專利名稱：用于鑒定小麥春化基因vrn-a1的pcr體系的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于鑒定或輔助鑒定小麥春化基因VRN-Al的PCR體系及其應用， 特別涉及一種用于鑒定或輔助鑒定小麥春化基因VRN-Al的多重PCR引物對組、試劑盒及其應用。
背景技術：
春化階段是小麥生長發育的基本階段之一。小麥的春化反應與其生育期及適應性密切相關，是指導小麥區劃和新品種推廣的主要依據之一，受春化基因控制。春化基因決定小麥全生育周期長短的7(T75%。Iwaki和Van Beem等研究表明，世界不同地區小麥品種的春化基因組成存在差異，反映了不同生態類型對品種春化反應的要求不同。
春化基因VRN-I編碼的蛋白為MADS-box轉錄因子，受低溫誘導促進開花，是普通小麥春化作用的一類主要基因，包括3個位點VRN-A1、VRN-Bl和VRN-D1，分別位于5A、5B 和5D染色體長臂上。3個基因位點不同的等位變異對春化作用的效應不同，顯性等位變異 Vm-Al的效應最強，表現為對春化作用高度不敏感，同時對Vrn-Bl和Vrn-Dl位點基因具有上位性效應；顯性等位變異Vrn-Bl和Vrn-Dl對春化作用的敏感性較弱，兩者之間未發現彼此間的上位作用。Yan和Fu等發現，VRN-I春化基因變異類型受其啟動子區和第一個內含子區決定。在普通小麥中，VRN-Al位點有4種變異類型，分別為Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和 vrn-Al，其中 Vrn-Ala、Vrn-Alb 和 Vrn-Alc 表現為顯性，vrn-Al 為隱性；VRN_B1 和 VRN-Dl 位點一般通常存在兩種等位變異類型，即顯性和隱性等位變異。與隱性等位變異類型相比， 顯性等位變異Vrn-Ala和Vrn-Alb分別在啟動子區域插入和缺失了一定數量的堿基序列， 而顯性Vrn-Alc、Vrn-Bl和Vrn-Dl在第一個內含子序列出現了大片段堿基的缺失。
在普通小麥中，VRN-Al位點存在4種等位變異，需要用3對引物分別進行3次PCR 檢測；VRN-B1和VRN-Dl位點兩種等位變異，需要用兩對引物分別進行兩次PCR檢測。為此， 檢測I個小麥材料春化基因VRN-I的3個位點等位變異組成，需要連續進行7次PCR檢測， 檢測程序繁瑣，實驗成本高。
多重PCR這一概念自1988年由Chambercian等提出后，由于其快速、高效、低成本等一系列的優點，使得這項技術在生命科學領域得到了廣泛的應用，如植物種質純度鑒定、 植物分子育種、植物病蟲害檢測等。利用多重PCR技術，在同一個PCR反應體系中加入兩對或兩對以上特異性引物進行擴增，可以同時檢測出多個等位變異類型，降低檢測成本，提高效益。發明內容
本發明的目的是提供用于鑒定或輔助鑒定待測小麥春化基因的多重PCR引物對組、試劑盒，以及利用所述多重PCR引物對組鑒定或輔助鑒定待測小麥春化基因的方法。
本發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定待測小麥春化基因的多重PCR引物對組，由特異于所述VRN-Al基因的兩個引物對組成；
所述特異于VRN-Al基因的兩個引物對分別為序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對1，以及序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2。
其中，序列I由20個核苷 酸組成；序列2由20個核苷酸組成；序列3由20個核苷酸組成；序列4由20個核苷酸組成。
本發明中，所述VRN-Al基因有四個等位基因，分別是Vrn-Ala、Vrn-Alb, Vrn-Alc 和vrn-Al (前三個表現為顯性,最后一個表現為隱性)。
所述引物對組中，所述序列I、所述序列2、所述序列3和所述序列4共四條單鏈 DNA在PCR反應體系中的摩爾比為I I. 5 Γ . 5 Γ . 5 Γ .。
在本發明的一個實施例中，所述引物對組中，所述序列I、所述序列2、所述序列3 和所述序列4共四條單鏈DNA在PCR反應體系中的摩爾比為I :1 :1 :1。
含有所述引物對組的試劑盒也屬于本發明的保護范圍。
所述引物對組的制備方法也屬于本發明的保護范圍。
該引物對組的制備方法可包括將所述引物對組中各序列所示單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
所述試劑盒的制備方法也屬于本發明的保護范圍。
該試劑盒的制備方法可包括如下步驟將所述引物對組中各序列所示單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種包裝在同一試劑盒內PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
鑒定或輔助鑒定待測小麥含有Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn-Al這四種基因中哪一種的方法也屬于本發明的保護范圍。
該方法具體可包括如下(I)和(2)步驟
(I)以待測小麥的基因組DNA為模板，用所述引物對組中的所述引物對組A進行 PCR反應，所述PCR反應的退火溫度為60°C ；
(2)檢測步驟(I)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測小麥含有Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn-Al這四種基因中哪一種
若所述PCR產物中同時含有715bp和624bp的兩個DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有Vrn-Ala基因；若所述PCR產物中含有473bp的DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有Vrn-Alb基因；若所述PCR產物中含有493bp的DNA片段、同時不含有1068bp 的DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有Vrn-Alc基因；若所述PCR產物中同時含有 493bp和1068bp的兩個DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有vrn-Al基因。
本發明的再一個目的是提供一種培育春性小麥品種的方法。所述春性小麥品種通過春化階段時對溫度要求范圍較寬，經歷時間也較短。一般在秋播地區要求O 12°C，北方春播地區要求在O 20°C，經過15天的時間可以通過春化階段。培育春性小麥品種的方法具體可包括采用含有Vrn-Ala基因、Vrn-Alb基因和Vrn-Alc基因中至少一種的小麥作為親本進行育種的步驟。
從眾多小麥品種中選擇滿足上述條件的小麥的方法，即為上述鑒定或輔助鑒定待測小麥含有Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn-Al這四種基因中哪一種的方法。
本發明根據春化基因VRN-Al的STS標記，基于目標基因組成已知材料的驗證結果，分別建立檢測春化基因位點VRN-Al等位變異的多重PCR體系，以期為春化基因VRN-Al的快速檢測提供更加簡便、準確的方法。本發明所提供的PCR引物對組中各引物對之間不存在相互抑制作用和錯配，檢測品種的結果可靠、重復性好，成本低。本發明所提供的PCR 引物對組中的各引物對均選用同樣的退火溫度，實現了相同溫度一次PCR完成一組基因的鑒別，且特異性強，檢測過程耗時短。本發明對檢測小麥品種的冬春性，進而提高育種的效率，加強對育種高代的選擇具有重要意義；另外，本發明使得在小麥推廣和引種過程中，有更強的目標性。


圖I為12個小麥品種春化基因VRN-I的位點VRN-Al的多重PCR擴增圖譜。其中， 泳道M為標準分子量DL2000 ;泳道I為新春16 ;泳道2為龍輻麥I號；泳道3為中國春；泳道4為北京10號；泳道5為甘麥8號；泳道6為大白皮；泳道7為龍輻麥3號；泳道8為遼春10號；泳道9為龍麥20 ;泳道10為皖麥33 ;泳道11為寧春37 ;泳道12為德麥3號。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
本發明所涉及的小麥品種新春16、龍輻麥I號、中國春、北京10號、甘麥8號、大白皮、龍福麥3號、遼春10號、龍麥20、院麥33、寧春37和德麥3號均為市面常售品種,均可從商業途徑獲得。
實施例I、小麥春化基因VRN-Al的多重PCR檢測
本實施例的多重PCR引物對組由特異于VRN-Al基因的兩個引物對組成。所述特異于VRN-Al基因的兩個引物對分別為序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對1，以及序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2。
本實施例的多重PCR引物對組可同時檢測VRN-Al基因位點的4種基因型，即三個顯性等位變異基因Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和一個隱性等位變異基因vrn-Al。含有 Vrn-Ala基因的材料，PCR同時擴增出715bp和624bp的兩個條帶；含有Vrn-Alb基因的材料，PCR擴增出473bp的條帶；含有Vrn-Alc基因的材料，PCR擴增出493bp的條帶，同時擴增不出1068bp的條帶；含有vrn-Al基因的材料，PCR同時擴增出493bp和1068bp的兩個條帶。
一、小麥春化基因VRN-Al的多重PCR擴增
I、小麥基因組的制備
采用CTAB法對12份已知基因型的小麥品種進行基因組DNA的提取，得到對應于 12份已知基因型的小麥品種的基因組DNA，作為春化基因VRN-Al多重PCR擴增的模板。其中，12份已知基因型的小麥品種為新春16、龍福麥I號、中國春、北京10號、甘麥8號、大白皮、龍輻麥3號、遼春10號、龍麥20、皖麥33、寧春37和德麥3號。Zhang等(Zhang X-K, Xiao Y-G. , Zhang Y,Xia X-Cj Dubcovsky Jj He Z-H. Allelic Variation at the Vernalization Genes Vrn-Alj Vrn-Blj Vrn-Dlj and Vrn_B3 in ChineseWheat Cultivars and Their Association with Growth Habit. Crop Science，2008，48:458-471.)披露了這 12 個小麥品種的春化基因VRN-I的基因位點VRN-Al的具體基因型，詳見表I。
表1已知基因型小麥品種春化基因VRN-1的基因位點VRN-A1的基因型
權利要求
1.用于鑒定或輔助鑒定待測小麥春化基因的多重PCR引物對組，所述小麥春化基因為VRN-Al基因，其特征在于所述多重PCR引物對組由特異于所述VRN-Al基因的兩個引物對組成； 所述特異于VRN-Al基因的兩個引物對分別為序列表中序列I和序列2所不的兩條單鏈DNA組成的引物對1，以及序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2。
2.根據權利要求I所述的引物對組，其特征在于所述序列I、所述序列2、所述序列3和所述序列4共四條單鏈DNA在PCR反應體系中的摩爾比為f I. 5 Γ . 5 Γ . 5 Γ . 5。
3.根據權利要求2所述的引物對組，其特征在于所述序列I、所述序列2、所述序列3和所述序列4共四條單鏈DNA在PCR反應體系中的摩爾比為I :1 :1 :1。
4.含有權利要求1-3中任一所述引物對組的試劑盒。
5.權利要求1-3中任一所述引物對組的制備方法，其特征在于所述制備方法包括將權利要求1-3中任一所述引物對組中各序列所示單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
6.權利要求4所述PCR試劑盒的制備方法，包括如下步驟將權利要求1-3中任一所述的引物對組中各序列所示單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種包裝在同一試劑盒內=PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
7.鑒定或輔助鑒定待測小麥含有Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn_Al這四種基因中哪一種的方法，包括如下(I)和(2)的步驟 (1)以待測小麥的基因組DNA為模板，用權利要求1-3中任一所述引物對組中的所述引物對組A進行PCR反應，所述PCR反應的退火溫度為60°C ； (2)檢測步驟(I)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測小麥含有Vrn-Ala、Vrn-Alb、Vrn-Alc和vrn_Al這四種基因中哪一種 若所述PCR產物中同時含有715bp和624bp的兩個DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有Vrn-Ala基因；若所述PCR產物中含有473bp的DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有Vrn-Alb基因；若所述PCR產物中含有493bp的DNA片段、同時不含有1068bp的DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有Vrn-Alc基因；若所述PCR產物中同時含有493bp和1068bp的兩個DNA片段，則所述待測小麥含有或候選含有vrn-Al基因。
8.一種培育春性小麥品種的方法，包括采用通過權利要求7的方法鑒定得到的含有Vrn-Ala基因、Vrn-Alb基因和Vrn-Alc基因中至少一種的小麥作為親本進行育種的步驟。
全文摘要
本發明公開了一種用于鑒定或輔助鑒定小麥春化基因VRN-A1的PCR體系及其應用。本發明的PCR體系中的引物對組由特異于VRN-A1基因的兩個引物對組成；所述特異于VRN-A1基因的兩個引物對分別為序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對1，以及序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2。本發明所提供的引物對組中各引物對之間不存在相互抑制作用和錯配，檢測結果可靠、重復性好，成本低，且特異性強，檢測過程耗時短；本發明對檢測小麥品種的冬春性，進而提高育種的效率，加強對育種高代的選擇具有重要意義；另外，本發明使得在小麥推廣和引種過程中，有更強的目標性。
文檔編號C12Q1/68GK102925570SQ20121043661
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月5日 優先權日2012年11月5日
發明者張曉科, 穆培源, 相吉山, 張影全, 桑偉, 王曉龍, 徐紅軍, 王軒, 韓新年, 聶迎彬, 崔鳳娟, 鄒波 申請人:西北農林科技大學