專利名稱：Telkp和lkp融合免疫毒素、原核表達載體及制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及TELKP和LKP融合免疫毒素、原核表達載體及制備方法。
背景技術：
腫瘤生物治療近年來迅猛發展，因其高效低毒、目標明確而成為繼手術、放、化療以來的又一重要治療策略。生物毒素是腫瘤生物治療重要內容之一，但因生物毒素對靶細胞的作用不具特異性，限制了其在臨床的廣泛應用。近年，有研究者嘗試將特異性抗體與生物毒素分子偶聯開發出第二代免疫毒素，但由于偶聯分子的分子量增大，其應用效果也不理想。因此，開發具細胞靶向性小分子毒素是未來免疫毒素研究的主要方向。絲瓜毒素(Luffin-β )，是從絲瓜籽中分離到的I型核糖體失活蛋 白(ribosomeinactivating protein，RIP)，絲瓜 RIP 有多種類型，主要為Luffin-a, Luffin-β , Luffin-Ss, Luffin-cylin, Luffin-Pl,其中 Luffin-β 含 278 個氨基酸，分子質量30. 583KD，等電點9. 5，能特異水解真核細胞核糖體28SrRNA4324位的腺嘌呤，使真核細胞核糖體60s大亞基失活，顯著抑制其蛋白合成，屬目前單鏈RIP中活性最高者之一，是近年備受關注的新型強效免疫毒素彈頭小分子(Poma，A.，G.Marcozzij et al. (1999). ^Antiproliferative effect and apoptotic response in vitroof human melanoma cells to liposomes containing the ribosome-inactivatingproteinluffin. "Biochim Biophys Acta1472 (1-2):197-205. Pomaj A.，M. Miranda, etal. (1998)· "Differential response of human melanoma and Ehrlich ascites cells invitro to the ribosome-inactivating protein luffin. "Melanoma Res8(5):465-467。Maj Q. J. ,J.H.Li,et al. (2003). ^Crystal structure of beta-luffin，a ribosome-inactivatingprotein，at2. OA resolution. 〃Acta CrystalIogr D BiolCrystallogr59 (Pt8) : 1366-1370.)，具較強抗瘤活性。尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinaseplasminogen activator，uPA)是含 431個氨基酸殘基，分子質量為50 60kD的一糖蛋白。在正常組織、細胞uPA及其uPAR表達極低，而幾乎所有的腫瘤，兩者明顯高表達。uPA與腫瘤的生長、浸潤與轉移等均密切相關(Markl B，Renk I, Oruzio DV, and et al. Tumour budding, uPA and PAI-Iare associatedwith aggressive behaviour in colon cancer[J]. J Surg Oncol. 2010, 102(3):235-41.FongY, Shen KH，Chiang TA，and et al. Acacetin inhibits TPA-induced MMP_2andu-PA expressions of human lung cancer cells throughinactivating JNK signalingpathway and reducing binding activities of NF-kappaBand AP-I[J]. J FoodScij 2010，75(1) :H30-8)o因此，uPA被視為重要的腫瘤標志物和極具吸引力的腫瘤治療靶標。將尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase plasminogen activator, uPA)裂解位點(也稱uPA識別位點，簡寫為uPAcs，氨基酸序列為SGRSA)和絲瓜毒素分子(Luffin-β)構建融合基因表達載體，誘導并純化其表達的融合免疫毒素。該融合免疫毒素在體內高表達uPA的腫瘤組織細胞局部，經uPA酶切割裂解位點序列將釋放具殺瘤活性的小分子毒素Luffin-β ,以發揮其殺瘤作用。

發明內容
鑒于Luffin-β的抗腫瘤生物學特性及uPA與腫瘤的密切關系，本發明的目的之一是提供一種融合免疫毒素TELKP，氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述TELKP融合免疫毒素的氨基酸序列從N端至C端依次為Trx標簽、EK識別序列、Luffin-β肽段、KDEL駐留信號序列、uPA識別序列(uPAcs)，由此命名為TELKP。TELKP融合免疫毒素為進一步制備下述LKP融合免疫毒素奠定了基礎。本發明的目的之二是提供一種融合免疫毒素LKP，氨基酸序列如SEQ IDN0. 2所
/Jn ο所述融合免疫毒素的氨基酸序列從N端至C端依次為Luffi η- β肽段、KDEL駐留信號序列、uPAcs (SGRSA),由此所述融合免疫毒素命名為LKP。C末端修飾KDEL的融合免疫毒素可增強其細胞毒性，還能刺激有效的淋巴細胞增殖和特異性淋巴細胞效應增強，融合免疫毒素在體內高表達uPA的腫瘤組織細胞局部，經uPA酶切割裂解位點序列將釋放具殺瘤活性的小分子毒素Luffin-β，以發揮其對瘤細胞的殺傷作用。本發明的目的之三是提供含所述LKP融合免疫毒素基因的重組表達載體pET_32a(+ )/Luffin-β-KDEL-uPAcs，所述重組表達載體包括pET-32a ( + )載體序列和LKP (即Luffin-β -KDEL-uPAcs)融合免疫毒素的基因序列。本發明的目的之四是提供所述重組表達載體pET-32a(+ )/Luffin-β _KDEL_uPAcs的構建方法，包括如下步驟(I)采用RT-PCR法，以植物絲瓜籽(物種名為Luffa acutangula)總RNA為模板，以上游SEQ ID N03和下游SEQ ID N04為引物對，擴增得到PCR產物I，即為Luffin-β肽段的cDNA序列，并克隆入載體ρΤΑ2中得到陽性重組載體pTA2/Luffin-i3，SEQ ID N03 :5’ -ATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’，SEQ ID N04 :5’ -GTGTTTTGTAGGAATACCATCGTCAA-3’ ；(2)采用引物延伸法，以所述載體pTA2/Luffin-i3為模板，以上游SEQ IDN05和下游SEQ ID N06為引物對，擴增得到PCR產物II，即為包括Luffin-β肽段、KDEL駐留信號序列和uPA識別序列的cDNA序列，再用限制性內切酶NcoI和XhoI雙酶切所述PCR產物11和pET-32a ( + )載體，分別回收含Luffin-β -KDEL-uPAcs的cDNA序列的片段和pET_32a(+ )骨架片段，純化后連接，得到陽性重組表達載體pET-32a ( + ) /Luffin-β -KDEL-uPAcs，SEQ ID N05 :5’ -CATGCCATGGCTATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’，SEQ ID N06 :5’ -CCGCTCGAGTTATGCTGATCGTCCGCTTAGCTCATCTTTGTGTTTTGTAGGAATACCATCGTC-3，。本發明的目的之五是提供TELKP融合免疫毒素的制備方法，包括如下步驟(I)將所述表達載體 pET-32a(+ VLuffin-β -KDEL-uPAcs 轉化表達菌 BL21 (DE3)；(2)挑取克隆轉種于含50μ g/ml Amp的LB培養基中，37°C，220r/min振搖培養至對數生長期，加入O. 4mmol/L IPTG，于30°C過夜誘導使表達TELKP融合免疫毒素；(3)于4°C,6000r/min離心15min收集菌體，棄上清液，加入10倍體積的pH7. 3的PBS溶液重懸菌體，再加入PMSF和DTT，超聲破碎菌體，破菌完全后于4°C，10000r/min離心15min,將上清以O. 45 μ m微孔濾膜過濾,再上樣于金屬螯合Ni2+柱,最后以ElutionBuffer洗脫得到TELKP融合免疫毒素溶液。本發明的目的之六是提供LKP融合免疫毒素的制備方法，包括如下步驟(I)向所述TELKP融合免疫毒素溶液中加入EK酶過夜酶切；(2) EK酶酶切后的蛋白用陽離子交換柱Pharmacia HiTrap SP FastFlowcolumn (26/20)洗脫純化得LKP融合免疫毒素溶液。本發明中，本發明采用基因工程技術將KDEL序列與uPA裂解位點序列引入Luffin-β 的 C 端，獲得 Luffin-β -KDEL-uPAcs (LKP)融合免疫毒素，KDEL 序列和 uPA裂解位點序列使Luffin- β蛋白分子構象發生改變，使之成為受KDEL肽與uPA裂解位點封閉的暫無活性(或低活性)的融合免疫毒素分子，腫瘤細胞標志物uPA酶可裂解 Luffin-β-KDEL-uPAcs融合免疫毒素釋放具活性的Luffin-β以殺傷肺癌細胞。LKP融合免疫毒素的表達與純化為其后續抗瘤生物學活性研究和抗瘤藥物的制備奠定堅實基礎。


圖I為本發明絲瓜籽Luffin-β基因PCR擴增的電泳圖；圖2為本發明重組載體pTA2/Luffin_P經酶切驗證的電泳圖；圖3為本發明重組表達載體pET_32a (+) /Luffin- β -KDEL-uPAcs經酶切驗證的電泳圖；圖4為本發明融合免疫毒素TELKP的誘導表達與純化后的電泳圖；圖5為本發明融合免疫毒素TELKP經酶切EK酶酶切后的電泳圖；圖6為本發明LKP融合免疫毒素經uPA體外裂解的殺瘤活性檢測結果圖；圖7為本發明LKP融合免疫毒素對H460細胞生長的影響曲線圖；圖8為本發明LKP蛋白影響H460細胞caspase_3基因mRNA表達的電泳圖。圖9為本發明LKP蛋白影響H460細胞caspase-3基因編碼蛋白表達的電泳圖。
具體實施例方式下面將結合實施例和附圖來詳細說明本發明，這些實施例和附圖僅起說明性作用，并不局限于本發明的應用范圍。本發明不限于下述實施方式或實施例，凡不違背本發明精神所做出的修改及變形，均應包括在本發明范圍之內。實施例I :I材料與方法I. I 材料RT-PCR試劑、克隆載體pTA2、限制性內切酶、高保真聚合酶、T4DNA連接酶、質粒抽提及CCK-8等試劑購自TOYOBO公司；蛋白純化Ni柱及填料等購自GE公司；表達載體pET-32a(+)、大腸桿菌DH5 α和BL21 (DE3)表達菌、EK酶等購自上海捷瑞生物工程有限公司；人肺癌細胞株NCI-H460購自武漢大學細胞庫；測序由上海生工公司完成。I. 2 方法I. 2. I重組載體pTA2/Luffin- β的構建和鑒定
以植物絲瓜籽總RNA為模板，用上游引物SEQ ID N03 5’ -ATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’ 和下游引物 SEQ ID N04 :5’ -GTGTTTTGTAGGAATACCATCGTCAA-3’ PCR擴增Luffin-β基因的全長編碼序列，O. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖I所示，其中M為DNA標準(DL2000)，I為PCR產物。電泳圖顯示目的條帶大小與預期大小的834bp一致，初步說明擴增到目的基因Luffin-β的全長編碼序列。將擴增的Luffin-β基因克隆入載體pTA2中，并通過BamH I與XhoI雙酶切后
O.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證如圖2所示，其中M為DNA標準(DL2000)，I為酶切后的產物。電泳圖顯示I中兩個條帶分別為PTA2骨架片段序列和Luffin-β基因序列，分別與預期大小的2916bp和900bp (含Luffin-β的全長編碼序列和少部分載體序列)一致。另外將酶切驗證正確的載體送去測序，測序結果顯示與GenBank發布的Luffin-β基因序列(GenBank登錄號X62372. I)完全一致，由此，成功構建了重組載體pTA2/Luffin-3。I. 2. 2重組pET_32a (+) /Luffin- β -KDEL-uPAcs融合免疫毒素載體的構建和鑒定 自行設計構建Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因引物，引物中引入NcoI酶切位點、XhoI酶切位點、KDEL駐留信號序列、uPA識別序列(uPAcs)，使獲得的基因序列為NcoI+Luffin-β-KDEL-uPAcs+XhoI，具體如下SEQ ID N05 :5，_CATGCCATGGCTATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’；SEQ ID N06 :5’ -CCGCTCGAGTTATGCTGATCGTCCGCTTAGCTCATCTTTGTGTTTTGTAGGAATACCATCGTC-3’ ；SEQ ID N05序列從5’端開始的堿基依次為酶切位點保護堿基(CATG)、NcoI酶切位點(CCATGG)，防止移碼突變而人為加入的堿基(CT)、SEQ ID N03序列(ATGAACAGATTCACATTTCTCTCT)；SEQ ID N06序列從5’端開始的堿基依次為酶切位點保護堿基(CCG)、XhoI酶切位點(CTCGAG)，終止密碼子(TTA)，編碼uPA識別位點序列(TGCTGATCGTCCGCT)，編碼KDEL序列(TAGCTCATCTTT)、SEQ ID N04 序列(GTGTTTTGTAGGAATACCATCGTC)。以重組載體pTA2/Luffin-0為模板，上游引物SEQ ID N05和下游引物SEQIDN06進行PCR擴增得到含NcoI, XhoI酶切位點的Luffin- β -KDEL-uPAcs片段。用限制性內切酶NcoI和XhoI雙酶切該PCR產物和pET-32a (+)載體，分別回收酶切后的Luffin-β-KDEL-uPAcs片段和pET_32a(+)骨架片段，純化后連接，得重組pET_32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs融合免疫毒素載體，將所得的重組載體用NcoI和XhoI雙酶切驗證，酶切后的電泳圖如圖3所示，其中，M為DNA標準(DL2000)，1為NcoI與XhoI酶切 pET-32a (+) /Luffin- β -KDEL-uPAcs 后的產物，2 為 pET_32a (+)載體。電泳圖顯示 I中的兩個條帶分別為pET-32a骨架片段和Luffin- β -KDEL-uPAcs目的片段，分別與預期大小的5852bp和866bp —致，經測序鑒定正確，因此，成功構建了重組pET_32a (+) /Luffin-β-KDEL-uPAcs融合免疫毒素載體。I. 2. 3TELKP融合免疫毒素的誘導表達與純化將重組載體pET-32a(+)/Luffin-β -KDEL-uPAcs 轉化表達菌 BL21 (DE3)大腸桿菌，次日挑3個克隆，分別放于盛5ml LB培養基的螺紋管中，培養(37°C，220r/min振搖)至對數生長期，加入O. 4mmol/L IPTG,于30°C過夜誘導。各取Iml培養物，14000r/min離心Imin,棄上清，100 μ I蒸懼水重懸沉淀,加34 μ 14xloading buffer,混勻，沸水浴3 5min,SDS-PAGE檢測融合免疫毒素TELKP的表達情況。
表達菌經大量誘導后，4°C，6000r/min離心誘導后的細菌15min，10倍體積的PBS(pH7. 3)重懸菌體，超聲破碎(300W，工作10s，間隙10s，15次，循環3輪)，破菌時加入PMSF和DTT，防蛋白降解。鏡檢破菌效果。破菌完全后于4°C，10000r/min離心15min，留取上清及沉淀，上清以O. 45 μ m微孔濾膜過濾。金屬螯合Ni2+柱中裝入約IOml Ni2+填料，His binding buffer平衡。將已過濾的上清上樣Ni2+柱，收集穿透液，復平衡，分別用5%、10%和1009ffilutionBuffer (20mM磷酸鈉，O. 5M NaCl，8M尿素，O. 5M咪唑，ρΗ7· 4)洗脫，100%組分透析于Tris (9. O)緩沖液中得到TELKP融合免疫毒素溶液。SDS-PAGE電泳鑒定未經IPTG誘導和經IPTG誘導的轉化菌中融合免疫毒素TELKP的表達情況以及鑒定經IPTG誘導的轉化菌再經破菌離心后的上清和沉底中的融合免疫毒素TELKP的表達情況，如圖4所示，其中M為蛋白Marker，I為未經IPTG誘導的，2為經IPTG誘導的，3為誘導后的轉化菌經破菌離心后的上清，4為誘導后的轉化菌經破菌離心后的沉淀。電泳圖顯示在43KDa和55KDa之間有條帶，與預期大小的48. 8KDa的目的蛋白TELKP 一致。I. 2. 4LKP融合免疫毒素的制備和檢測向I. 2. 3中獲得的TELKP融合免疫毒素溶液中加入適量腸激酶(EK酶)，過夜，留取約Iml未酶切樣品作對照，SDS-PAGE電泳檢測酶切效果，如圖5所示，其中M為蛋白Marker，I為TELKP，2為EK酶切TELKP。電泳圖顯示2中EK酶切TELKP后得到31. 8kD的目的蛋白LKP, 16. 9KD大小的蛋白條帶為EK酶切去的Trx標簽蛋白，與預期結果一致。酶切后的蛋白用陽離子交換柱Pharmacia HiTrap SP Fast Flowcolumn(26/20)洗脫純化，洗脫純化獲得的目的蛋白LKP再用SDS-PAGE電泳檢測后行高效液相色譜(high performance liquid chromatogram, HPLC)分析，色譜柱為discovery (250mmX 4. 6mm, 5 μ m),歸一法計算其純度達 98. 8%。I. 2. 5. LKP融合免疫毒素經uPA體外裂解的殺瘤IC50計算將人肺癌細胞株NCI-H460細胞接種于96孔板(3000個細胞/150 μ I/孔)，5 %C02、37°C與飽和濕度培養 24h，加入不同濃度(25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)純化的LKP蛋白與uPA酶，分別以僅加蛋白LKP、uPA酶及不處理的細胞做對照，作用24h后，加入CCK-8(cell counting kit-8)試劑,相同條件下繼續培養4h,酶標儀測定450nm波長處光密度值，并計算其IC50。LKP經uPA體外裂解的殺瘤活性檢測結果如圖6所示，其中A為正常人肺癌NCI-H460細胞，B為50ng/ml的LKP蛋白在100ng/ml uPA酶存在條件下24h時致H460細胞不同程度的死亡，C為200ng/ml的LKP蛋白在400ng/ml uPA酶存在條件下24h時致H460細胞不同程度的死亡。可見200ng/ml的LKP蛋白經400ng/ml的uPA酶體外裂解24h致大部分H460細胞貼壁能力降低，部分細胞死亡、崩裂，而50ng/ml的LKP蛋白經100ng/ml的uPA酶體外裂解相同的時間后致少部分H460細胞貼壁能力降低，較少部分細胞死亡。因此，LKP蛋白經uPA酶體外裂解可釋放具殺瘤活性的免疫毒素Luffin- β，且其殺瘤活性呈明顯劑量-效應關系，其IC50為40ng/ml。I. 2. 6LKP融合免疫毒素對非小細胞肺癌細胞生長的影響-增殖曲線繪制將H460細胞接種至4個96孔板(3000個細胞/150 μ I/孔)，5 % C02，37°C與飽和濕度培養24h后加入目的蛋白LKP與uPA酶，分別以單純目的蛋白LKP、單純uPA酶作用于H460細胞及單純H460細胞作對照，單純培養液為空白對照，分別于ld、2d、3d、4d取出一96孔板，每孔加換新培養基與CCK-8，相同條件下繼續培養4h，振蕩30秒混勻，酶標儀測定450nm波長處光密度值，以光密度值為Y軸，時間為X軸繪制增值曲線如圖7所示，LKP蛋白經uPA酶體外裂解釋放具殺瘤活性的Luffin-β對人肺癌H460細胞生長具顯著殺傷作用(與對照細胞和uPA酶處理的細胞比較，P〈0. 01)，LKP蛋白經uPA酶裂解后腫瘤殺傷能力顯著增強(在處理后培養2 — 4天，與LKP蛋白單獨處理的細胞比較，P〈0. 05)。I. 2. 7融合免疫毒素LKP對H460細胞促凋亡基因caspase-3表達的影響分別根據人caspase-3與GAPDH基因序列，設計其特異性擴增引物。caspase-3上游5' -TCCTGAGATGGGTTTATGTA-3 '，下游5' -CACGTGTAAGATCATTTT-3 ' ;GAPDH 上游5' -CGGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下游5' -TTGGCCAGGGGTGCTAAGC-3'。采用 RT-PCR 法，以蛋白LKP (50ng/ml)與uPA酶(100ng/ml)作用的H460細胞的總RNA為模板檢測caspase-3基因的表達情況,分別以單純目的蛋白LKP (50ng/ml)、單純uPA酶(100ng/ml)作用的H460細胞及單純H460細胞的相同檢測作對照，同時檢測的GAPDH基因作內參。反轉錄(RT)反應條件30°C 10min;42°C,30min, 99°C 5min, 5°C,5min, I 個循環。PCR 反應條件94°C Imin ；94°C 30s, 45°C, lmin, 72°C, 5min, 30 個循環。反應結束后取 PCR 反應液(5 10 μ I)行電泳檢測如圖8所示，其中M為DNA標準(DL2000)，I為Η460細胞，2為uPA作用的H460細胞，3為LKP作用的H460細胞，4為LKP與uPA作用的H460細胞。電泳圖顯示，以蛋白LKP與uPA酶作用的H460細胞總RNA為模板能檢測到caspase-3基因的較強表達，以單純目的蛋白LKP作用的H460細胞總RNA為模板能檢測到caspase-3基因的較弱表達，單純uPA酶作用的H460細胞及單純H460細胞的總RNA為模板所檢測到的caspase-3基因的表達最弱。提不蛋白LKP可致H460細胞調亡。I. 2. 8融合免疫毒素LKP對H460細胞促凋亡蛋白caspase-3表達的影響采用Western blot技術，分別將I. 2. 7的各組細胞總蛋白轉移至硝酸纖維膜，浸泡于含caspase-3兔多抗(I 500)封閉液中，4°C過夜孵育，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(I 300)，室溫孵育lh，25°C，與化學發光底物結合5 lOmin，保存圖片。β-actin (43KD)作內參。Western blot結果如圖9所示，其中I為H460細胞，2為uPA作用的H460細胞，3為LKP作用的H460細胞，4為LKP與uPA作用的H460細胞。Western blot結果顯示，蛋白LKP與uPA酶作用的H460細胞檢測在約17kDa處出現較強caspase-3抗原染色帶，單純目的蛋白LKP作用的H460細胞在相同位置出現該條帶則較弱，單純uPA酶作用的H460細胞及單純H460細胞在相同位置出現該條帶則最弱，提示蛋白LKP可致H460細胞凋亡。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。
權利要求
1.TELKP融合免疫毒素，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID NO. I所示。
2.根據權利要求I所述的TELKP融合免疫毒素，其特征在于氨基酸序列從N端至C端依次為Trx標簽、EK識別序列、Luffin- β肽段、KDEL駐留信號序列、uPA識別序列。
3.LKP融合免疫毒素，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
4.根據權利要求3所述的LKP融合免疫毒素，其特征在于氨基酸序列從N端至C端依次為Luffin- β肽段、KDEL駐留信號序列、uPA識別序列。
5.含權利要求4所述LKP融合免疫毒素的基因的重組表達載體pET-32a( + )/Luffin- β -KDEL-uPAcs，其特征在于，包括pET_32a ( + )載體序列和LKP融合免疫毒素的基因序列。
6.權利要求5所述表達載體pET-32a( + ) /Luffin-β -KDEL-uPAcs的構建方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)采用RT-PCR法，以植物絲瓜籽總RNA為模板，以上游SEQID N03和下游SEQ IDN04為引物對，擴增得到PCR產物I，即為Luffin-β肽段的cDNA序列，并克隆入載體pTA2中得到陽性重組載體pTA2/Luffin-3，SEQ ID N03 :5’ -ATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’，SEQ ID N04 :5’ -GTGTTTTGTAGGAATACCATCGTCAA-3’ ； (2)采用引物延伸法，以所述載體pTA2/Luffin-i3為模板，以上游SEQIDN05和下游SEQ ID N06為引物對，擴增得到PCR產物II，即為包括Luffin-β肽段、KDEL駐留信號序列和uPA識別序列的cDNA序列，再用限制性內切酶NcoI和XhoI雙酶切所述PCR產物II和pET-32a ( + )載體,分別回收含 Luffin-β -KDEL-uPAcs 的 cDNA 序列片段和 pET_32a ( + )骨架片段，純化后連接，得陽性載體 pET-32a ( + )/Luffin-β-KDEL-uPAcs，SEQ ID N05 :5’-CATGCCATGGCTATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’，SEQ ID N06 :5’-CCGCTCGAGTTATGCTGATCGTCCGCTTAGCTCATCTTTGTGTTTTGTAGGAATACCATCGTC-3，。
7.權利要求I或2所述TELKP融合免疫毒素的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (1)將所述表達載體pET-32a ( + )/Luffun-β-KDEL-uPAcs 轉化表達菌 BL21 (DE3)； (2)挑取克隆轉種于含50μ g/ml Amp的LB培養基中，37°C，220r/min振搖培養至對數生長期，加入O. 4mmol/L IPTG，于30°C過夜誘導使其表達TELKP融合免疫毒素； (3)于4°C,6000r/min離心15min收集菌體，棄上清液，加入10倍體積的ρΗ7·3的PBS溶液重懸菌體，再加入PMSF和DTT，超聲破碎菌體，破菌完全后于4°C，10000r/min離心15min,將上清以O. 45 μ m微孔濾膜過濾,再上樣于金屬螯合Ni2+柱,最后以Elution Buffer洗脫得到TELKP融合免疫毒素溶液。
8.權利要求3或4所述LKP融合免疫毒素的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (O向所述TELKP融合免疫毒素溶液加入EK酶過夜酶切； (2)酶切后的蛋白用陽離子交換柱 Pharmacia HiTrap SP Fast Flow column (26/20)洗脫純化得LKP融合免疫毒素溶液。
全文摘要
本發明公開TELKP和LKP融合免疫毒素、原核表達載體及其制備方法，采用RT-PCR克隆絲瓜毒素Luffin-β基因，經引物延伸法構建Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因并亞克隆至原核表達載體pET-32a(+)中，該表達載體經誘導獲48.8KDa含Trx標簽蛋白的融合免疫毒素TELKP，腸激酶EK酶切TELKP獲16.9KDa的融合免疫毒素LKP；LKP免疫毒素可被uPA酶裂解釋放具活性的小分子毒素Luffin-β殺傷肺癌細胞，為讓帶uPA裂解位點序列的低活性或無活性的Luffin-β在高表達uPA的腫瘤組織細胞局部其活性被釋放而發揮局部殺瘤作用奠定基礎，為腫瘤的治療提供新策略。
文檔編號C12N15/70GK102924605SQ201210444580
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月8日 優先權日2012年11月8日
發明者項穎, 李啟英, 王莉 申請人:重慶市腫瘤研究所