專利名稱：運用核酸恒溫擴增技術檢測肺炎克雷伯菌的試劑及其擴增方法
技術領域：
本發明涉及病原體檢驗技術，具體地說是運用核酸恒溫擴增反應來檢測肺炎克雷伯菌的技術。
背景技術：
肺炎克雷伯菌為革蘭陰性桿菌，病變中滲出液粘稠而重，致使葉間隙下墜。細菌具有莢膜，在肺泡內生長繁殖時，引起組織壞死、液化、形成單個或多發性膿腫。病變累及胸膜、心包時，可引起滲出性或膿性積液。病灶纖維組織增生活躍，易于機化；纖維素性胸腔積液可早期出現粘連。在院內感染的敗血癥中，肺炎克雷伯菌為重要病原菌，病死率較高。 肺炎克雷伯菌(KNP)是臨床分離及醫院感染的重要致病菌之一，隨著β -內酰胺類及氨基糖苷類等廣譜抗菌素的廣泛使用，細菌易產生超廣譜β_內酰胺酶(ESBLs)和頭孢菌素酶(AmpC酶)以及氨基糖苷類修飾酶(AMEs)，對常用藥物包括第三代頭孢菌素和氨基糖苷類呈現出嚴重的多重耐藥性。肺炎克雷伯菌引起的醫院感染率近期逐年增高，且多耐藥性菌株的不斷增加常導致臨床抗菌藥物治療的失敗和病程遷延。肺炎克雷伯菌耐藥機制主要包括產生內酰胺酶、生物被膜的形成、外膜孔蛋白的缺失。抗菌藥物主動外排等，抗菌藥物耐藥基因水平播散是多藥耐藥菌株臨床加劇的重要原因。因此能夠快速有效的檢測肺炎克雷伯菌對于與之相關的疾病防控具有重要的意義。肺炎克雷伯菌的檢測方法有常規培養和生理生化反應檢測等多種方法，與傳統檢測手段相比，本發明很好的解決了目前大多數檢測技術手段的弊端。首先，無需任何復雜的儀器，只需要一臺簡單的加熱器，如普通的水浴鍋或以電、電池為能源的加熱器，使得核酸診斷可以前所未有地用于現場診斷。其次，可以加快反應速度，縮短反應時間。第三，易于操作者掌握，對反應條件的要求相對寬松，使得以該技術為基礎的產品對操作人員的技能要求不高，這也為核酸試劑的普及創造了條件。

發明內容
針對肺炎克雷伯菌，本發明克服了現有技術中的缺點，提供一種運用等溫擴增技術快速、便捷、低成本的試劑和檢測方法。本發明提供了更加快速和低成本通過等溫擴增方法檢測肺炎克雷伯菌的方法。本發明是通過以下技術方案實現的(I)設計特異性寡核苷酸引物用于等溫擴增技術檢測；(2)整合各引物使之不相互干擾。(3)以引物序列組，擴增待測樣品模板，進行目的基因的特異性擴增；(4)擴增完畢后可通過使用商業化的核酸恒溫擴增檢測試紙條對擴怎產物進行檢測，陽性結果呈現兩條紫紅色條帶，陰性結果呈現一條紫紅色條帶。
該方法包括應用該方法檢測肺炎克雷伯菌所使用的引物組和與之配套的等溫擴增反應條件。其中引物序列如下該引物序列參照GenBank 中的序列 AP006725. I Klebsiella pneumoniaesubsp.pneumoniae NTUH-K2044DNA, complete genome中的溶質接合蛋白序列為基礎進行設計。引物SEQ ID NO. I :5’ -TACGCCCCGGTCTGACSEQ ID NO. 2 :5，-GCGCTTTCACCCCCAACSEQ ID NO. 3 :5’ -GTCCCTTTTGCCCGAGGTCGACGGCACGGCCATTSEQ ID NO. 4:5’ -CGACGGCACGGCCATTTGTCCCTTTTGCCCGAGG
SEQ ID NO. 5 :5，-TGGCAACGACTGGTCTCGCCSEQ ID N0.6 :5， -TCGCGTAGGGGGAGGCTGTT。其中序列SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6使用特殊基團標記，擴增產物中包含上述基團，以便同核酸恒溫擴增檢測試紙條反應。本發明中反應體系中各組分構成比例如下
成分濃度加樣量
Bst 酶5U/ μ LI μ L
Bst酶緩沖液-5 μ L
SEQ ID NO. I:lOpmol/L0.2 μ L SEQ ID NO. 2ΙΟμηιοΙ/L0. 2 μ L
SEQ ID NO. 3:ΙΟμιηοΙ/L0. 8 μ L
SEQ ID NO. 4ΙΟμηιοΙ/L0. 8 μ L
SEQ ID NO. 5ΙΟμηιοΙ/LI. 5 μ
SEQ ID NO. 6:10 μ mo I/LI. 5 μ L
DNA樣品2pL
雙蒸水7 μ L
總體積20 μ 其中Bs t 酶緩沖液的成分為 20mM Tris-HCl, IOmM (NH4) 2S04, IOmM KCl、2mMMgS04、質量百分比 0. 1% Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 為 8. 8。等溫擴增程序為61°C 60分鐘。擴增完畢后可通過使用商業化的核酸恒溫擴增檢測試紙條對擴怎產物進行檢測，陽性結果呈現兩條紫紅色條帶(分別為檢測線和質控線)，陰性結果呈現一條紫紅色條帶(質控線)。
如出現其它結果則表明此次檢驗失敗不能確定樣品中是否存在肺炎克雷伯菌，需重新檢驗。與現有技術相比，本發明的有益效果是相比傳統生理生化檢測方法，基于等溫擴增的鑒定方法適用于直接從臨床樣品中擴增靶基因，只需要一次等溫擴增反應就能夠檢測肺炎克雷伯菌是否存在，大大提高了效率節約了時間。相比較其它PCR方法，本方法制僅需要簡單的設備——一個恒溫水浴即可，大大提高了性價比節約了成本。等溫擴增方法具有檢測準確、特異性強、靈敏度高的特點，可以快速、準確地鑒定特異的目的病原體。它通過擴增靶基因，避免了反復培養，節約時間；該鑒定方法不受培養條件和病原體生理狀態的影響，較生理生化鑒定方法更為準確。


圖I樣品檢測結果，樣品DNA使用核酸恒溫擴增肺炎克雷伯菌的檢測技術檢測，擴增完畢后可通過使用商業化的核酸恒溫擴增檢測試紙條對擴怎產物進行檢測，陽性結 果呈現兩條紫紅色條帶(分別為檢測線和質控線)，陰性結果呈現一條紫紅色條帶(質控線)，試紙條I為I株肺炎克雷伯菌標準株擴增產物檢測結果，試紙條2和3分別為2株肺炎克雷伯菌野生株擴增產物檢測結果，試紙條4為陰性對照。
具體實施例方式下面結合附圖與具體實施方式
對本發明作進一步詳細描述。實施例I樣本1株肺炎克雷伯菌標準株的細菌培養物，2株肺炎克雷伯菌野生株的細菌培養物。I.樣品DNA抽提取Iml樣品培養物，離心得到沉淀物質在Iml緩沖液中重懸，加入Iml裂解液，沸水浴10分鐘，室溫下10000轉/分鐘，離心5分鐘，取上清液置-20°c保存。3.等溫擴增體系中反應體系中各組分構成比例如下成分濃度加樣量
Bst 酶5U/pLΙμΙ
Bst酶緩沖液-5 μι
SEQ ID NO. IΙΟμιηοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 2ΙΟμηιοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 3:ΙΟμηιοΙ/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 4ΙΟμιηοΙ/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 5ΙΟμηιοΙ/LI. 5 μ
SEQ ID NO. 6:ΙΟμιηοΙ/LI. 5 μ
DNA樣品2 μ L
雙蒸水7 μ L
總體積20 μ L其中Bs t 酶緩沖液的成分為 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、質量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 為 8· 8。等溫擴增程序為61 °C，60分鐘。等溫擴增共進行4管檢測，其中DNA樣品所加入的分別為樣品I為肺炎克雷伯菌標準株培養物的DNA樣本；樣品2和3為肺炎克雷伯菌野生株培養物的DNA樣本；樣品4為陰性對照。4.被檢測樣品結果觀察擴增完畢后通過使用商業化的核酸恒溫擴增檢測試紙條對擴怎產物進行檢測，陰性對照顯示陰性結果，肺炎克雷伯菌標準株和野生株均顯示陽性結果。實施例2樣本某待測樣品。I.樣品DNA抽提某樣品懷疑含有肺炎克雷伯菌，取Iml該樣品培養物，離心得到沉淀物質在Iml緩沖液中重懸，加入Iml裂解液,沸水浴10分鐘,室溫下10000轉/分鐘,離心5分鐘,取上清液置_20°C保存。3.等溫擴增體系中反應體系中各組分構成比例如下成分濃度加樣量
Bst 酶5U/ μ LIpL
Bst酶緩沖液-5 μ L
SEQ ID NO. I:10 μ mol/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 2ΙΟμιηοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 3:ΙΟμπιοΙ/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 410 μ mol/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 5:10 μ mol/LI. 5 μ L
SEQ ID NO. 6:10 μ mol/LI. 5 μ L
DNA樣品2 μ L
雙蒸水7 μ L
總體積20 μ L其中Bst 酶緩沖液的成分為 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、質量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 為 8· 8。等溫擴增程序為63 °C，60分鐘。 等溫擴增共進行3管檢測，其中DNA樣品所加入的分別為樣品I為陰性對照；樣品2為陽性對照，即含肺炎克雷伯菌標準株的DNA樣本；樣品3為待測樣本。4.被檢測樣品結果觀察擴增完畢后通過使用商業化的核酸恒溫擴增檢測試紙條對擴怎產物進行檢測，陰性對照顯示陰性結果，肺炎克雷伯菌標準株的DNA樣本和待測樣本的DNA顯示陽性結果。6天后，通過常規微生物培養和生化檢測證明，所檢驗的目的樣本中含有肺炎克雷伯菌。核酸恒溫擴增檢驗結果與常規微生物培養和生化檢測結果一致。以上所述的實施例僅用于說明本發明的技術思想及特點，其目的在于使本領域內的技術人員能夠理解本發明的內容并據以實施，不能僅以本實施例來限定本發明的專利范圍，即凡本發明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發明的專利范圍內。
權利要求
1.一種運用核酸恒溫擴增技術檢測肺炎克雷伯菌的試劑及其擴增方法，其特征在于，包括以下六個引物SEQ ID NO. I :5’ -TACGCCCCGGTCTGACSEQ ID NO. 2 :5’ -GCGCTTTCACCCCCAACSEQ ID NO. 3 :5’ -GTCCCTTTTGCCCGAGGTCGACGGCACGGCCATTSEQ ID NO. 4 :5’ -CGACGGCACGGCCATTTGTCCCTTTTGCCCGAGGSEQ ID NO. 5 :5’ -TGGCAACGACTGGTCTCGCCSEQ ID NO. 6 :5’ -TCGCGTAGGGGGAGGCTGTT。
2.根據權利要求I所述的一種運用核酸恒溫擴增技術檢測肺炎克雷伯菌的試劑及其擴增方法，其特征在于，核酸擴增反應體系中各組分構成比例如下成分濃度加樣量 Bst 酶 5U/pLΙμ Bst酶緩沖液 -5μ SEQ ID NO. I ΙΟμηιοΙ/LO. 2 μ L SEQ ID NO. 2 ΙΟμιηοΙ/LO. 2 μ L SEQ ID NO. 3: 10 μ mo I/LO. 8 μ L SEQ ID NO. 4 10 μ mol/LO. 8 μ L SEQ ID NO. 5: 10 μ mol/LI. 5 μ L SEQ ID NO. 6: 10 μ mol/LI. 5 μ L DNA樣品2 μ L 雙蒸水7 μ L總體積20 μ L 其中 Bst 酶緩沖液的成分為 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、質量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 為 8· 8。
3.根據權利要求I所述的一種運用核酸恒溫擴增技術檢測肺炎克雷伯菌的試劑及其擴增方法，其特征在于，核酸擴增程序為61°C，60分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種運用核酸恒溫擴增技術檢測肺炎克雷伯菌的試劑及其擴增方法，設計了六個引物組序列，5’-TACGCCCCGGTCTGAC；5’-GCGCTTTCACCCCCAAC；5’-GTCCCTTTTGCCCGAGGTCGACGGCACGGCCATT；5’-CGACGGCACGGCCATTTGTCCCTTTTGCCCGAGG；5’-TGGCAACGACTGGTCTCGCC；5’-TCGCGTAGGGGGAGGCTGTT。針對肺炎克雷伯菌，本發明克服了現有技術中的缺點，提供一種運用核酸恒溫擴增技術快速低成本的檢測方法。
文檔編號C12Q1/04GK102899419SQ201210448968
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月12日 優先權日2012年11月12日
發明者張霞, 鄭文杰, 劉偉, 張宏偉, 曲鵬, 吳冬雪, 趙良娟, 劉培, 高旗利 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心