專利名稱：一種銅綠假單胞菌用培養基的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物培養技術領域，涉及一種微生物培養基，特別是涉及一種用于培養銅綠假單胞菌的培養基。
背景技術：
含酚廢水是一種污染范圍廣，排放數量多，危害農業生產、動植物生長繁殖的工業廢水，如不經處理而任意排放，則會威脅人類健康。苯酚攝入量到達一定值時，會引起急性中毒，具體表現為頭痛乏力、視線模糊、水腫等。目前國內外處理含酚廢水的方法主要有物理法、化學法和生物法。化學法和物理法處理酚類廢水較多，但普遍存在二次污染的問題。生物法，特別是利用微生物處理該類廢水是目前研究的熱點。有關苯酚降解菌和氯苯降解菌的研究已有文獻報道，具有降解功能的菌種主要有惡臭假單胞菌、根瘤菌、芽孢桿菌、棒桿菌、產堿桿菌和銅綠假單胞菌等，其中，銅綠假單孢·菌對苯酚的耐受性和降解效果相對較好。目前，關于銅綠假單孢菌的研究比較多，但存在微生物生長緩慢，降解作用時間較長，微生物耐受性較低的問題。上述問題的本質是微生物數量少，培養條件差造成的。其原因是現在針對培養基的研究主要集中在菌種生長所需碳源、氮源和無機鹽等常規營養元素上，并未考慮到培養基中假單孢菌生長過程中所需要的限制成份。

發明內容
本發明的目的是提供一種銅綠假單胞菌用培養基，以本發明的培養基培養出的銅綠假單胞菌培養時間快，生長速度快、菌株耐受性高，適應能力強。每IOOOmL本發明的銅綠假單胞菌用培養基中，各組分的含量分別為
葡萄糖7 IOg,尿素2 4g,磷酸氫二鉀2 3g,磷酸二氫鉀O. 5 2g,硫酸鎂O. 5
1.5g,氯化鈉3 5g,微量兀素和生長因子溶液I 3mL,去尚子水余量。其中，所述的微量元素和生長因子溶液中含MnCl2 3. 5 4. 5mmol/L，MoS04 2. O
2.8mmol/L, FeSO4 3. 6 4. 6mmol/L,嘿呤喊 10 20mmol/L, VB2 18 23mmol/L,乙酸胺12 20mmol/L。本發明制備得到的培養基的pH值范圍調節為6. 5 7. 5。進一步地，每IOOOmL本發明的銅綠假單胞菌用培養基中，各組分的含量分別為 葡萄糖7. 5 9. 5g,尿素3. O 4. Og,磷酸氫二鉀2. 5 2. 9g,磷酸二氫鉀O. 5 I. 2g,
硫酸鎂O. 7 I. Ig,氯化鈉3. 5 4. 5g，微量元素和生長因子溶液lmL，去離子水余量。優選地，每IOOOmL本發明的銅綠假單胞菌用培養基中含有葡萄糖Sg，尿素3. 5g，磷酸氫二鉀2. 84g，磷酸二氫鉀O. 96g，硫酸鎂lg，氯化鈉5g，微量元素和生長因子溶液lmL，去離子水余量。將銅綠假單胞菌株接入本發明的培養基，于27 32°C，搖床轉速90 120r/min下培養24 36h，即可得到高濃度銅綠假單孢菌液。
本發明根據銅綠假單胞菌的生理特性，篩選配制出了適合于銅綠假單胞菌生長的培養基，并在培養基中引入了 Mn2+，Mo2+，Fe2+，嘌呤堿，VB2,乙酰胺等微量元素和生長因子。其中，無機鹽有助于促進苯酚降解相關酶類的合成和提高其酶活，促進微生物的生長速率，提高微生物對苯酚的降解效率，而嘌呤堿、乙酰胺和VB2能夠促進細胞的生長和分裂。本發明提供的培養基為銅綠假單胞菌提供了優良的生長環境，經本發明培養基培養的銅綠假單胞菌培養時間短，可在24h內達到較高濃度(0D值達I. 2以上)，在自然條件下適應能力強，具有較高的活力及苯酚降解能力，對苯酚的降解效率達96%以上，對氯苯的降解效率達93%以上。同時還具有較高的苯酚耐受性。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步說明本發明。但不能將實施例理解為是對本發明保護范圍的限制，本領域技術人員根據其內容對本發明進行的一些非本質的改進和調整，仍應屬于本發明的保護范圍。·實施例I
分別稱取 MnCl2 O. 48g，MoSO4 O. 44g，FeSO4 O. 6g，嘌呤堿 I. 4g，VB2 7. 36g，乙酰胺
I.12g，加入IOOOmL去離子水中，充分溶解完全，得到微量元素和生長因子溶液。取葡萄糖7. 6g，尿素3. 3g，磷酸氫二鉀2. 64g，磷酸二氫鉀O. 86g，硫酸鎂lg，氯化鈉4. 5g，微量元素和生長因子溶液lmL，加去離子水攪拌溶解完全后，以去離子水補足至lOOOmL，并調節培養基的pH值范圍為6. 5 7. 5，得到銅綠假單胞菌用培養基。實施例2
分別稱取 MnCl2 O. 52g，MoSO4 O. 5g，FeSO4 O. 63g，嘌呤堿 2. 35g，VB2 8. 38g，乙酰胺0.81g，加入IOOOmL去離子水中，充分溶解完全，得到微量元素和生長因子溶液。取葡萄糖Sg，尿素3. 5g，磷酸氫二鉀2. 78g，磷酸二氫鉀O. 72g，硫酸鎂O. 7g，氯化鈉4. lg，微量元素和生長因子溶液lmL，加去離子水攪拌溶解完全后，以去離子水補足至lOOOmL，并調節培養基的pH值范圍為6. 5 7. 5，得到銅綠假單胞菌用培養基。實施例3
分別稱取 MnCl2 0. 55g，MoSO4 0. 48g，FeSO4 0. 58g，嘌呤堿 I. 95g，VB2 6. 93g，乙酰胺0. 99g，加入IOOOmL去離子水中，充分溶解完全，得到微量元素和生長因子溶液。取葡萄糖9. 3g，尿素3. 8g，磷酸氫二鉀2. 84g，磷酸二氫鉀0. 96g，硫酸鎂0. 8g，氯化鈉3. 6g，微量元素和生長因子溶液lmL，加去離子水攪拌溶解完全后，以去離子水補足至lOOOmL，并調節培養基的pH值范圍為6. 5 7. 5，得到銅綠假單胞菌用培養基。應用例I
I、采集太原焦化廠溫度為23 26°C的污水水樣。2、取上述水樣lmL，加入到IOOmL牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于30°C、100r/min的恒溫搖床上振蕩培養24h。取培養物ImL,轉移到新鮮的同樣牛肉膏蛋白胨培養基中，于30°C、100r/min的恒溫搖床上振蕩重復培養24h，得到富集培養液。3、移取ImL上述富集培養液,轉接入含2mmol/L苯酹和lmmol/L氯苯的新鮮牛肉膏蛋白胨培養基中，在溫度30°C下培養48h后，逐步提高苯酚濃度(依次為4、8、12、16mmol/L)和氯苯濃度(2、3、4、5mmol/L)以及培養時間，進行重復培養，對菌種進行馴化，得到馴化培養液。4、在無菌條件下,用接種環蘸取上述苯酹濃度為16mmol/L和氯苯濃度為5mmol/L時的馴化培養液，在含苯酚的牛肉膏蛋白胨固體培養基上劃線分離，于30°C恒溫培養箱中培養72h后，得到獨立的典型菌落，將純化后的單一菌落的菌株接種至斜面培養基上培養48h后，保存于4°C冰箱中。5、將菌種接入實施例I提供的培養基中，27 32°C下，搖床轉速90 120r/min培養24 36h (對數期)，得到菌種，較平均培養時間縮短6 12h。6、取上述菌種5mL (0D值O. 8),加入到含苯酌· 8mmol/L、氯苯3mmol/L的IOOmL溶液中，30°C下，95r/min搖床振蕩培養72h后測定苯酚和氯苯含量。經測定，苯酚降解率為97. 2%，氯苯降解率為93. 5%。7、將上述菌種按伯杰氏手冊進行菌種分類鑒定，經初步鑒定，該菌種為銅綠假單 胞菌。應用例2
I、采集太鋼焦化廠的污水水樣，采樣時污水溫度為22°C。2、取上述水樣lmL，加入到IOOmL牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于28°C、100r/min的恒溫搖床上振蕩培養24h。取培養物Iml,轉移到新鮮的同樣牛肉膏蛋白胨培養基中，于30°C、100r/min的恒溫搖床上振蕩重復培養24h，得到富集培養液。3、移取Iml富集培養液，轉接入含2mmol/L苯酹和lmmol/L氯苯的新鮮牛肉膏蛋白胨培養基中，在溫度30°C下培養48h后，逐步提高苯酚濃度(依次為4、8、12、16mmol/L)和氯苯濃度(2、3、4、5mmol/L)以及培養時間，進行重復培養，對菌種進行馴化，得到馴化培養液。4、在無菌的條件下，用接種環蘸取上述苯酚濃度為18mmol/L和氯苯濃度為4mmol/L時的馴化培養液，在含苯酚的牛肉膏蛋白胨固體培養基上劃線分離，于30°C恒溫培養箱中培養72h后，得到獨立的典型菌落，將純化后的單一菌落的菌株接種至斜面培養基上培養48h后，保存于4°C冰箱中。5、將菌種接入實施例2提供的培養基中，28 32°C下，搖床轉速100 120r/min培養24 32h (對數期)，得到菌種，較平均培養時間縮短8 12h。6、取上述菌種5mL (0D值I. I)，加入到含苯酌· 10mmol/L、氯苯5mmol/L的IOOml溶液中，30°C下，100r/min搖床振蕩培養72h，經測定，苯酚降解率為96. 6%，氯苯降解率為93. 3%。7、將上述菌種按伯杰氏手冊進行菌種分類鑒定，經初步鑒定，該菌種為銅綠假單胞菌。
權利要求
1.一種銅綠假單胞菌用培養基，每IOOOmL培養基中含有 葡萄糖7 IOg,尿素2 4g,磷酸氫二鉀2 3g,磷酸二氫鉀O. 5 2g,硫酸鎂O. 5 1.5g,氯化鈉3 5g,微量兀素和生長因子溶液I 3mL,去尚子水余量； 其中，所述的微量元素和生長因子溶液中含MnCl2 3. 5 4. 5mmol/L，MoSO4 2. O 2.8mmol/L, FeSO4 3. 6 4. Bmmol /I,,嘿呤喊 10 20mmol/L, VB2 18 23mmol/L,乙酸胺12 20mmol/L ； 調節培養基的PH值范圍為6. 5 7. 5。
2.根據權利要求I所述的銅綠假單胞菌用培養基，每IOOOmL培養基中各組分的含量分別為葡萄糖7. 5 9. 5g,尿素3. O 4. Og,磷酸氫二鉀2. 5 2. 9g,磷酸二氫鉀O. 5 ·I.2g，硫酸鎂O. 7 I. lg，氯化鈉3. 5 4. 5g，微量元素和生長因子溶液lmL，去離子水余量。
3.根據權利要求I所述的銅綠假單胞菌用培養基，每IOOOmL培養基中各組分的含量分別為葡萄糖Sg，尿素3. 5g，磷酸氫二鉀2. 84g，磷酸二氫鉀O. 96g，硫酸鎂lg，氯化鈉5g，微量兀素和生長因子溶液ImL,去尚子水余量。
全文摘要
一種銅綠假單胞菌用培養基，每1000mL培養基中含有葡萄糖7～10g，尿素2～4g，磷酸氫二鉀2～3g，磷酸二氫鉀0.5～2g，硫酸鎂0.5～1.5g，氯化鈉3～5g，微量元素和生長因子溶液1～3mL，去離子水余量，其中微量元素和生長因子溶液中含MnCl23.5～4.5mmol/L，MoSO42.0～2.8mmol/L，FeSO43.6～4.6mmol/L，嘌呤堿10～20mmol/L，VB218～23mmol/L，乙酰胺12～20mmol/L。本發明提供的培養基為銅綠假單胞菌提供了優良的生長環境，使用本發明培養基培養銅綠假單胞菌培養時間快，菌株耐受性高，適應能力強，對苯酚的降解效率達96%以上，對氯苯的降解效率達93%以上。
文檔編號C12N1/20GK102888377SQ201210432198
公開日2013年1月23日 申請日期2012年11月2日 優先權日2012年11月2日
發明者賈萬利, 李穎, 趙文英 申請人:中北大學