roxi的表達相比，在與候選分化因子接觸后細胞群中roxi的表達是否增加。細胞群中roxi表達的增加表明候選分化因子能夠促進rox1-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞的分化。在一些實施方案中，PDXl的表達由定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)確定。上述方法的一些實施方案還包括確定在與候選分化因子接觸前后細胞群中H0XA13和/或H0XC6基因的表達。在一些實施方案中，候選分化因子是小分子，例如類視黃醇，如視黃酸。其它實施方案中，候選分化因子是多肽，例如生長因子，如FGF-10。本發明的其它實施方案涉及鑒定能夠促進rox1-陽性前腸內胚層細胞分化的分化因子。在這些方法中，在使rox1-陽性前腸內胚層細胞與候選分化因子接觸，并確定與在與候選分化因子接觸前細胞群中標志物的表達相比，在與候選分化因子接觸后細胞群中標志物的表達是增加還是降低。標志物表達的增加或降低表明候選分化因子能夠促進PDXl-陽性前腸內胚層細胞的分化。在一些實施方案中，標志物表達通過Q-PCR檢測。在一些實施方案中，候選分化因子是小分子，例如類視黃醇，如視黃酸。其它實施方案中，候選分化因子是多肽，例如生長因子，如FGF-10。一些權限中，術語“包含”可能不具有任何通常所接受的定義。此處使用的術語“包含”是開放式的，可以包括任何其他元素?？紤]到這一點，本發明的其他實施方案參考以下編號的段落進行描述:1.包含人細胞的細胞培養物，其中至少約2%的所述人細胞是胰-十二指腸同源框因子-1(PDXi)陽性前腸內胚層細胞，所述rox1-陽性前腸內胚層細胞是能夠分化為衍生自腸管前部的細胞、組織或器官的專能細胞。2.段落I的細胞培養物，其中至少約5%的所述人細胞是rox1-陽性前腸內胚層細胞。3.段落I的細胞培養物，其中至少約10%的所述人細胞是rox1-陽性前腸內胚層細胞。4.段落I的細胞培養物，其中至少約25%的所述人細胞是roXl-陽性前腸內胚層細胞。5.段落I的細胞培養物，其中在所述培養物中存在人飼養細胞，其中除了所述人飼養細胞以外，至少約2%的人細胞是rox1-陽性前腸內胚層細胞。

6.段落I的細胞培養物，其中所述rox1-陽性前腸內胚層細胞表達同源框A13(H0XA13)基因。7.段落I的細胞培養物，其中所述rox1-陽性前腸內胚層細胞表達同源框C6 (H0XC6)基因。8.段落I的細胞培養物，其中所述rox1-陽性前腸內胚層細胞表達S0X17。9.段落I的細胞培養物，其中在所述rox1-陽性前腸內胚層細胞中roxi的表達高于選自α-胎蛋白(AFP)、S0X7、SOXl、ZICl和NFM的標志物的表達。10.段落I的細胞培養物，其中所述細胞培養物基本上不含選自內臟內胚層細胞、體壁內胚層細胞和神經細胞的細胞。11.段落I的細胞培養物，其中所述細胞培養物中約每 ο個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約一個rox1-陽性前腸內胚層細胞。12.段落I的細胞培養物，其中所述細胞培養物中約每5個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約一個rox1-陽性前腸內胚層細胞。13.段落I的細胞培養物，其中所述細胞培養物中約每4個roXl-陰性定形內胚層細胞對應至少約一個rox1-陽性前腸內胚層細胞。14.段落I的細胞培養物，還包含胚胎干細胞。15.段落14的細胞培養物，其中所述胚胎干細胞衍生自選自桑椹胚、胚胎內細胞團(ICM)和胚胎生殖嵴的組織。16.段落I的細胞培養物，還包含類視黃醇。17.段落16的細胞培養物，其中所述類視黃醇是視黃酸(RA)。18.段落I的細胞培養物，還包含FGF-10。
19.段落I的細胞培養物，還包含B27。20.段落I的細胞培養物，還包含RA和FGF-10。21.段落20的細胞培養物，還包含B27。22.包含細胞的細胞群，其中至少約90%的所述細胞是人roXl-陽性前腸內胚層細胞，所述rox1-陽性前腸內胚層細胞是能夠分化為衍生自腸管前部的細胞、組織或器官的專能細胞。23.段落22的細胞群，其中至少約95%的所述細胞是TOXl-陽性前腸內胚層細胞。24.段落22的細胞群，其中至少約98%的所述細胞是TOXl-陽性前腸內胚層細胞。25.段落22的細胞群，其中所述TOXl-陽性前腸內胚層細胞表達H0XA13基因。26.段落22的細胞群，其中所述TOXl-陽性前腸內胚層細胞表達H0XC6基因。27.段落22的細胞群，其中所述PDXl-陽性前腸內胚層細胞表達S0X17。28.段落22的細胞群，其中在所述rox1-陽性前腸內胚層細胞中roxi的表達高于選自AFP、S0X7、SOXl、ZICl和NFM的標志物的表達。29.產生TOXl-陽性前腸內胚層細胞的方法，所述方法包含以下步驟:獲得包含PDX1-陰性定形內胚層細胞的細胞群；為所述細胞群提供足以促進至少部分所述rox1-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞分化的量的類視黃醇，其中所述rox1-陽性前腸內胚層細胞是能夠分化為衍生自腸管前部的細胞、組織或器官的專能細胞。30.段落29的方法，還包括給予足夠時間供roXl-陽性前腸內胚層細胞形成的步驟，其中所述供rox1-陽性前腸內胚層細胞形成的足夠時間通過檢測所述細胞群中PDXl-陽性前腸內胚層細胞的存在來確定。31.段落29的方法，其中至少約2%的所述I3DXl-陰性定形內胚層細胞分化為PDXl-陽性前腸內胚層細胞。32.段落29的方法，其中至少約5%的所述I3DXl-陰性定形內胚層細胞分化為PDXl-陽性前腸內胚層細胞。33.段落29的方法，其中至少約10%的所述I3DXl-陰性定形內胚層細胞分化為PDXl-陽性前腸內胚層細胞。34.段落29的方法，其中至少約25%的所述I3DXl-陰性定形內胚層細胞分化為PDXl-陽性前腸內胚層細胞。35.段落29的方法，其中在所述細胞群中檢測TOXl-陽性前腸內胚層細胞的存在包括檢測roxi的表達。36.段落35的方法，其中在所述rox1-陽性前腸內胚層細胞中roxi的表達高于選自α-胎蛋白(AFP)、S0X7、SOXl、ZICl和NFM的標志物的表達。37.段落35的方法，其中所述I3DXl的表達通過定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)來測定。38.段落35的方法，其中所述I3DXl的表達通過免疫細胞化學來測定。39.段落29的方 法，其中所述類視黃醇是RA。40.段落39的方法，其中RA以約0.01 μ M至約50 μ M的濃度范圍提供。41.段落39的方法，其中RA以約0.04 μ M至約20 μ M的濃度范圍提供。42.段落39的方法，其中RA以約0.1 μΜ至約10 μΜ的濃度范圍提供。
43.段落39的方法，其中RA以約0.2 μ M至約2.5 μ M的濃度范圍提供。44.段落39的方法，其中RA以是約0.5 μ M至約1.5 μ M的濃度范圍提供。45.段落39的方法，其中RA以約I μ M的濃度提供。46.段落39的方法，其中RA在所述培養進行約4天時提供。47.段落29的方法，還包括向所述培養物中提供足以增強TOXl-陽性前腸內胚層細胞的產生的量的因子，所述因子選自FGF-10、FGF-4、活化素Α、活化素Β、Β27、條件培養基和所述因子的組合。48.段落47的方法，其中所述因子選自FGF-10、FGF-4、活化素A和活化素B。49.段落48的方法，其中所述因子以約10ng/ml至約500ng/ml的濃度范圍提供。50. 段落48的方法，其中所述因子以約20ng/ml至約200ng/ml的濃度范圍提供。51.段落48的方法，其中所述因子以約25ng/ml至約75ng/ml的濃度范圍提供。52.段落48的方法，其中所述因子約50ng/ml的濃度提供。53.段落48的方法，其中所述因子與所述類視黃醇大致同時提供。54.段落47的方法，其中所述因子是B27。55.段落54的方法，其中B27以全部培養基的約0.1%至約20%的濃度范圍提供。56.段落54的方法，其中B27以全部培養基的約0.2%至約5%的濃度范圍提供。57.段落54的方法，其中B27以全部培養基的約0.5%至約2%的濃度范圍提供。58.段落54的方法，其中B27以全部培養基的約1%的濃度提供。59.段落54的方法，其中B27與所述類視黃醇大致同時提供。60.段落47的方法，其中所述因子是條件培養基。61.段落60的方法，其中條件培養基以全部培養基的約10%至約100%的濃度范圍提供。62.段落60的方法，其中條件培養基以全部培養基的約20%至約80%的濃度范圍提供。63.段落60的方法，其中條件培養基以全部培養基的約40%至約60%的濃度范圍提供。64.段落60的方法，其中條件培養基以全部培養基的約50%的濃度提供。65.段落60的方法，其中條件培養基與所述類視黃醇大致同時提供。66.段落60的方法，其中條件培養基通過使分化的人胚胎干細胞(hESC)與細胞培養基接觸約24小時來制備。67.段落66的方法，其中所述hESC在選自補加3%血清的RPM1、補加活化素A的低血清RPMI和補加BMP4的低血清RPMI的培養基中分化約5天。68.段落29的方法產生的I3DXl-陽性前腸內胚層細胞。69.產生富集roXl-陽性前腸內胚層細胞的細胞群的方法，所述方法包括以下步驟:獲得多能性細胞群，其中所述多能性細胞群中至少一個細胞包含至少一個拷貝的受roxi啟動子控制的核酸，所述核酸包含編碼綠色熒光蛋白(GFP)或其生物學活性片段的序列；分化所述多能性細胞以便產生rox1-陽性前腸內胚層細胞，所述rox1-陽性前腸內胚層細胞是能夠分化為衍生自腸管前部的細胞、組織或器官的專能細胞；以及使所述rox1-陽性前腸內胚層細胞與rox1-陰性細胞分離。
70.段落69的方法，其中所述富集的細胞群包含至少約95%的TOXl-陽性前腸內胚層細胞。71.段落69的方法，其中所述富集的細胞群包含至少約98%的TOXl-陽性前腸內胚層細胞。72.段落69的方法，其中所述分化步驟還包括為所述多能性細胞群中提供足以促進所述多能性細胞向rox1-陰性定形內胚層細胞分化的量的至少一種TGFii超家族的生長因子，以及為所述rox1-陰性定形內胚層細胞提供足以促進所述rox1-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞分化的量的類視黃醇。73.段落72的方法，其中所述類視黃醇是RA。74.段落69的方法產生的TOXl-陽性前腸內胚層細胞的富集群。75.在表達S0X17的定形內胚層細胞中增加I3DXl基因產物的表達的方法，所述方法包括使所述定形內胚層細胞與足以增加所述roxi基因產物表達的量的分化因子接觸。76.段落75的方法 ，其中所述分化因子是類視黃醇。77.段落76的方法，其中所述分化因子是RA。78.段落75的方法，其中所述分化因子選自FGF-10、FGF-4、活化素A、活化素B、B27、條件培養基和所述因子的組合。79.鑒定能夠促進rox1-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞分化的分化因子的方法，所述方法包括以下步驟:獲得包含rox1-陰性定形內胚層細胞的群；使所述包含rox1-陰性定形內胚層細胞的群與候選分化因子接觸；以及與在與所述候選分化因子接觸之前所述細胞群中roxi的表達比較，確定在與所述候選分化因子接觸之后所述細胞群中roxi的表達是否增加，其中在所述細胞群中所述roxi表達的增加表明所述候選分化因子能夠促進所述rox1-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞分化，所述rox1-陽性前腸內胚層細胞是能夠分化為衍生自腸管前部的細胞、組織或器官的專能細胞。80.段落79的方法，其中所述I3DXl表達通過Q-PCR檢測。81.段落79的方法，還包括在與所述候選分化因子接觸前后測定所述細胞群中HOXA13基因的表達的步驟。82.段落79的方法還包含在添加所述候選分化因子前后檢測所述細胞群中H0XC6基因的表達的方法。83.段落79的方法，其中所述候選分化因子是小分子。84.段落83的方法，其中所述小分子是類視黃醇。85.段落84的方法，其中所述類視黃醇是RA。86.段落79的方法，其中所述候選分化因子是多肽。87.段落79的方法，其中所述候選分化因子是生長因子。88.段落79的方法，其中所述候選分化因子是FGF-10。89.鑒定能夠促進rox1-陽性前腸內胚層細胞分化的分化因子的方法，所述方法包括以下步驟:獲得包含rox1-陽性前腸內胚層細胞的群；使所述包含rox1-陽性前腸內胚層細胞的群與候選分化因子接觸；以及與在與所述候選分化因子接觸之前所述細胞群中標志物的表達比較，確定在于所述候選分化因子接觸之后所述細胞群中相同標志物的表達是增加還是降低，其中在所述細胞群中所述標志物表達的增加或降低表明所述候選分化因子能夠促進rox1-陽性前腸內胚層細胞的分化。90.段落81的方法，其中所述標志物表達通過Q-PCR測定。91.段落81的方法，其中所述候選分化因子是小分子。92.段落81的方法，其中所述候選分化因子是多肽。93.段落81的方法，其中所述候選分化因子是生長因子。94.包含可操作地連接到roxi控制區的報告基因的載體。95.段落94的載體，其中所述報告基因是EGFP。96.段落94的載體的細胞。 97.包含可操作地連接到roxi控制區的報告基因的細胞。98.段落97的細胞， 其中所述可操作地連接到所述roXl控制區的報告基因整合入染色體。99.段落97的細胞，其中所述報告基因是EGFP。100.段落97的細胞，其中所述細胞是多能的。101.段落100的細胞，其中所述細胞是hESC。102.段落97的細胞，其中所述細胞是定形內胚層細胞。103.段落97的細胞，其中所述細胞是TOXl-陽性前腸內胚層細胞。104.通過以下步驟制備的條件培養基:使新鮮細胞培養基與分化的hESC群接觸約24小時，其中所述hESC已經在選自補加3%血清的RPM1、補加活化素A的低血清RPMI和補加BMP4的低血清RPMI的細胞培養基中分化約5天；以及從所述培養基中去除所述分化的hESC群。105.段落104的條件培養基，其中所述新鮮細胞培養基是RPMI。106.段落105的條件培養基，其中所述RPMI是低血清RPMI。107.條件化培養基的方法，所述方法包括以下步驟:使新鮮細胞培養基與分化的hESC群接觸約24小時，其中所述hESC已經在選自補加3%血清的RPM1、補加活化素A的低血清RPMI和補加BMP4的低血清RPMI的細胞培養基中分化約5天；以及從所述培養基中去除所述分化的hESC群。108.段落107的方法，其中所述新鮮細胞培養基是RPMI。109.段落108的條件培養基，其中所述RPMI是低血清RPMI。應了解上述的方法和組合物與體外培養的細胞有關。但是，上述體外分化的細胞組合物可用于體內用途。本發明的其他實施方案可參見以下專利申請:2003年12月23日提交的第60/532, 004號美國臨時專利申請，標題為“定形內胚層”；2004年4月27日提交的第60/566,293號美國臨時專利申請，標題為“表達roXl的內胚層”；2004年7月9日提交的第60/586，566號美國臨時專利申請，標題為“用于分離定形內胚層的趨化因子細胞表面受體”；2004年12月23日提交的第11/021，618號美國專利申請，標題為“定形內胚層”。


圖1是從hESC產生細胞的假想的分化途徑示意圖。途徑的第一步負責ES細胞至定形內胚層系，也代表向胰內胚層、內分泌內胚層或胰島/ β -細胞的進一步分化事件前的第一步。途徑的第二步顯示S0X17-陽性/PDXl-陰性的定形內胚層向rox1-陽性前腸內胚層的轉化。在介導這些轉化中起作用的因子用斜體字表示。定義靶細胞的相關標志物用下劃線表示。圖2是人S0X17cDNA的示意圖，顯示了保守區的位置并突出顯示了用于通過GEN0VAC的免疫步驟的區域。圖3是關系樹狀圖，顯示S0X17與S0X7關系最近，與S0X18關系稍遠。在同源物種中S0X17蛋白質比相同物種中的SOX群F亞族的其它成員的相關性強得多圖4是用兔抗S0X17抗體作探針的Western印跡,該印跡證明這個抗體對成纖維細胞(I道)中過表達的S0X17有特異性，而缺乏與EGFP (2道)或最接近的SOX家族成員S0X7(3道)的免疫反應性。圖5A-B是顯示大量AFP+共標記細胞的S0X17+細胞簇的顯微照片。這與其他S0X17+簇(B)形成顯著對比，因為在其他S0X17+簇中只能觀察到很少或者就根本沒有AFP+細胞。圖6A-C是顯示體壁內胚層和S0X17的顯微照片。圖A顯示隨機分化的hES細胞培養物中體壁內胚層細胞表面的人血栓調節蛋白(TM)的免疫細胞化學檢測。圖B顯示與圖A相同的區域，對TM和S0X17雙標記。圖C是用DAPI標記核的相同區域的相差圖。注意:DAPI標記的核和SOX17標記的完全對應。圖7A-B是顯示定量PCR(Q-PCR)檢測的S0X17基因表達和S0X17-特異性抗體檢測的抗S0X17陽性細胞的條形圖。圖A顯示相對于未分化的對照培養基(SR20)活化素A增加S0X17基因表達，而視黃酸(RA)強烈抑制S0X17表達。圖B顯示在S0X17+細胞數量上反映了相似的模式以及這些變化的相似倍數，表明Q-PCR檢測S0X17基因表達可以在單個細胞水平反映出變化。 圖8A是條形圖，顯示活化素A存在下正在分化的hESC培養物保持低水平的AFP基因表達，而在10%小牛血清(FBS)中隨機分化的細胞顯示AFP的強烈上調。表達水平的差異大約是7倍。圖8B-C是兩張顯微圖片，顯示活化素A對AFP表達的抑制在單個細胞水平也很顯著，因為相對于單用10%FBS (頂部)，在活化素A處理的條件(底部)下只能觀察到非常少和小的AFP+細胞簇。圖9A-B是顯示使用流式細胞儀定量的AFP+細胞數的對比圖片。這個圖證明在活化素A存在(左圖)或缺失(右圖)的條件下，AFP基因表達(圖8A)的改變倍數完全對應于AFP+細胞的數量，進一步支持了使用Q-PCR分析來指示單個細胞水平上發生的變化。圖10A-F是顯示使hESC暴露于nodal、活化素A和活化素B (NAA) 5天后SOX17+細胞數目顯著增加(A-C)的顯微圖片。通過比較每個區域S0X17+細胞占全部細胞數目(如DAPI染色的核(D-F)所示)的相對豐度，可以看出在用NAA處理5天后約30-50%的細胞對S0X17顯示免疫反應性。圖11是證明活化素A(0，10,30或100ng/ml)劑量依賴的增加正在分化的hESC中S0X17基因表達的條形圖。在粘附培養時處理3天后增加的表達已經很高，并一直持續到隨后懸浮培養的1、3和5天。
圖12A-C是證明活化素A對MIXLl (圖A)、GATA4 (圖B)和HNF3b (圖C)的表達的影響的條形圖。也觀察到活化素A劑量依賴的增加定形內胚層3種其他標志物:MIXL1、GATA4和HNF3b。與活化素劑量對應的表達增加的倍數與對S0X17所觀察到的非常相似，表明活化素A特異化共表達所有4種基因(S0X17+、MIXL1+、GATA4+和HNF3b + )的細胞群。圖13A-C是證明活化素A對AFP (圖A)、S0X7 (圖B)和SPARC (圖C)的表達的影響的條形圖。內臟內胚層標志物AFP的表達對活化素A顯示劑量依賴性的降低。原始內胚層標志物(S0X7)和體壁內胚層標志物(SPARC)保持不變或在一些時間點顯示抑制，表明活化素A不起特異化這些胚外內胚層細胞類型的作用。這進一步支持了以下事實:S0X17、MIXL1、GATA4和HNF3b表達的增加歸因于對應活化素A的定形內胚層細胞數目的增加。圖14A-B是顯示活化素A對ZICl (圖A)和Brachyury (圖B)的表達的影響的條形圖。神經標志物ZICl穩定的表達證明活化素A對神經分化沒有劑量依賴效應。Brachyury的表達降低顯示100ng/ml活化素A處理顯著抑制了中胚層分化。這可能是從中內胚層前體向定形內胚層特異化增加的結果。相對于未處理的對照培養物，低水平的活化素A(10和30ng/ml)處理在分化的較后期保持brachyury的表達。圖15A-B是顯示響應活化素處理的體壁內胚層分化降低的顯微圖片。在只有血清的條件下分化時，體壁內胚層Tmhi區域存在于所有培養物中㈧，而包含活化素A時，向TM +細胞的分化非常少，TM免疫反應性的總強度較低。圖16A-D是顯示響應活化素A和活化素B處理的標志物表達的顯微圖片。hESC用活化素A和活化素B連續處理4天，用S0X17、AFP和TM抗體三重標記。圖A-S0X17 ；圖B-AFP ;圖C-TM ;圖DPhase/DAPI。注意到許多S0X17陽性細胞伴隨著AFP⑶和TM(C)免疫反應性的完全缺失。圖17是顯示在體外從hESC出現定形內胚層和內臟內胚層的顯微圖片。通過AFPhi/S0X17W_鑒定內臟內胚層區域，而定形內胚層顯示完全相反的模式S0X17hi/AFPw_。因為這兩個區域互相靠近，所以選 擇了這個區域。但是，在從AFPhi細胞的任意區域的完全分離物中經常會觀察到S0X17hi/AFPw_區域，表明來自內臟內胚層的定形內胚層的單獨起源。圖18是描述TGFP家族的配體和受體的圖表。激活AR Smads和BR Smads的因子可以在從人胚胎干細胞產生定形內胚層的過程中起作用(參見J CellPhysiol.187:265-76)。圖19是顯示作為經單一或組合的TGF0因子處理結果的S0X17表達的誘導隨時間變化的條形圖。圖20是顯示作為經組合的TGF0因子處理結果的S0X17+細胞數目隨時間變化的條形圖。圖21是顯示作為經組合的TGFP因子處理結果的S0X17表達的誘導隨時間變化的條形圖。圖22是顯示活化素A劑量依賴性地誘導S0X17+細胞數目增加的條形圖。圖23是條形圖，顯示向活化素A和活化素B處理的培養物中添加Wnt3a促使SOX17的表達水平高于只用活化素A和活化素B誘導的表達水平。圖24A-C是顯示低FBS條件增強向定形內胚層分化的條形圖。在含2%FBS的培養基中用活化素A和活化素B處理(2AA)hESC，可導致S0X17的表達水平比在含10%FBS的培養基中經相同處理(IOAA)的SOX17的表達水平高2至3倍(圖A)。定形內胚層標志物MIXLl (圖B)的誘導也以相同方式受影響，在2%FBS中對AFP (內臟內胚層)的抑制比在10%FBS條件下更強(圖C)。圖25A-D是顯示培養物中S0X17 +細胞分裂的顯微圖片。S0X17免疫反應性細胞存在于hESC克隆的分化邊緣(C、D)，被增殖細胞核抗原(PCNA)標記(圖B)，但不被0CT4共標記(圖C)。此外，在S0X17+細胞(箭頭)以及0CT4+細胞，未分化的hESCs (箭頭頭部)中用DAPI標記核均可看到清晰的有絲分裂圖(D)。圖26是顯示在不同培養基條件下正在分化的hESC中CXCR4的相對表達水平的條形圖。圖27A-D是顯示一組定形內胚層標志物在如同圖26顯示的相同分化處理下如何與CXCR4共享非常相似的表達模式的條形圖。圖28A-E是條形圖，顯示中胚層標志物(BRACHYURY，MOXI)、外胚層標志物(S0X1，ZIC1)和內臟內胚層 標志物(S0X7)在如同圖26顯示的相同處理下如何表現出與CXCR4表達相反的關系。圖29A-F是顯示在圖26-28中展示的三種培養基條件下S0X17免疫反應性細胞的相對差異的顯微圖片。圖30A-C是流式細胞點圖，證明CXCR4+細胞數目隨添加至分化培養基的活化素A的濃度的增加而增加。圖31A-D是條形圖，顯示從高劑量活化素A處理(A100-CX+)分離的CXCR4+細胞比親代群(A100)進一步富集定形內胚層標志物。圖32是條形圖，顯示使用熒光激活細胞分選術(FACS)分離的CXCR4+和CXCR4—細胞的基因表達以及親代群中的基因表達。這證明CXCR4+細胞基本包含了每個親代細胞群中所有的CXCR4基因表達，CXCR4—細胞群包含很少或沒有CXCR4基因表達。圖33A-D是條形圖，證明從高劑量活化素A處理分離的CXCR4+細胞中中胚層(BRACHYURY，M0X1)、外胚層(S0X1，ZIC1)和內臟內胚層(S0X7)基因表達的缺失，這些非定形內胚層標志物的表達已經受到抑制。圖34A-M是顯示可用于鑒定定形內胚層細胞的標志物基因的表達模式的條形圖。圖G-L分別顯示了定形內胚層標志物FGF 17、VWF、CALCR、FOXQU CMKORl和CRIPl的表達分析。圖A-F分別顯示了前面描述的細胞系標記基因S0X17、S0X7、S0X17/S0X7、TM、ZICl和M0X1)的表達分析。圖M顯示了 CXCR4的表達分析。對于圖A-M的每一圖，標注hESC的列表示來自純化的人胚胎干細胞的基因表達；2NF表示細胞經過2%FBS處理，不添加活化素；0.1A100表示細胞經0.1%FBS和100ng/ml活化素A處理；1A100表示細胞經過1%FBS和100ng/ml活化素A處理；2A100表示細胞經過2%FBS和100ng/ml活化素A處理。圖35是顯示在含有或不含活化素的條件下培養4天和6天的hESC培養物中I3DXl基因相對表達的圖表，其中在第4天添加視黃酸(RA)和成纖維生長因子(FGF-1O)。圖36A-F是顯示在含有或不含活化素的條件下培養4天和6天的hESCs培養物中標志物基因相對表達的圖表，其中在第4天添加視黃酸(RA)和成纖維生長因子(FGF-1O)。各圖顯示了下列標志物基因表達的相對水平:(A) S0X17 ;(B)S0X7 ; (C)AFP ; (D)SOXl ； (E)ZICl ;和(F) NFM。
圖37A-C是顯示在含有或不含活化素的條件下培養4天和8天的hESC培養物中標志物基因相對表達的圖表，其中在第4天添加視黃酸(RA)、成纖維生長因子(FGF-10)和成纖維生長因子(FGF-4)的組合。各圖顯示了下列標志物基因表達的相對水平=(A)PDXl ；(B)S0X7 和(C) NFM。圖38A-G是顯示在與50ng/ml FGF-10接觸的定形內胚層細胞培養物中標志物基因的相對表達的圖表，其中在第4天添加I μ M、0.2μ M或0.04 μ M視黃酸(RA)與50ng/mlFGF-10聯合使用。各圖顯示了下列標志物基因表達的相對水平:(A)PDXl ； (B)H0XA3 ； (C)H0XC6 ； (D) HOXA13 ； (E) CDXl ； (F) SOXl 和(G) NFM。圖39A-E顯示在含有或不含活化素，存在視黃酸(RA)、成纖維細胞生長因子(FGF-10)和下列之中的一種:血清替代物(SR)，小牛血清(FBS)或B27構成的組合的條件下培養4天和8天的hESC培養物中標志物基因的相對表達。各欄顯示了下列標志物基因表達的相對水平:(A)PDXl ； (B) S0X7 ； (C)AFP ； (D)ZICl 和(E)NFM0 圖40A-B是顯示6天(剛好在添加RA之前)后和9天(暴露于RA3天后)時hESC培養物中胰(PDX1、HNF6)和肝(HNF6)的標志物基因的相對表達的圖表。包括了不同的條件的比較，在 25ng/ml (A25)或 50ng/ml (A50)的條件下添加了 10ng/ml (alO)、25ng/ml (a25)或50ng/ml(a50)的活化素B。不含任何活化素A和活化素B (NF)的條件作為產生定形內胚層和TOXl-陽性內胚層的陰性對照。各圖顯示了下列標志物基因表達的相對水平=(A)PDXl和(B)HNF6。圖41A-C 顯示在含有 100ng/ml (AlOO)、50ng/ml (A50)或不含(NF)活化素 A 的條件下培養5天(剛好在添加視黃酸之前)時和添加RA后2、4和6天(分別是第7、9和11天)的hESCs培養物中標志物基因的相對 表達。每個柱圖下直接標記的百分比表明分化3至5天期間的FBS劑量。從第7天開始，用RA處理(R)的細胞在包含0.5%FBS的RPMI培養基中生長。RA的濃度在第7天是2μΜ，第9天是ΙμΜ，第11天是0.2μΜ。各圖顯示了下列標志物基因表達的相對水平=(A)PDXl ; (B)ZICl和(C)S0X7。圖42Α-Β顯示首先在低FBS中用活化素A處理誘導定形內胚層(第5天)，然后用包含25ng/ml活化素A和RA或各種條件培養基(MEFCM、CM#2、CM#3和CM#4)和RA的新鮮(A25R)培養基誘導I3DXl-表達內胚層。在第5、6、7、8和9天檢測標志物表達。各圖顯示了下列標志物基因表達的相對水平=(A)PDXl和(B)CDX1。圖43顯示了首先在低FBS中用活化素A處理誘導定形內胚層，然后用新鮮培養基處理，該新鮮培養基在以新鮮培養基稀釋的條件培養基中包含活化素A和視黃酸(A25R)或者不同量的RA。培養基的總體積均是5ml。圖44是Western印跡，顯示F1DXl在添加RA和50ng/ml活化素A后3天(d8)和4天(d9)時RA-處理的定形內胚層細胞的免疫沉淀。圖45是一個概要圖表,顯不遺傳標記了在F1DXl啟動子控制下的EGFP報告基因的PDXl-陽性前腸內胚層細胞熒光激活細胞分選術(FACS)的結果。圖46為顯示分選的活細胞(Live)、EGFP-陰性細胞(Neg)和EGFP-陽性細胞(GFP+)的群在相對于管家基因校正后的相對roxi表達水平的圖表。圖47為顯示分選的活細胞(Live) >EGFP-陰性細胞(Neg)、一半帶有最低EGFP信號強度(Lo)的EGFP-陽性細胞群和一半帶有最高EGFP信號強度(Hi)的EGFP-陽性細胞群的群相對于管家基因校正后的相對roxi表達水平。圖48A-E顯示分選的活細胞(Live)、EGFP-陰性細胞(Neg)和EGFP-陽性細胞(GFP+)的群相對于管家基因校正后5種胰內胚層標志物的相對表達水平。各圖:A-NKX2.2 ;B-GLUT2 ；C-HNF3β ;D_KRT19 和 E-HNF4 α。圖49是顯示分選的活細胞(Live)、EGFP-陰性細胞(Neg)和EGFP-陽性細胞(GFP+)的群在相對管家基因校正后兩種非胰內胚層標志物的相對表達水平。各圖=A-ZICl和 B-GFAP。詳細描述稱為原腸胚形成的早期人發育中的重要階段發生于受精后2 3周。原腸胚形成非常重要，因為在這個階段三種主要胚層第一次特異化和組織化(Lu et al.,2001；Schoenwolf和Smith，2000)。外胚層負責身體外表和整個神經系統的最終形成，而中胚層衍生出心、血、骨、骨骼肌和其他結締組織。確定的內胚層被定義為負責整個腸管(包括食道、胃、小腸和大腸)以及腸管衍生的器官(如肺、肝、胸腺、甲狀旁腺、甲狀腺、膽囊和胰腺)形成的胚層(Grapin-Botton 和 Melton, 2000 ；Kimelman 和 Griffin, 2000 ；Tremblay etal.,2000 ;Wells和Melton，1999 ;Wells和Melton，2000))。定形內胚層與稱為原始內胚層的完全分離細胞系有重要區別。原始內胚層主要負責胚外組織的形成，主要是胎盤卵黃囊的腔壁和內臟內胚層部分和Reichert’ s膜的胞外基質物質。在原腸胚形成期，定形內胚層形成過程起始于細胞遷移，其中中內胚層細胞(有形成中胚層或內胚層能力的細胞)遷移穿過稱為原條的結構。定形內胚層衍生自一些遷移穿過原條前部及節(在原條最前部區域的特化結構)的細胞。當遷移發生時，定形內胚層首先集中于最前部腸管，隨后以腸管后端的形成而終止。發育討稈中PDXl某閔表汰PDXl (也稱為 S TF-1、IDX-1 和 IPF-1)是胰和喙十二指腸(rostral duodenum)發育必需的轉錄因子。PDXl首先在胰內胚層表達，胰內胚層來自后部前腸內胚層，產生外分泌和內分泌細胞，在小鼠中開始于ES.5。其后，roxi限定于β-細胞和一些δ-細胞。這種表達模式在成年后也保持。發育早期roxi也在鄰近形成中的胰的十二指腸內胚層表達，然后在十二指腸的腸細胞和腸內分泌細胞、胃竇及膽總管、膽囊和膽管中表達。在胰表達受限時，這個表達區域主要限于喙十二指腸。
_6] PDXl陽性細胞和與其相關的步驟本發明的實施方案涉及產生rox1-陽性內胚層細胞的新的確定明方法，其中PDXl-陽性內胚層細胞是專能細胞，能夠分化為衍生自腸管的前腸/中腸區域(PDX1-陽性前腸/中腸內胚層)的細胞、組織或器官。此處使用的“專能”或“專能細胞”涉及這樣的細胞類型，其可產生有限數量的其他細胞類型。此處使用的“前腸/中腸”指腸管前部及中部細胞，包括前腸/中腸連接部的細胞。本發明一些優選的實施方案涉及產生rox1-陽性前腸內胚層細胞的方法。在一些實施方案中，這些roxi陽性內胚層細胞是專能細胞，能夠分化為衍生自腸管前部(PDX1-陽性前腸內胚層)的細胞、組織或器官。其他優選的實施方案涉及產生腸管后部的rox1-陽性內胚層細胞的方法。在一些實施方案中，這些roxi陽性內胚層細胞是專能細胞，能夠分化為衍生自腸管的前腸區域的后部的細胞、組織或器官。PDXl-陽性前腸內胚層細胞，例如那些根據此處描述的方法產生的細胞，可用于產生完全分化的產生胰島素的β細胞。本發明的一些實施方案中，通過分化基本上不表達PDXl的定形內胚層細胞(PDX1-陰性定形內胚層細胞；此處也指定形內胚層)產生rox1-陽性前腸內胚層細胞?？墒褂么颂幟枋龅姆椒ɑ蚱渌魏我阎椒ǚ只嗄苄约毎?如胚胎干細胞)來制備rox1-陰性定形內胚層細胞。2004年12月23日提交的標題為“定形內胚層”的第11/021，618號美國專利申請描述了一種從多能性細胞方便高效產生rox1-陰性定形內胚層的方法。產生rox1-陽性前腸內胚層細胞的方法為從多能性細胞高效產生胰腺組織(如腺泡細胞、導管細胞和胰島細胞)提供了基礎。在某些優選實施方案中，人rox1-陽性前腸內胚層細胞衍生自人rox1-陰性定形內胚層細胞，而這些細胞又衍生自hEsc。然后這些人PDXl-陽性前腸內胚層細胞被用于產生功能性的產生胰島素的β-細胞。為得到有效量的產生的胰島素β細胞，希望 在分化為胰島/β-細胞終點前每個分化步驟都有高分化效率。因為rox1-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞的分化代表產生功能性胰島/β-細胞的一個早期步驟(如圖1所示)，尤其希望在這一步具有高分化效率?？紤]到需要rox1-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞的有效分化，本發明的一些方面涉及體外方法學，它會導致約29Γ25%的TOXl-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞轉化。典型地，該方法包括以確定的和短暫特定的方式使用培養基和生長因子條件。通過使用與rox1-陽性前腸內胚層細胞特異結合的試劑從細胞群中的其他細胞中分離和/或純化rox1-陽性前腸內胚層細胞，可進一步在細胞群中富集rox1-陽性前腸內胚層細胞。或者，PDX1-陽性前腸內胚層細胞可用諸如綠色熒光蛋白(GFP)的報告基因標記，以使得能夠檢測roxi表達。這種熒光標記的細胞可用熒光激活細胞分選術(FACS)純化。本發明更深入的方面涉及細胞培養物和包含rox1-陽性前腸內胚層細胞的富集的細胞群，以及鑒定在向rox1-陽性前腸內胚層和從rox1-陽性前腸內胚層分化中有用的因子。為測定細胞培養物或細胞群中rox1-陽性前腸內胚層細胞的數量，需要一種在培養物或細胞群中從其他細胞區分這種細胞類型的方法。相應地，本發明的某些實施方案涉及細胞標志物及檢測和確定這些標志物表達的方法，這些標志物的存在、缺失和/或相對表達水平是rox1-陽性前腸內胚層細胞的指示。此處使用的“表達”指材料或物質的產生以及材料或物質產生的水平或數量。因此，檢測特定標志物的表達指測定表達標志物的相對或絕對量，或僅僅檢測標志物的存在或缺失。此處使用的“標志物”指任何可被觀察或檢測的分子。例如，標志物包括但不局限于、核苷酸(如特定基因的轉錄產物)、基因的多肽產物、非基因產物多肽、糖蛋白、糖類、糖脂、脂、脂蛋白或小分子(如分子量小于10，OOOamu的分子)。本發明的一些實施方案中，用定量PCR(Q-PCR)測定標志物的存在、缺失和/或表達水平。例如，某些遺傳標志物，如PDX1、S0X17、S0X7、S0X1、ZIC1、NFM、α-胎蛋白(AFP)、同源框A13(H0XA13)、同源框C6(H0XC6)和/或此處描述的其他標志物產生的轉錄產物的量用Q-PCR確定。其他實施方案中，用免疫組化方法檢測上述基因表達的蛋白。在其他實施方案中，使用Q-PCR和免疫組化兩種方法鑒定和檢測這些標志物的量和相對比例。
使用此處描述的分化和檢測方法就可能在細胞培養物或細胞群中鑒定rox1-陽性前腸內胚層細胞以及確定這些細胞的比例。例如，本發明一些實施方案中，產生的PDX1-陽性前腸內胚層細胞或細胞群表達roxi基因的水平比rox1-陰性細胞或細胞群高至少約2個數量級。其他實施方案中，產生的rox1-陽性前腸內胚層細胞和細胞群表達roxi基因的水平比rox1-陰性細胞或細胞群高2個以上數量級。在其他實施方案中，產生的PDXl-陽性前腸內胚層細胞或細胞群表達一種或多種選自roXl、S0X17、H0XA13或H0XC6的標志物的水平比rox1-陰性定形內胚層細胞高約2個或2個以上數量級。此處描述的組合物和方法有幾個有用的特性。例如，包含rox1-陽性內胚層的細胞培養物和細胞群以及產生該細胞培養物和細胞群的方法有利于模擬人發育的早期階段。此外，此處描述的組合物與方法也可用于疾病狀態(如糖尿病)的治療性干預。例如，因為PDXl-陽性前腸內胚層用作有限數量組織的來源，它可被用于純組織或細胞類型的開發。從多能性細胞產生PDXl-陰性定形內胚層(定形內胚層)從多能性細胞產生包含rox1-陽性前腸內胚層細胞的細胞培養物和/或細胞群，首先要產生rox1-陰性定形內胚層(也稱為“定形內胚層”)。下面簡單描述了分化多能性細胞以產生包含定形內胚層的細胞培養物和富集的細胞群的方法，詳細步驟見2004年12月23日提交的標題為“定形內胚層”的第11/021，618號美國專利申請。在一些方法中，作為起始材料的多能性細胞是干細胞。某些方法中，定形內胚層細胞培養物和包含定形內胚層細胞的富集的細胞群產自胚胎干細胞。此處使用的“胚胎的”指有機體的一系列發育階段，開始于單一受精卵，結束于多細胞結構，這種多細胞結構除了發育的配子生殖細胞外不再包含多能或全能細胞。除了來自配子融合的胚胎，術語“胚胎的”也指來自體細胞核轉移的胚胎。優選的獲得定形內胚層細胞的方法利用人胚胎干細胞作為起始材料產生定形內胚層。該多能性細胞可以是源自桑椹胚、胚胎內細胞團或胚胎生殖嵴的細胞。可使用本領域公知的方法在培養基中維持人胚胎干細胞基本未分化的多能狀態。在如第5，453，357、5，670，372,5, 690，926,5, 843，780,6, 200，806 和 6，251，671 號美國專利中描述了這些方法。在產生定形內胚層細胞的一些方法中，hESC維持在飼養層上。該方法中，可使用任何能使得hESC維持在多能狀態的飼養層。一種常用的培養人胚胎干細胞的飼養層是小鼠成纖維細胞層。最近，人成纖維細胞飼養層已用于培養hESC(參見第2002/0072117號美國專利申請)。產生定形內胚層的被選方法允許不用飼養層就可維持多能hESC。在第2003/0175956號美國專利申請中描述了無飼養層條件下維持多能hESC的方法。此處使用的人胚胎干細胞可在含或不含血清的培養基中維持。在一些胚胎干細胞維持步驟中，使用血清替代物。在其他步驟中，使用例如第2003/0190748號美國專利申請描述的無血清培養技術。干細胞在培養基中通過常規傳代保持多能狀態，直到需要分化為定形內胚層。一些方法中，通過向干 細胞培養物中添加有效量的促進向定形內胚層分化的TGFii超家族的生長因子以獲得向定形內胚層的分化。對產生定形內胚層有用的TGFii超家族的生長因子選自Nodal/活化素(activin)或BMP亞組。在一些優選的分化方法中，生長因子選自Nodal、活化素A、活化素B和BMP4。此外，生長因子Wnt3a和其他Wnt家族成員有利于定形內胚層細胞的產生。某些分化步驟中，可使用任意上述生長因子的組合。
對于多能干細胞向定形內胚層細胞分化的一些方法，添加上述生長因子到細胞中使培養基中生長因子的濃度足以促使至少一部分干細胞向定形內胚層細胞分化。一些方法中，細胞培養基中上述生長因子的濃度是至少約5ng/ml、至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約 400ng/ml、至少約 500ng/ml、至少約 1000ng/ml、至少約 2000ng/ml、至少約 3000ng/ml、至少約4000ng/ml、至少約5000ng/ml或多于約5000ng/ml。在多能干細胞向定形內胚層細胞分化的某些方法中，先添加上述生長因子，然后再從細胞培養物中去除。例如，生長因子可在添加約I天、約2天、約3天、約4天、約5天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天后去除。在一個優選的方法中，生長因子在添加約4天后去除。定形內胚層的培養物可在含減少的血清或無血清的培養基中生長。在某些培養條件下,血清濃度范圍從約0.05%v/v至約20%v/v。例如,在一些分化步驟中，培養基中血清濃度可低于約0.05%(v/v)、低于約0.1%(ν/ν)、低于約0.2%(v/v)、低于約0.3%(v/v)、低于約
0.4%(v/v)、低于約 0.5%(v/v)、低于約 0.6%(v/v)、低于約 0.7%(v/v)、低于約 0.8%(v/v)、低于約0.9%(v/v)、低于約1%(ν/ν)、低于約2%(v/v)、低于約3%(v/v)、低于約4%(v/v)、低于約5%(v/v)、低于約 6%(v/v)、低于約 7%(v/v)、低于約 8%(v/v)、低于約 9%(v/v)、低于約 10%(v/V)、低于約15%(v/v)或低于約20%(v/v)。一些方法中，定形內胚層在無血清或在血清替代物的條件下生長。其他方法中，定形內胚層細胞在含B27的條件下生長。該方法中，B27添加物的濃度范圍從約0.1%ν/ν至約20%v/v。監控多能性細胞向PDXl-陰性定形內胚層(定形內胚層)的分化通過測定定形內胚層特異標志物的表達可監控hESC培養物向定形內胚層的分化進程。在一些方法中，通過檢測標志物的存在或缺失確定某種標志物的表達?；蛘?，某些標志物的表達通過測定細胞培養物或細胞群中細胞的標志物的水平來確定。在該方法中，標志物表達的檢測可以是定性的，也可以是定量的。使用定量PCR(Q-PCR)是對標志物基因產生的標志物的表達進行定量的一種方法。進行Q-PCR的方法在本領域是公知的。也可用本領域公知的其他方法對標志物基因的表達進行定量。例如，使用針對感興趣的標志物基因產物特異的抗體，檢測標志物基因產物的表達。某些方法中，確定定形內胚層特異標志物基因的表達及缺乏hECS和其他細胞類型特異標志物基因的顯著表達。如以下實施例進一步描述的，定形內胚層可靠的標志物是S0X17基因。因此，用此處描述的方法產生的定形內胚層細胞表達S0X17標志物基因，從而產生S0X17基因產物。定形內胚層其他的標志物是 MIXLl、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、F0XQ1、CMK0R1 和CRIP1。因為定形內胚層細胞表達S0X17標志物基因的水平高于表達S0X7標志物基因的水平，而這是原始和內臟內胚層的特征(見表I)，所以在一些步驟中，S0X17和S0X7的表達均被監控。其他步驟中，監控了 hESC特異的S0X17和0CT4標志物基因的表達。此外，因為定形內胚層細胞中S0X17標志物基因的表達水平比AFP、SPARC或血栓調節蛋白(TM)標志物基因的表達水平高，所以這些基因的表達也被監控。

定形內胚層另一個標志物是CXCR4基因。CXCR4基因編碼細胞表面趨化因子受體，這個受體的配體是化學引誘物SDF-1。在成體中含CXCR4受體的細胞的主要作用被認為是造血細胞向骨髓的遷移、淋巴細胞運輸以及各種B細胞和巨噬血細胞系的分化[Kim，C.和Broxmeyer, H.J.Leukocyte Biol.65，6-15 (1999) ]。CXCR4 受體還作為 HIV-1 進入 T 細胞的共受體[Feng, Y.，et al.Science, 272，872-877 (1996)]。在[McGrath, K.E.et al.Dev.Biology 213，442-456(1999)]進行的一系列廣泛的研究中，描繪了在小鼠的早期發育和成年時期趨化因子受體CXCR4和它唯一的配體SDF-1 [Kim, C.和Broxmeyer, H., J.LeukocyteBiol.65, 6-15 (1999)]的表達。在發育中CXCR4/SDF I的相互作用非常明顯，因為已證實，在轉基因小鼠中破壞 CXCR4 和 SDFl 中任一基因[Nagasawa et al.Nature, 382, 635-638(1996) ;Ma, Q., et al Immunity, 10, 463-471 (1999)]，均會導致小鼠在胚胎晚期死亡。McGrath等人利用RNase保護和原位雜交結合的方法證明在原腸形成胚胎早期(E7.5)CXCR4使檢測到的最豐富的趨化因子受體信使RNA。在原腸形成胚胎期，CXCR4/SDF-1信號可能主要參與誘導原條胚層細胞的遷移，并在此時的定形內胚層、中胚層和胚外中胚層表達。在E7.2-7.8小鼠胚胎中，CXCR4和α-胎蛋白是互斥的，表明內臟內胚層中表達的缺失[McGrath，K.E.et al.Dev.Biology 213,442-456(1999)]。因為通過分化多能性細胞產生的定形內胚層細胞表達CXCR4標志物基因，所以可通過監控CXCR4的表達以追蹤定形內胚層細胞的產生。此外，用此處描述的方法產生的定形內胚層細胞還表達定形內胚層的其他標志物，這些標志物包括但不限于S0X17、MIXL1,GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、F0XQl、CMK0Rl 和 CRIP1。因為定形內胚層表達 CXCR4標志物基因的水平高于表達S0X7基因的水平，所以可監控CXCR4和S0X7兩種基因的表達。其他方法中，CXCR4標志物基因和0CT4標志物基因的表達均被監控。此外，因為定形內胚層細胞表達CXCR4標志物基因的水平高于表達AFP、SPARC或血栓調節蛋白(TM)標志物基因的水平，也可以監控這些基因 的表達。應了解內胚層細胞中CXCR4的表達不妨礙S0X17的表達。用此處描述的方法產生的定形內胚層細胞將大量表達S0X17和CXCR4，但不大量表達AFP、TM、SPARC或TOXl。定形內胚層的富集、分離和/或純化用任意上述方法產生的定形內胚層細胞，可通過利用對這些細胞特異的親和標簽進行富集、分離和/或純化。對定形內胚層細胞特異的親和標簽的例子是抗體、配體或其他對標志物分子特異的結合試劑，例如多肽，其中所述標志物分子存在于定形內胚層細胞表面上，而基本上不存在于在用此處描述的方法產生的細胞培養物中可以找到的其他細胞類型上。一些方法中，使用與CXCR4結合的抗體作為親和標簽，以富集、分離或純化定形內胚層細胞。在其他方法中，使用趨化因子SDF-1或基于SDF-1的其他分子作為親和標簽。這些分子包括但不限于SDF-1片段、SDF-1融合物或SDF-1模擬物。制備抗體和利用抗體進行細胞分離的方法在本領域是公知的，這些方法可用于此處描述的抗體和定形內胚層細胞。在一個方法中，將結合CXCR4的抗體偶聯到磁珠上，然后與細胞培養物中的定形內胚層細胞結合，其中該細胞培養物經過酶處理以減少細胞間和底物的粘附。隨后將細胞/抗體/磁珠混合物置于可動磁場中，用于分離與磁珠結合的定形內胚層細胞和未結合的細胞。當培養物中定形內胚層細胞與其他細胞進行了物理分離后，抗體結合被破壞，細胞重新種于合適的組織培養基中。也可用其他方法獲得富集的、分離的或純化的定形內胚層細胞培養物或群。例如，在一些實施方案中，使CXCR4抗體與含定形內胚層的細胞培養物孵育，其中該培養物經過處理以減少細胞間和底物的粘附。洗滌、離心和重懸細胞。細胞懸浮物與二抗(例如能夠與一抗結合的FITC偶聯的抗體)孵育。洗滌、離心并在緩沖液中重懸細胞。然后用熒光激活細胞分選術(FACS)對細胞懸浮物進行分析和分選。收集于CXCR4-陰性細胞分離后的CXCR4-陽性細胞，從而分離了這種細胞類型。如果需要，可使用另一親和方法或增加分選次數對分離的細胞組分進一步純化，利用的是特異于定形內胚層細胞的相同或不同的標志物。在其他方法中，利用與CXCR4結合的配體或其他分子富集、分離和/或純化定形內胚層細胞。一些方法中，這種分子是SDF-1或其片段、融合物或模擬物。優選方法中，在誘導干細胞培養物向定形內胚層系分化后，從其他非定形內胚層細胞富集、分離和/或純化定形內胚層細胞。應了解上述富集、分離和純化步驟可用于該培養物分化的任意階段。除了剛剛描述的步驟外，還可以用其他細胞分離技術分離定形內胚層細胞。此外，通過在促進定形內胚層細胞選擇性存活 或選擇性擴增的生長條件下進行系列傳代培養的方法富集或分離定形內胚層細胞。使用此處描述的方法，富集的、分離的和/或純化的定形內胚層細胞群和/或組織可在體外從多能性細胞培養物或細胞群產生，例如已經進行了至少部分分化的干細胞培養物或群。在一些方法中，細胞進行隨機分化。但在優選方法中，細胞主要定向分化為定形內胚層。一些優選的富集、分離和/或純化方法涉及在體外從人胚胎干細胞產生定形內胚層。使用此處描述的方法，細胞群或細胞培養物中的定形內胚層含量與未處理的細胞群或細胞培養物相比，至少富集了約2至約1000倍。包含PDXl-陰性定形內胚層(定形內胚層)的組合物上述方法產生的細胞組合物包括包含定形內胚層的細胞培養物和富集定形內胚層的細胞群。例如，能夠產生包含定形內胚層細胞的細胞培養物，其中培養物中至少約5(Γ80%的細胞是定形內胚層細胞。因為分化方法的效率可通過改變某些參數(這些參數包括但不限于，細胞生長條件、生長因子濃度和培養步驟的時間控制)來調整，此處描述的分化方法可導致約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或超過約95%的多能性細胞向定形內胚層的轉化。在采用分離定形內胚層細胞的方法中，例如，通過使用結合CXCR4受體的親和試劑，可獲得基本上純的定形內胚層細胞群。從PDXl-陰性定形內胚層產生PDXl-陽性前腸內胚層此處描述的包含rox1-陽性前腸內胚層細胞的rox1-陽性前腸內胚層細胞培養物和群由rox1-陰性定形內胚層產生，其中該rox1-陰性定形內胚層如上所述由多能性細胞產生。一個優選的方法利用人胚胎干細胞作為起始材料。在一個實施方案中，hESC首先轉化為rox1-陰性定形內胚層細胞，然后轉化為rox1-陽性前腸內胚層細胞。但應了解用于PDXl-陽性前腸內胚層細胞產生的起始材料并不限于用多能性細胞分化方法產生的定形內胚層細胞。而且，任何rox1-陰性定形內胚層細胞都可用于此處描述的方法，與它們的來源無關。本發明一些實施方案中，包含rox1-陰性定形內胚層細胞的細胞培養物或細胞群可用于進一步向包含rox1-陽性前腸內胚層細胞的細胞培養物和/或富集的細胞群分化。例如，可使用包含人rox 1-陰性、sox 17-陽性的定形內胚層細胞的細胞培養物或細胞群。在一些實施方案中，細胞培養物或細胞群可能包含從前面分化步驟(即分化多能性細胞為定形內胚層細胞的步驟)保留的分化因子，如活化素、nodal和/或BMP。其他實施方案中，在添加用于rox1-陰性、S0X17-陽性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞分化的因子前，從細胞培養物或細胞群中去除前面分化步驟中的因子。其他實施方案中，用富集PDX1-陰性、S0X17-陽性定形內胚層細胞的細胞群作為產生rox1-陽性前腸內胚層細胞的來源。通過向包含rox1-陰性、S0X17-陽性定形內胚層細胞的細胞培養物中添加促進細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞分化的分化因子(前腸分化因子)，培養基中的rox1-陰性定形內胚層細胞可分化為rox1-陽性內胚層細胞。本發明一些實施方案中，前腸分化因子是類視黃醇，例如視黃酸(RA)。一些實施方案中，類視黃醇與成纖維細胞生長因子(例如FGF-4和FGF-10)聯用。其他實施方案中，類視黃醇與生長因子TGF β超家族成員和/或條件培養基聯用。“條件培養基”是指與基本培養基比較發生了改變的培養基。例如，培養基的條件化可能造成從培養基的初始水平添加或去除分子，例如營養物和/或生長因子。在一些實施方案中，通過在一定條件下使一定類型的細胞在培養基中生長或維持一定時間段而使培養基條件化。例如，通過使hESC在一定溫度、一定組成的培養基中擴增、分化或維持一定的時間而使培養基條件化。本領域技術人員應了解的是，細胞、培養基類型、持續時間和環境條件的眾多組合可用于產生接近無窮排列的條件培養基。本發明的一些實施方案中，通過在包含約1%至約20%血清濃度的培養基中生長或維持分化的多能性細胞來條件化培養基。在其他實施方案中，通過使分化的多能性細胞在包含約lng/ml至約1000ng/ml活化素A的培養基中的生長或維持來條件化培養基。在其他實施方案中，通過使分化的多能性細胞在包含約lng/ml至約1000ng/ml BMP4的培養基中生長或維持來條件化培養基。在優選的實施方案中，通過使分化的hESC在包含約25ng/ml活化素A和約2 μ MRA的培養基(如RPMI)中生長或維持來制備條件培養基。本發明的一些實施方案中，用于條件化培養基(這些培養基用于增強rox1-陰性定形內胚層向rox1-陽性前腸內胚層的分化)的細胞是在含約o%至約20%血清和/或一種或多種TGFii超家族生長/ 分化因子的培養基(方案如RPMI)中從多能性細胞(如hESC)分化超過5天的細胞。添加分化因子(例如活化素A和BMP4)的濃度范圍從約lng/ml至約1000ng/ml。本發明的某些實施方案中，用于條件化培養基的細胞在低血清RPMI中從hESC分化超過5天。根據一些實施方案，低血清RPMI指含有低血清的培養基，其中血清濃度在一定時間段內逐漸增加。例如，在一個實施方案中，低血清RPMI在細胞生長第一天包含濃度約0.2%的胎牛血清(FBS)，細胞生長第二天約0.5%FBS,細胞生長第3至5天約2%FBS。在另一個實施方案中，低血清RPMI第一天包含血清濃度約0%，第二天約0.2%，第3飛天約2%ο在某些優選的實施方案中，低血清RPMI中添加一種或多種分化因子，方案如活化素A和BMP4。除了制備用于條件化培養基的細胞，低血清RPMI也可用作rox1-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞分化的培養基。本領域的普通技術人員應了解用于制備條件培養基的培養基不只是RPMI，前提是這種培養基不干擾rox1-陽性前腸內胚層細胞的生長或維持。還應了解用于條件化培養基的細胞可以是不同的類型。在使用新鮮分化的細胞來條件化培養基的實施方案中，這種細胞可以在不同于RPMI的培養基中分化，前提是這種培養基不會抑制這種細胞的生長或維持。此外，技術人員應了解條件化的持續時間或制備用于條件化的細胞的持續時間不是分別必須是24小時或5天，因為其他的時間長度也足以獲得此處報道的效果。通常，類視黃醇與成纖維細胞生長因子(生長因子TGF0超家族的成員)、條件培養基或任意這些前腸分化因子的組合聯用，都可以造成比單用類視黃醇更強的rox1-陰性定形內胚層向rox1-陽性前腸內胚層的分化。在優選的實施方案中，添加RA和FGF-10到PDXl-陰性定形內胚層細胞培養物中。在另一個優選的實施方案中，PDXl-陰性定形內胚層細胞在含有條件培養基、活化素A、活化素B和RA的培養基中分化。就此處描述的分化方法的一些實施方案而論，將上述前腸分化因子添加到細胞中，使細胞培養物或細胞群中前腸分化因子的濃度足以促進至少部分rox1-陰性定形內胚層細胞培養物或細胞群向rox1-陽性前腸內胚層細胞分化。當涉及細胞培養物和/或細胞群時，術語“部分”表示細胞培養物或細胞群任意不為零的數量，范圍從單個細胞到整個細胞培養物或細胞群。本發明的一些實 施方案中，向培養物的細胞中添加類視黃醇使其濃度至少約0.01 μ M、至少約0.02 μ Μ、至少約0.04 μ Μ、至少約0.08 μ Μ、至少約0.1 μ Μ、至少約
0.2 μ Μ、至少約0.3 μ Μ、至少約0.4 μ Μ、至少約0.5 μ Μ、至少約0.6 μ Μ、至少約0.7μΜ、至少約0.8 μ Μ、至少約0.9 μ Μ、至少約I μ Μ、至少約1.1 μ Μ、至少約1.2 μ Μ、至少約1.3μΜ、至少約1.4 μ Μ、至少約1.5 μ Μ，、至少約1.6 μ Μ、至少約1.7 μ Μ、至少約1.8 μ Μ、至少約
1.9 μ Μ、至少約2 μ Μ、至少約2.1 μ Μ、至少約2.2 μ Μ、至少約2.3 μ Μ、至少約2.4 μ Μ、至少約2.5 μ Μ、至少約2.6 μ Μ、至少約2.7 μ Μ、至少約2.8 μ Μ、至少約2.9 μ Μ、至少約3μΜ、至少約3.5 μ Μ、至少約4 μ Μ、至少約4.5 μ Μ、至少約5 μ Μ、至少約10 μ Μ、至少約20 μ Μ、至少約30 μ Μ、至少約40 μ M或至少約50 μ Μ。此處使用的“類視黃醇(retinoid) ”指視黃醇、視黃醛或視黃酸以及這些化合物的任何衍生物。在優選的實施方案中，類視黃醇是視黃酸。本發明其他實施方案中，細胞培養物中存在一種或多種成纖維細胞生長因子家族的分化因子。例如，在一些實施方案中，細胞培養物中FGF-4的濃度至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ml、至少約500ng/ml或至少約1000ng/ml。本發明進一步實施方案中，細胞培養物中FGF-10的濃度至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ml、至少約500ng/ml、或至少約1000ng/ml。在一些實施方案中，從FGF-4和FGF-10中選擇一個與RA一起添加到細胞培養物中。優選的實施方案中，細胞培養物中RA濃度為I μ M，FGF-10濃度為 50ng/mlo本發明一些實施方案中，在細胞培養物中存在TGFii超家族的生長因子和/或條件培養基。這些分化因子可與RA和/或其它中前腸分化因子(包括但不限于FGF-4和FGF-10)聯用。例如，在一些實施方案中，細胞培養物中可存在活化素A和/或活化素B，其濃度為至少約5ng/ml、至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ml、至少約500ng/ml或至少約1000ng/ml。本發明的另一實施方案中，細胞培養物中存在條件培養基，其濃度是總培養基的至少約1%、至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。一些實施方案中，細胞培養物中添加有活化素A、活化素B以及條件培養基和RA。在優選實施方案中，在包含I μ M RA、約25ng/ml活化素A和低血清RPMI培養基(該培養基已被分化的hESC條件化約24小時，其中分化的hESC已在包含100ng/ml活化素A的低血清RPMI中分化約5天)的培養物中rox1-陰性定形內胚層細胞分化為rox1-陽性前腸內胚層細胞。在另一優選實施方案中，培養物中還存在活化素B和/或FGF-10，其濃度分別是25ng/ml和50ng/ml。本發明的某些實施方案中，上述前腸分化因子在添加后從細胞培養物去除。例如，前腸分化因子可以在添加后約I天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天內去除。PDXl-陽性前腸內胚層細胞可在含有降低血清濃度的培養基中生長。血清濃度范圍可從約0.05%(v/v)至約20%(v/v)。在一些實施方案中，PDXl-陽性前腸內胚層細胞生長在含血清替代物的條件下。例如，在某些實施方案中，培養基的血清濃度可低于約0.05%(v/V)、低于約0.1% (v/v)、低于約0.2% (v/v)、低于約0.3% (v/v)、低于約0.4% (v/v)、低于約
0.5%(v/v)、低于約 0.6%(v/v)、低于約 0.7%(v/v)、低于約 0.8%(v/v)、低于約 0.9%(v/v)、低于約1%(ν/ν)、低于約2%(v/v)、低于約3%(v/v)、低于約4%(v/v)、低于約5%(v/v)、低于約6% (v/v)、低于約7% (v/v)、低于約8% (v/v)、低于約9% (v/v)、低于約10% (v/v)、低于約15%(v/v)或低于約20%(v/v)。在一些實施方案中，PDXl-陽性前腸內胚層細胞可以在無血清的條件下生長。在其他實施方案中，PDXl-陽性前腸內胚層細胞在含血清替代物的條件下生長。在其他實施方案中，PDXl-陽性前腸內胚層細胞在B27存在下生長。在這些實施方案中，B27可以從約0.1%(ν/ν )至約20%(v/v)的濃度范圍或者大于20%(v/v)的濃度添加到培養基中。在某些實施方案中，培養基中B27的濃度約0.1% (v/v)、約0.2% (v/v)、約0.3%(v/V)、約 0.4% (v/v)、約 0.5% (v/v)、約 0.6% (v/v)、約 0.7% (v/v)、約 0.8% (v/v)、約 0.9% (v/v)、約 1% (v/V)、約 2% (v/V)、約 3% (v/V)、約 4% (v/v)、約 5% (v/v)、約 6% (v/v)、約 7% (v/v)、約8% (v/v)、約 9% (v/v)、約 10% (v/v)、約 15% (v/v)或約 20% (v/v)。或者，添加的 B27 添加物的濃度可根據商品化的B27存儲液濃度的倍數來計算。例如，Invitrogen (Carlsbad, CA)提供50X的B27存儲液。向足夠體積的生長培養基中添加足量這種存儲液可以產生含所需量B27的培養基。例如，向90ml生長培養基中添加IOml 50XB27存儲液將得到添加了 5XB27的生長培養基。培養基中B27添加物的濃度可以是約0.1X、約0.2X、約0.3X、約0.4X、約 0.5 X、約 0.6 X、約 0.7 X、約 0.8 X、約 0.9 X、約 I X、約 1.1 X、約 1.2 X、約 1.3 X、約
1.4X、約 1.5X、約 1.6X、約 1.7X、約 1.8X、約 1.9X、約 2X、約 2.5父、約3父、約3.5X、約4X、約4.5X、約5父、約6父、約7父、約8父、約9X、約IOX、約IlX、約12X、約13X、約14X、約15X、約16X、約17X、約18X、約19X、約20X和高于約20X。監控PDXl-陰性定形內胚層向PDXl-陽性前腸內胚層的分化如同多能性細胞向定形內胚層細胞分化的情況，PDXl-陰性、S0X17-陽性定形內胚層向rox1-陽性前腸內胚層分化的進程可通過測定這些細胞類型特征性的標志物的表達來監控。這種監控使得能決定在不同條件下(例如一種或多種分化因子濃度和環境條件)足以產生所需量rox1-陽性前腸內胚層需要的時間。優選的實施方案中，通過檢測roxi的表達來決定足以產生所需量rox1-陽性前腸內胚層所需的時間。本發明的一些實施方案中，通過檢測標志物的存在或缺失來測定某些標志物的表達?；蛘?，通過測定細胞培養物或細胞群的細胞中標志物存在的水平來測定某些標志物的表達。在這些實施方案中，標志物表達的測量可以是定性或定量的。如上所述，優選的定量檢測由標志物基因產生的標志物表達的方法是使用Q-PCR。在具體實施方案中，Q-PCR被用于通過定量檢測rox1-陽性前腸內胚層特征性的標志物基因的表達和其他細胞類型特征性的標志物基因表達的缺失，來監控rox1-陰性、S0X17-陽性定形內胚層培養物向rox1-陽性前腸內胚層細胞分化的進程。也可以用本領域其他公知的方法定量檢測標志物基因表達。例如，可利用對感興趣的標志物基因產物特異的抗體來檢測標志物基因產物的表達。本發明一些實施方案中，測定了 rox1-陽性前腸內胚層特征性的標志物基因的表達以及rox-1陰性定形內胚層、hEsc和其他細胞類型特征性的標志物基因的顯著表達的缺失。如以下實施方案的進一步描述，PDXl是與roXl-陽性前腸內胚層相關的標志物基因。因此，在本發明的一些實施方案中測定了 roxi的表達。在其他實施方案中，也測定了在PDXl-陽性前腸內胚層表達的其他標志物的表達，這些標志物包括但不限于S0X17、HOXA13和/或H0XC6。因為某些其他細胞類型(即內臟內胚層和某些神經外胚層)也表達ron，所以本發明一些實施方案涉及證明與內臟內胚層和/或神經外胚層有關的基因表達的缺失或基本上缺失。例如，在一些實施方案中，在內臟內胚層和/或神經外胚層表達的標志物(包括但不限于S0X7、AFP、S0X1, ZICl和/或NFM)的表達被測定。在一些實施方案中，用此處所述方法產生的rox1-陽性前腸內胚層細胞培養物基本上不含表達S0X7、 AFP、SOXl、ZICl或NFM標志物基因的細胞。在某些實施方案中，用此處所述步驟產生的rox1-陽性前腸內胚層細胞培養物基本上不含內臟內胚層、體壁內胚層和/或神經細胞。PDXl-陽性前腸內胚層的富集，分離和/或純化根據本發明的其他方面，rox1-陽性前腸內胚層細胞可以被富集、分離和/或純化。本發明的一些實施方案中，富集rox1-陽性前腸內胚層細胞的細胞群通過從細胞培養物中分離這種細胞來產生。本發明的一些實施方案中，PDXl-陽性前腸內胚層細胞用熒光標記，然后用熒光激活細胞分選術(FACS)來與未標記細胞分離。在這類實施方案中，用編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核苷酸或另一編碼可表達熒光標志物基因的核苷酸標記rox1-陽性細胞。例如，在一些實施方案中，至少一個拷貝的編碼GFP或其生物學活性片段的核苷酸被導入多能性細胞(優選的是人胚胎干細胞)PDXl啟動子的下游，以便GFP基因產物或其生物學活性片段的表達受roxi啟動子的控制。在一些實施方案中，編碼roxi的核苷酸的整個編碼區域被編碼GFP或其生物學活性片段的核苷酸替換。在其他實施方案中，編碼GFP或其生物學活性片段的核苷酸與編碼roxi的核苷酸的至少一部分進行框內(in frame)融合，從而產生融合蛋白。在這類實施方案中，融合蛋白保留與GFP相似的熒光能力。如前所述，熒光標記的細胞(例如上述的多能性細胞)分化為定形內胚層，然后是PDX1-陽性前腸內胚層。因為rox1-陽性前腸內胚層細胞表達熒光標志物基因，而ron-陰性細胞不表達，這兩種細胞類型可被分離。在一些實施方案中，用FACS分選包含熒光標記的rox1-陽性細胞和未標記的rox1-陰性細胞的混合物的細胞懸浮物。ron陽性細胞從PDXl-陰性細胞分離后收集，從而分離這種細胞類型。如果需要，可使用相同的或不同的對PDXl-陽性前腸內胚層特異的標志物增加分選次數，以進一步純化分離的細胞組合物。除了剛剛描述的步驟，PDXl-陽性前腸內胚層細胞也可用細胞分離的其他技術進行分離。此外，PDXl-陽性前腸內胚層細胞也可使用在促進上述rox1-陽性前腸內胚層細胞選擇性存活或選擇性擴增的生長條件下進行系列傳代培養的方法富集或分離定形內胚層細胞。應了解上述富集、分離和純化步驟可用于這類培養物的任意分化階段。使用此處描述的方法，富集的、分離的和/或純化的PDXl-陽性前腸內胚層細胞的群和/或組織可在體外從已經進行至少部分分化的rox1-陰性、S0X17-陽性定形內胚層細胞培養物或細胞群得到。在一些實施方案中，細胞進行隨機分化。但在優選的實施方案中，細胞主要定向分化為rox1-陽性前腸內胚層細胞。一些優選的富集、分離和/或純化方法涉及在體外從人胚胎干細胞產生rox1-陽性前腸內胚層細胞。使用此處描述的方法，與未處理的細胞群或細胞培養物相比，細胞群或細胞培養物中的rox1-陽性前腸內胚層細胞含量可被富集至少約2至約1000倍。一些實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養物相比，PDXl-陽性前腸內胚層細胞可被富集至少約5至約500倍。其他實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養物相比，rox1-陽性前腸內胚層細胞可被富集至少約10至約200倍。其他實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養物相比，PDXl-陽性前腸內胚層細胞可被富集至少約20至約100倍。其他實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養物相比，PDXl-陽性前腸內胚層細胞可被富集至少約40至約80倍。某些實施方案中，與未處理的細胞群或細胞培養物相比，PDXl-陽性前腸內胚層細胞可被富集至少約2至約20倍。包含PDXl-陽性前腸內胚層的組合物本發明的一些實施方案涉及包含rox1-陽性前腸內胚層細胞的細胞組合物，例如細胞培養物或細胞群，其中rox1-陽性前腸內胚層細胞是專能細胞(PDX1-陽性前腸內胚層)，可以分化為衍生自腸管 前部的細胞、組織或器官。根據某些實施方案，PDXl-陽性前腸內胚層是哺乳動物細胞，在優選實施方案中，定形內胚層細胞是人細胞。本發明的其他實施方案涉及包含一種或多種選自hESC、PDXl-陰性定形內胚層細胞、PDXl-陽性前腸內胚層細胞和中胚層細胞的細胞類型的細胞的組合物，例如細胞培養物或細胞群。一些實施方案中，培養物中hESC少于約5%、少于約4%、少于約3%、少于約2%或少于約1%的全部細胞。其他實施方案中，培養物中rox1-陰性定形內胚層細胞少于約90%、少于約85%、少于約80%、少于約75%、少于約70%、少于約65%、少于約60%、少于約55%、少于約50%、少于約45%、少于約40%、少于約35%、少于約30%、少于約25%、少于約20%、少于約15%、少于約12%、少于約10%、少于約8%、少于約6%、少于約5%、少于約4%、少于約3%、少于約2%或少于約1%的全部細胞。其他實施方案中，培養物中中胚層細胞少于約90%、少于約85%、少于約80%、少于約75%、少于約70%、少于約65%、少于約60%、少于約55%、少于約50%、少于約45%、少于約40%、少于約35%、少于約30%、少于約25%、少于約20%、少于約15%、少于約12%、少于約10%、少于約8%、少于約6%、少于約5%、少于約4%、少于約3%、少于約2%或少于約1%的占全部細胞。本發明的其他實施方案涉及用此處描述的方法產生的包含rox1-陽性前腸內胚層作為主要細胞類型的組合物、例如細胞培養物或細胞群。一些實施方案中，用此處描述的方法產生包含至少約99%、至少約98%、至少約97%、至少約96%、至少約95%、至少約94%、至少約93%、至少約92%、至少約91%、至少約90%、至少約85%、至少約80%、至少約75%、至少約70%、至少約65%、至少約60%、至少約55%、至少約54%、至少約53%、至少約52%或至少約51%的rox1-陽性前腸內胚層細胞的細胞培養物和/或細胞群。優選的實施方案中、細胞培養物或細胞群的細胞包含人細胞。其他實施方案中，用此處描述的方法產生包含至少約50%、至少約45%、至少約40%、至少約35%、至少約30%、至少約25%、至少約24%、至少約23%、至少約22%、至少約21%、至少約20%、至少約19%、至少約18%、至少約17%、至少約16%、至少約15%、至少約14%、至少約13%、至少約12%、至少約11%、至少約10%、至少約9%、至少約8%、至少約7%、至少約6%、至少約5%、至少約4%、至少約3%、至少約2%或至少約1%的I3DXl-陽性前腸內胚層細胞的細胞培養物和/或細胞群。優選實施方案中，細胞培養物或細胞群的細胞包含人類細胞。一些實施方案中，計算細胞培養物或細胞群中rox1-陽性前腸內胚層細胞的比例時不考慮殘留在培養物中的飼養細胞。本發明的其他實施 方案涉及包含rox1-陽性前腸內胚層細胞和rox1-陰性定形內胚層細胞的混合物的組合物，例如細胞培養物或細胞群。例如，能夠產生包含約每95個PDXl-陰性定形內胚層細胞對應至少約5個rox1-陽性前腸內胚層細胞的細胞培養物或細胞群。其他實施方案中，能夠產生包含約每5個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約95個rox1-陽性前腸內胚層細胞的細胞培養物或細胞群。此外，預期可以得到包含rox1-陽性前腸內胚層細胞和rox1-陰性定形內胚層其他比例的細胞培養物或細胞群。例如，預期可以得到包含約每1，000,000個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約I個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每100，000個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約I個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每10，000個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約I個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每1000個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約I個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每500個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約I個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每loo個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約I個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每 ο個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約I個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每5個PDX1-陰性定形內胚層細胞對應至少約I個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每4個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約I個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每2個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約I個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每I個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約I個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每I個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約2個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每I個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約4個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每I個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約5個PDX1-陽性前腸內胚層細胞、約每I個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約 ο個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每I個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約20個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每I個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約50個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每I個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約loo個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每I個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約1000個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每I個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約10，000個rox1-陽性前腸內胚層細胞、約每I個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約100，000個rox1-陽性前腸內胚層細胞、和約每I個rox1-陰性定形內胚層細胞對應至少約1，000,000個rox1-陽性前腸內胚層細胞的組合物。本發明一些實施方案中，用于產生rox1-陽性前腸內胚層細胞的rox1-陰性定形內胚層細胞衍生自人多能性細胞，例如人多能干細胞。某些實施方案中，人多能性細胞衍生自桑椹胚、胚胎內細胞團或胚胎生殖嵴。某些其他實施方案中，人多能性細胞衍生自發育已經越過胚胎期的多細胞結構的性腺組織或生殖組織。本發明的進一步實施方案涉及包含人細胞(包括人rox1-陽性前腸內胚層)的組合物，例如細胞培養物或細胞群，其中至少約2%的人細胞中roxi標志物的表達高于AFP、S0X7、SOXl、ZICl和/或NFM標志物的表達。其他實施方案中，至少5%的人細胞中、至少10%的人細胞中、至少15%的人細胞中、至少20%的人細胞中、至少25%的人細胞中、至少30%的人細胞中、至少35%的人細胞中、至少40%的人細胞中、至少45%的人細胞中、至少50%的人細胞中、至少55%的人細胞中、至少60%的人細胞中、至少65%的人細胞中、至少70%的人細胞中、至少75%的人細胞中、至少80%的人細胞中、至少85%的人細胞中、至少90%的人細胞中、至少95%的人細胞中或至少98%的人細胞中、PDXl標志物的表達高于AFP、S0X7、S0X1、ZICl和/或NFM標志物的表達。一些實施方案中，計算細胞培養物或群中人細胞(其中PDXl的表達高于AFP、S0X7、SOXl, ZICl和/或NFM的表達)的比例時不考慮飼養細胞。應了解本發明的一些實施方案涉及包含人rox1-陽性前腸內胚層細胞的組合物，例如細胞培養物或細胞群，其中從至少約2%到超過約98%的人細胞中一種或多種選自S0X17、H0XA13或H0XC6的表達高于AFP、S0X7、S0X1、ZIC1和/或NFM標志物的表達。一些實施方案中，至少約5%的人細胞中、至少約10%的人細胞中、至少約15%的人細胞中、至少約20%的人細胞中、至少約25%的人細胞中、至少約30%的人細胞中、至少約35%的人細胞中、至少約40%的人細胞中、至少約45%的人細胞中、至少約50%的人細胞中、至少約55%的人細胞中、至少約60%的人細胞中、至少約65%的人細胞中、至少約70%的人細胞中、至少約75%的人細胞中、至少約80%的人細胞中、至少約85%的人細胞中、至少約90%的人細胞中、至少約95%的人細胞中或至少約98%的細胞中，一種或多種選自S0X17、H0XA13或H0XC6的表達高于AFP、S0X7、S0X1，ZICl和/或NFM的表達。一些實施方案中，計算細胞培養物或群中人細胞(一種或多種選自S0X17、H0XA13或H0XC6的表達高于AFP、S0X7、SOXl、ZICl和/或NFM的表達)的比例時不考慮飼養細胞。本發明的其他實施方案涉及包含哺乳動物內胚層細胞(例如人內胚層細胞)的組合物，例如細胞培養物或細胞群，其中至少約2%的內胚層細胞中roxi標志物的表達高于AFP、S0X7、S0X1、ZIC1和/或NFM標志物的表達。其他實施方案中，至少約5%的內胚層細胞中、至少約10%的內胚層細胞中、至少約15%的內胚層細胞中、至少約20%的內胚層細胞中、至少約25%的內胚層細胞中、至少約30%的內胚層細胞中、至少約35%的內胚層細胞中、至少約40%的內胚層細胞中、至少約45%的內胚層細胞中、至少約50%的內胚層細胞中、至少約55%的內胚層細胞中、至少約60%的內胚層細胞中、至少約65%的內胚層細胞中、至少約70%的內胚層細胞中、至少約75%的內胚層細胞中、至少約80%的內胚層細胞中、至少約85%的內胚層細胞中、至少約90%的內胚層細胞中、至少約95%的內胚層細胞中或至少約98%的內胚層細胞中、PDXl標志物的表達高于AFP、S0X7、SOXl、ZICl和/或NFM標志物的表達。

本發明的其他實施方案涉及包含哺乳動物內胚層細胞(例如人內胚層細胞)的組合物，例如細胞培養物或細胞群，其中至少約2%的胚胎細胞中一種或多種選自S0X17、HOXA13和H0XC6的標志物的表達高于AFP、S0X7、S0X1、ZIC1和/或NFM標志物的表達。其他實施方案中，至少約5%的內胚層細胞中、至少約10%的內胚層細胞中、至少約15%的內胚層細胞中、至少約20%的內胚層細胞中、至少約25%的內胚層細胞中、至少約30%的內胚層細胞中、至少約35%的內胚層細胞中、至少約40%的內胚層細胞中、至少約45%的內胚層細胞中、至少約50%的內胚層細胞中、至少約55%的內胚層細胞中、至少約60%的內胚層細胞中、至少約65%的內胚層細胞中、至少約70%的內胚層細胞中、至少約75%的內胚層細胞中、至少約80%的內胚層細胞中、至少約85%的內胚層細胞中、至少約90%的內胚層細胞中、至少約95%的內胚層細胞中或至少約98%的內胚層細胞中，一種或多種選自S0X17、H0XA13和H0XC6的標志物的表達高于AFP、S0X7、SOXl、ZICl和/或NFM標志物的表達。使用此處描述的方法，可產生基本上不含其他細胞類型的包含rox1-陽性前腸內胚層細胞的組合物。關于細胞培養物或細胞群中的細胞，術語“基本上不含”表示細胞培養物或細胞群不含的特異細胞類型在細胞培養物或細胞群的所有細胞中占有的比例少于5%。本發明的一些實施方案中，用此處描述的方法產生的rox1-陽性前腸內胚層細胞群或細胞培養物基本上不含顯著表達AFP、S0X7、SOXl、ZICl和/或NFM標志物基因的細胞。本發明的一個實施方案中，根據標志物基因的表達對rox1-陽性前腸內胚層細胞的描述如下:PDX1高、AFP低、S0X7低、SOXl低、ZICl低和NFM低。

增加S0X17-陽性定形內胚層細胞中PDXl的表達本發明的一些方面涉及增加包含S0X17-陽性定形內胚層細胞的細胞培養物或細胞群中表達roxi基因產物的方法。在這類實施方案中，向soxi7-陽性定形內胚層細胞中添加足以增加roxi基因產物表達量的分化因子。與分化因子接觸的soxi7-陽性定形內胚層細胞可以是rox1-陰性或rox1-陽性。在一些實施方案中，分化因子可以是類視黃醇。某些實施例中，使S0X17-陽性定形內胚層細胞與濃度范圍約0.01 μ M至約50 μ M的類視黃醇接觸。在優選的實施方案中，所述類視黃醇是RA。在本發明的其他實施方案中，通過使S0X17-陽性定形內胚層細胞與成纖維細胞生長因子家族的分化因子接觸來增加包含S0X17-陽性定形內胚層細胞的細胞培養物或細胞群中roxi基因產物的表達。這類分化因子可單獨使用或與RA聯用。一些實施方案中，使S0X17-陽性定形內胚層細胞與濃度范圍約10ng/ml至約1000ng/ml的成纖維細胞生長因子接觸。一個優選實施方案中，FGF生長因子是FGF-10。本發明的一些實施方案中，通過使S0X17-陽性細胞與B27接觸來增加包含soxi7-陽性定形內胚層細胞的細胞培養物或細胞群中roxi基因產物的表達。這類分化因子可以單獨使用或與FGF家族分化因子和類視黃醇中的一種或兩種聯用。一些實施方案中，使S0X17-陽性定形內胚層細胞與濃度范圍約0.1%(ν/ν)至約20%(v/v)的B27接觸。在優選的實施方案中，使S0X17-陽性定形內胚層細胞與RA、FGF-10和B27接觸。增加包含S0X17-陽性定形內胚層細胞的細胞培養物或細胞群中roXl基因產物表達的方法可在降低血清濃度或無血清的生長培養基中進行。一些實施方案中，血清濃度范圍從約0.05%(v/v)至約20%(v/v)。一些實施方案中，S0X17-陽性定形內胚層細胞在含血清替代物的條件下生長。能夠促進PDXl-陰性定形內胚層細胞向PDX 1_陽性前腸內胚層細胞分化的因子的鑒定
本發明的其他方面涉及鑒定一種或多種能夠促進rox1-陰性定形內胚層細胞向PDX1-陽性前腸內胚層細胞分化的分化因子的方法。在這類方法中，獲得包含rox1-陰性定形內胚層細胞的細胞培養物或細胞群，并測定細胞培養物或細胞群中roxi的表達。在測定roxi表達后，使細胞培養物或細胞群的細胞與候選分化因子接觸。在一些實施方案中，在使細胞與候選分化因子接觸時或與候選分化因子接觸后不久檢測roxi的表達。然后在使細胞與候選分化因子接觸后的一個或多個時間點檢測roxi表達。與接觸候選分化因子前的roxi的表達相比，如果在接觸候選分化因子后roxi的表達增加，候選分化因子可被鑒定為能夠促進rox1-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞的分化。一些實施方案中，上述鑒定能夠促進rox1-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞分化的分化因子的方法還包括測定細胞培養物或細胞群中H0XA13和/或H0XC6基因的表達。在這類實施方案中，在使細胞與候選分化因子接觸前后分別測定H0XA13和/或H0XC6基因的表達。與接觸分化因子前I3DXl和H0XA13的表達相比，如果在接觸候選分化因子后，PDXl和H0XA13的表達增加，就可鑒定候選分化因子能夠促進TOXl-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞的分化。相似地，與接觸分化因子前比較，如果在接觸候選分化因子后，PDXl和H0XC6的表達增加，就可鑒定候選分化因子能夠促進PDX1-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞的分化。在優選的實施方案中，通過在使細胞培養物或細胞群的細胞與候選分化因子接觸前后分別測定PDX1、H0XA13和H0XC6的表達來鑒定可以促進rox1-陰性定形內胚層細胞向rox1-陽性前腸內胚層細胞分化的候選分化因子。優選實施方案中，用Q-PCR檢測PDX1、H0XA13和H0XC6的表達。應了解在一些實施方案中，在使細胞培養物或細胞群中的細胞與候選分化因子接觸時或在接觸候選分化因子后不久檢測PDX1、HOXA13和H0XC6中一種或多種的表達，而不是在細胞接觸候選分化因子之前檢測。在這類實施方案中，將在使細胞與候選分化因子接觸時或在接觸候選分化因子后不久I3DXl、H0XA13和H0XC6中的一種或多種的表達與在細胞接觸候選分化因子后的一個或多個時間點的Η)Χ1、Η0ΧΑ13和H0XC6中的一個或多個表達進行比較。在上述方法的一些實施方案中，在細胞與候選分化因子接觸后檢測roxi表達的一個或多個時間點的范圍可以從 約I小時至約10天。例如，可以在細胞與候選分化因子接觸后約I小時、細胞與候選分化因子接觸后約2小時、細胞與候選分化因子接觸后約4小時、細胞與候選分化因子接觸后約6小時、細胞與候選分化因子接觸后約8小時、細胞與候選分化因子接觸后約10小時、細胞與候選分化因子接觸后約12小時、細胞與候選分化因子接觸后約16小時、細胞與候選分化因子接觸后約24小時，細胞與候選分化因子接觸后約2天、細胞與候選分化因子接觸后約3天、細胞與候選分化因子接觸后約4天、細胞與候選分化因子接觸后約5天、細胞與候選分化因子接觸后約6天、細胞與候選分化因子接觸后約7天、細胞與候選分化因子接觸后約8天、細胞與候選分化因子接觸后約9天、細胞與候選分化因子接觸后約 ο天或細胞與候選分化因子接觸后超過 ο天檢測roxi的表達。用于此處描述的方法的候選分化因子可以選自化合物，例如多肽和小分子。例如，候選多肽包括但不限于生長因子、細胞因子、趨化因子、胞外基質蛋白和合成肽。在優選的實施方案中，生長因子來自FGF家族，例如FGF-10。候選小分子包括但不限于從組合化學合成的化合物和天然產物，例如類固醇、類異戊二烯、萜類化合物、類苯基丙烷(phenylpropanoid)、生物堿類和類黃酮。本領域技術人員應了解有數千種天然和合成的小分子可以利用，預期可用于此處描述的方法的小分子不限于以上舉例的種類。代表性地，小分子的分子量低于10，000amu。在優選的實施方案中，小分子是類視黃醇，例如RA。能夠促進PDXl-陽性前腸內胚層細胞分化的因子的鑒定本發明的其他方面涉及鑒定一種或多種能夠促進rox1-陽性前腸內胚層細胞分化的分化因子的方法。在這類方法中，獲得包含rox1-陽性前腸內胚層細胞的細胞培養物或細胞群，并測定細胞培養物或細胞群中標志物的表達。在測定標志物的表達后，使細胞培養物或細胞群的細胞與候選分化因子接觸。在一些實施方案中，在使細胞與候選分化因子接觸時或在接觸候選分化因子后不久檢測標志物的表達。然后在細胞與候選分化因子接觸后的一個或多個時間點檢測相同標志物的表達。與接觸分化因子前比較，如果在接觸候選分化因子后，標志物的表達增加或降低，就可鑒定候選分化因子能夠促進rox1-陽性前腸內胚層細胞的分化。在優選的實施方案中，用Q-PCR檢測標志物的表達。在上述方法的一些實施方案中，在使細胞與候選分化因子接觸后檢測標志物表達的一個或多個時間點的范圍可以從約I小時至約10天。例如，可以在使細胞與候選分化因子接觸后約I小時、使細胞與候選分化因子接觸后約2小時，使細胞與候選分化因子接觸后約4小時，使細胞與候選分化因子接觸后約6小時，使細胞與候選分化因子接觸后約8小時，使細胞與候選分化因子接觸后約10小時，使細胞與候選分化因子接觸后約12小時，使細胞與候選分化因子接觸后約16小時,使細胞與候選分化因子接觸后約24小時,使細胞與候選分化因子接觸后約2天，使細胞與候選分化因子接觸后約3天，使細胞與候選分化因子接觸后約4天，使細胞與候選分化因子接觸后約5天，使細胞與候選分化因子接觸后約6天，使細胞與候選分化因子接觸后約7天，使細胞與候選分化因子接觸后約8天，使細胞與候選分化因子接觸后約9天，使細胞與候選分化因子接觸后約10天或使細胞與候選分化因子接觸后超過10天檢測標志物的表達。如前面所述，用 于此處描述的方法的候選分化因子可以選自例如多肽或小分子的化合物。盡管此處公開的每種方法都關于rox1-陽性前腸內胚層細胞，應了解在某些實施方案中，該方法可用于產生包含此處描述的rox1-陽性前腸/中腸內胚層細胞和/或此處描述的前腸后部的rox1-陽性內胚層細胞的組合物。此外，本說明書中公開的任何rox1-陽性內胚層細胞類型都可用在此處描述的篩選方法中。以上概括描述了本發明，可通過參照此處提供的某些具體實施例進一步理解本發明，這些實施例僅是為了說明而不是限制本發明。
實施例以下很多實施例描述了人多能性細胞的使用。產生人多能性細胞的方法在現有技術中是公知的，在許多科學出版物中都有描述，包括第5，453，357,5, 670, 372,5, 690, 926、6，090，622,6, 200，806和6，251，671號美國專利及
發明者凱文·艾倫·達穆爾, 艾倫·D·阿古尼克, 蘇珊·埃利澤, 伊曼紐爾·E·貝特格 申請人:韋爾賽特公司