專利名稱：一株銅綠假單胞菌及其獲取方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程，特別涉及一株可高效分解石油類物質的銅綠假單胞菌及其獲取方法與應用。技術背景
隨著世界對石油及其制品需求的日益增長，在石油的開采、運輸、裝卸及利用過程中的溢油事故也日漸增多。溢油不僅造成了嚴重的環境污染，并且由于石油中烴類污染物的潛在毒性和生物累積效應會導致環境質量和生物種類多樣性的嚴重下降，破壞生態系統的功能，造成惡性的環境破壞與巨大的經濟損失。此外，石油中的多環芳烴類化合物具有強烈的致畸、致癌和致突變效應，可通過食物鏈進入生物體與人體，具有生物累積效應，對生物和人的健康造成潛在的危害。因此，研究石油污染的控制與修復問題可保持生態系統的良性循環，保障人民的身體健康，促進經濟和社會的可持續發展。
目前，石油污染土壤的修復方法主要包括物理法、化學法及生物法。比較而言，生物法具有物理法和化學法不可比擬的優勢。首先是生物法的處理費用低，其處理成本大約只有物化方法的三分之一；其次是生物法的修復操作簡單，可實現原位直接修復；再次，生物法修復對環境的二次污染小。生物修復法包括動物修復、植物修復及微生物修復；這三種方法中由于微生物資源豐富、易于培養、對環境的耐受性較強，因此，微生物修復被認為具有廣闊的應用前景。
微生物修復技術的關鍵是從環境中篩選出可高效降解石油污染物的微生物，效率高且周期短。在被石油長期污染的環境中，存在大量的石油降解菌，可從中篩選出高效的石油降解菌株。發明內容
本發明的目的，是提供一株銅綠假單胞菌及其獲取方法與應用，該銅綠假單胞菌株可穩定高效地分解多種石油類物質，可有效地用于環境中石油污染物的生物降解與環境修復。
本發明所提供的銅綠假單胞菌SJTD-I來源于大慶油田的石油長期污染土壤中， 經過人工富集、篩分及純化所得。SJTD-I菌落呈圓形，隆起，菌落呈黃綠色，透明，邊緣無規則擴散，產生熒光色素，革蘭氏染色呈陰性，直或彎的桿菌，單個，無芽孢，好氧，30°C下生長良好，有惡臭氣味。經對該菌株的16S rDNA的鑒定與序列分析，表明該菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。該銅綠假單胞菌SJTD-1菌株已于2012年9月19日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號) 保藏，登記入冊編號為CGMCCNo. 6584。
為了實現本發明的目的，本發明采用了以下技術方案
一株銅綠假單胞菌，命名為SJTD-I，其保藏編號為CGMCC No. 6584。
上述銅綠假單胞菌的16S rDNA片段的序列如SEQ ID NO. I所示。
上述銅綠假單胞菌的獲取方法，包括以下步驟
A、采集被石油長期污染土壤作為微生物源；
B、以石油為單一碳源,制備含有500mg/L石油的IOOmL BSM無機培養基,用鹽酸調 pH 值至 7. 0-7. 2，121°C 滅菌 20min ；
C、待培養基溫度降低到30°C左右時，按照3%的土壤接種量在超凈臺下接種；
D、30°C、180rpm的恒溫搖床培養箱中進行富集培養；
E、重復培養七次后，在固體培養基平板上反復劃線培養，直至分離出單菌株，之后再將菌株接種入上述無機培養基內馴化，上述操作重復多次，得到純化的銅綠假單胞菌菌株，命名為SJTD-I。
上述銅綠假單胞菌的獲取方法，其中，所述BSM無機培養基的無機成分及濃度如下Κ2ΗΡ04，0· 5g/L ;ΚΗ2Ρ04，3· 815g/L ； (NH4) 2HP04,0. 825g/L ；MgCl2 · 6H20，20mg/L ；FeCl3, 0. 2mg/L ；CaCl2, 2mg/L ；Na2S04, 200mg/L ；KN03,1. 2625g/L。
上述銅綠假單胞菌的應用，用于環境中石油類物質的分解與去除。
上述銅綠假單胞菌的應用，其中，所述石油類物質包括Cltl-C3tl的烷烴和石油。
本發明的SJTD-I菌株可在濃度高達10g/L的石油及烷烴類物質為唯一碳源的培養基中正常生長，24小時內能將初始濃度為500mg/L的C16-C2q的長鏈烷烴和石油完全分解，36小時可將高達2g/L的C16-C2tl的長鏈烷烴和500mg/L原油全部分解；七天對5g/L的原油的分解率大于85%。
依據本發明，由于銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株具有高效降解石油類物質的特性，可應用于含有石油類物質的環境治理與土壤修復。本發明與現已發現的石油降解菌株相比，其降解效率顯著提高，降解周期明顯縮短。


圖I為本發明的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株的平板劃線圖2為本發明的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株以不同濃度 (■ 100mg/L ；· 250mg/L ；▲ 500mg/L ；ψ lg/L ； 2g/L)的 C14 為單一碳源時菌株的生長曲線.
圖3為本發明的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株以不同濃度 (■ 100mg/L ；· 250mg/L ；▲ 500mg/L ；ψ lg/L ； 2g/L)的 C16 為單一碳源時菌株的生長曲線.
圖4為本發明的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株以不同濃度 (■ 100mg/L ；· 250mg/L ；▲ 500mg/L ；ψ lg/L ； 2g/L)的 C18 為單一碳源時菌株的生長曲線.
圖5為本發明的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株以不同濃度 (■ 100mg/L ；· 250mg/L ；▲ 500mg/L ；ψ lg/L ； 2g/L)的 C20 為單一碳源時菌株的生長曲線.
圖6為本發明的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株對不同濃度 (■ 250mg/L ；· 500mg/L ；▲ lg/L ；ψ 2g/L)的十六焼的降解曲線；頁
圖7為本發明的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-I菌株對5g/L原油的降解曲線。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的描述，但本發明的實施不局限于此。
一、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株的獲取與保藏
采集大慶油田的石油長期污染土壤作為微生物源，冷藏運回實驗室。制備含有 500mg/L石油的BSM無機培養基，按照3%的土壤接種量接種于含有IOOmL上述無機培養基的500mL三角瓶中，(所述BSM無機培養基的無機成分及濃度如下=K2HPO4,0. 5g/L ; ΚΗ2Ρ04，3· 815g/L ； (NH4) 2ΗΡ04，0. 825g/L ；MgCl2 · 6H20，20mg/L ；FeCl3,0. 2mg/L ；CaCl2, 2mg/ L ;Na2S04，200mg/L ;KN03，1. 2625g/L。)鹽酸調 pH 值為 7. 0_7. 2，高壓滅菌鍋 121 °C 滅菌 20min。待培養基溫度降低到30°C左右時，在超凈臺下接種。污泥接種后在30°C、180rpm的恒溫搖床培養箱中進行富集培養。重復培養七次后，在固體培養基平板(瓊脂20. 0g/L)上反復劃線培養，直至分離出單菌株。之后再將菌株接種入上 述無機培養基內馴化，上述操作重復多次，得到純化的可降解石油類物質的SJTD-I菌株，平板劃線圖如圖I所示。SJTD-I菌落呈圓形，隆起，菌落呈黃綠色，透明，邊緣無規則擴散，產生熒光色素，革蘭氏染色呈陰性， 直或彎的桿菌，單個，無芽孢，好氧，30°C下生長良好，有惡臭氣味。經對該菌株的16S rDNA 的鑒定與序列分析，表明該菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。該銅綠假單胞菌SJTD-I菌株已于2012年9月19日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號)保藏，登記入冊編號為CGMCC No. 6584。
二、銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa SJTD-1 菌株的鑒定
將分離出的SJTD-I菌株進行16S rDNA序列的擴增、序列測定與數據庫比對。利用基因組提取試劑盒(TIANGEN，北京)提取SJTD-I菌株的基因組DNA，之后，利用16S rDNA 片段擴增與檢測試劑盒(Takara，大連)擴增該菌株的16S rDNA片段并測定序列。SJTD-I 菌株的 16S rDNA 序列如 SEQ ID NO. I 所不。與 NCBI 數據庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)比對,表明該SJTD-I菌株為銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa,菌株為無芽孢桿菌，單個，屬革蘭氏陰性菌，嚴格好氧，化能異養。
三、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株對石油類物質(長鏈燒烴和石油)的降解能力
將Pseudomonas aeruginosa SJTD-1菌株劃固體培養基平板,30°C過夜培養。挑取單克隆，分別接種于以500mg/L-5g/L的長鏈烷烴(C14、C16、C18、Cj和石油為唯一碳源的液體培養基中，30°C，120rpm恒溫振蕩培養箱中培養7天。采集不同時間點的2個3ml平行樣品，一個樣品利用紫外分光光度儀(UV-2100spectrophotometer, Unic)測定600nm吸光度值用以表示微生物生長情況，(其中，以C14、C16, C18, C20為單一碳源時菌株的生長曲線如圖2至圖5所示。)另一個樣品中加入1/6體積正己烷(HPLC純)混勻，超聲5min，3000g 離心5min，取上層有機相；重復兩次，合并萃取液。加入無水Na2SO4混合，加內標正十五烷 (終濃度100ng/ul)后定容到3ml。采用氣相色譜(GC，Agilent 6850)測定石油烴濃度，色譜柱為DB-5MS capillary柱(0. 25mmX30mX0. 25 μ m)。不同十六燒濃度測定結果見圖6, 不同原油濃度測定結果見圖7。SJTD-I菌株可在高達10g/L的石油及烷烴類物質為唯一碳5源的培養基中正常生長，24小時內能將初始濃度為500mg/L的C16-C2tl的長鏈烷烴和石油完全分解，36小時可將高達2g/L的C14、C16, C18, C20的長鏈烷烴和500mg/L石油全部分解；七天對5g/L的原油的分解率大于85%。
序列表
〈110〉上海交通大學
〈120〉一株銅綠假單胞菌及其獲取方法與應用
〈160〉I
<170>PatentIn version
〈210〉I
〈211>1509
<212>DNA
〈213〉銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) SJTD-116S rDNA 序列

<400>1 tgggtttgatcttggttagattgacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcgg60
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ggacggttaccacggagtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtagtc1500
gtgactgga1509
權利要求
1.一株銅綠假單胞菌菌株，命名為SJTD-I，其保藏編號為CGMCC No. 6584。
2.根據權利要求I所述的銅綠假單胞菌，其特征在于，所述銅綠假單胞菌的16SrDNA片段的序列如SEQ ID NO. I所示。
3.根據權利要求I所述的銅綠假單胞菌的獲取方法，其特征在于，包括以下步驟 A、采集被石油長期污染的土壤作為微生物源； B、以石油為單一碳源，制備含有500mg/L石油的IOOmLBSM無機培養基，用鹽酸調pH值至 7. 0-7. 2，121°C 滅菌 20min ； C、待培養基溫度降低到30°C左右時，按照3%的土壤接種量在超凈臺下接種； D、30°C、180rpm的恒溫搖床培養箱中進行富集培養； E、重復培養七次后，在固體培養基平板上反復劃線培養，直至分離出單菌株，之后再將菌株接種入上述無機培養基內馴化，上述操作重復多次，得到純化的銅綠假單胞菌菌株，命名為 SJTD-I。
4.根據權利要求3所述的銅綠假單胞菌的獲取方法，其特征在于所述BSM無機培養基的無機成分及濃度如下=K2HPO4,0. 5g/L ；KH2P04, 3. 815g/L ； (NH4) 2HP04,0 . 8 2 5g/L ；MgCl2 · 6H20, 20mg/L ；FeCl3,0. 2mg/L ；CaCl2, 2mg/L ；Na2S04, 200mg/L ；KN03,1. 2625g/L。
5.根據權利要求I所述的銅綠假單胞菌的應用，用于環境中石油類物質的分解與去除。
6.根據權利要求5所述的銅綠假單胞菌的應用，其特征在于所述石油類物質包括C10-C30的燒烴和石油。
全文摘要
本發明提供了一株銅綠假單胞菌菌株，命名為SJTD-1，其保藏編號為CGMCCNo.6584。本發明中的銅綠假單胞菌能利用烷烴類物質、石油作為唯一碳源生長，在石油污染土壤的修復中具有較高的應用價值。菌株SJTD-1可在濃度高達10g/L的石油及烷烴類物質為唯一碳源的培養基中正常生長，24小時內能將初始濃度為500mg/L的C16-C20的長鏈烷烴或石油完全分解，36小時可將高達2g/L的C16-C20的長鏈烷烴或500mg/L原油全部分解；七天對5g/L的原油的分解率大于85％。本發明銅綠假單胞菌SJTD-1能夠快速高效降解石油，對石油污染的土壤具有修復作用。
文檔編號C12N1/20GK102925391SQ20121043666
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月5日 優先權日2012年11月5日
發明者梁如冰, 劉建華 申請人:上海交通大學