專利名稱：一種通用的CaMV 35S啟動子定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學及轉基因檢測技術領域，尤其涉及一種通用的CaMV (花椰菜花葉病毒)35S啟動子定量檢測方法。具體地說，本發明是比對收集到的不同來源的CaMV 35S啟動子序列得到增強子序列中較長的保守區，設計以增強子保守區為檢測靶標序列的引物探針，篩選出特異性強、靈敏度高的CaMV 35S啟動子檢測方法。其應用是該方法可適用于CaMV 35S啟動子篩查原件的的檢測，并解決了原有CaMV 35S啟動子檢測系統中一些檢測方法存在的與檢測靶標的匹配性不完全匹配以及存在多條擴增產物等一些無法解決的問題。
背景技術：
近年來，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等轉基因作物已在很多國家獲準種植和生產，有的被加工成食品、飼料或用作食品添加劑。由于轉基因產品的生態安全和食用安全一直備受爭議，30多個國家和地區相繼實施轉基因產品標識制度。轉基因檢測方法，根據檢測靶標的不同，分為載體特異性檢測、轉化事件特異性檢測和篩查檢測的方法。載體特異性檢測方法利用基因元件之間的邊界序列特征，能夠有效鑒定使用類似基因元件的不同構建體，而且存在序列信息容易獲得的特點，因此被很多研究者所使用。但是，由同一構建體可能獲得不止一個不同特性的轉化株，甚至可能被轉化到不同的物種中，而這些轉化株未必全部經過了安全評估。因此載體特異性檢測方法不能識別不同的轉基因品系，也不能判別該轉基因品系是否已經過安全評估。事件特異性檢測的基礎是轉基因構建體在基因組DNA序列上的整合位點具有高度特異性，即使是相同的載體多次轉化，整合的位置和整合位點特征也是不可重復的。因此，根據不可重復的整合位點特征序列，開發出了事件特異性的檢測方法。與前兩種方法相t匕，事件特異性檢測具有最高的特異性，最適合做轉基因產品的定性和定量檢測。但轉基因構建體的完整信息通常難以獲得，而已知序列基因元件可能距邊界有相當的距離，而且在整合的過程中，載體和基因組之間可能發生復雜的重組，因此，分離旁側序列成為事件特異性檢測的關鍵。篩查方法具有最低的特異性，其追求的是對不同轉基因品種的高覆蓋率。因此轉基因篩查方法往往選擇最常用的轉基因元件作為篩查靶標。來自CaMV的35S蛋白基因啟動子和來自農桿菌Ti質粒NOS基因的終止子是最為常用的轉基因元件。這兩個元件廣泛存在于各種商業化轉基因作物和各種用于研究的轉基因載體系統。因為以上原因，CaMV 35S啟動子和NOS終止子是應用最廣泛的最基本的篩查元件。在眾多的法規和研究論文中，不同機構和研究者提夠了各種不同的篩查檢測方法。但是，在我們的實踐中，我們發現與NOS終止子的檢測方法相比,CaMV 35S啟動子的很多方法在很多品種的檢測中存在這樣那樣的問題。事實上CaMV 35S啟動子是被改造得最為嚴重的轉基因元件之一，不同轉基因品種中的CaMV 35S啟動子的序列可能千差萬別。利用某一方法對不同品種中的CaMV 35S啟動子進行檢測也可能產生完全不同的檢測結果，造成陰性結果、非特異擴增和靈敏度下降等嚴重問題。以上問題影響了 CaMV 35S啟動子作為篩查元件的可靠性，并給轉基因篩查工作造成了困難。

發明內容
本發明的目的就在于克服現有轉基因篩查技術中CaMV 35S啟動子檢測方法在檢測工作中存在的不足，提供一種通用的CaMV 35S啟動子定量檢測方法。本發明的目的是這樣實現的一、一種通用的CaMV 35S啟動子定量檢測方法本方法包括下列步驟①收集CaMV 35S啟動子增強子保守區序列 收集GMDD (GMO Detection Method Database,轉基因檢測方法數據庫，http://gmdd. shgmo. org/)所公布的不同轉化事件來源的CaMV 35S啟動子序列，通過其序列比對結果，以其增強子序列的保守區為檢測靶標，其序列特征是由來源于野生型CaMV 35S啟動子第7018至7344個堿基組成，如圖I所示②利用該序列特征設計引物探針a、合成引物序列如下35SEnhF187 :5’ CATCATTGCGATAAAGGAAAGGC 3’ 和 35SEnhR311:5’ TGCTTTGAAGACGTGGTTGGA 3’ ；b、合成TaqMan探針序列如下35SEnhFP230 :5’ FAM — CCGACAGTGGTCCCAAAGATGG — BHQ13’ ；③PCR 擴增提取樣品總DNA，分別利用上述引物35SEnhF187/35SEnhR311和探針35SEnhFP230組合進行熒光定量PCR擴增；④建立標準曲線以含有CaMV 35S啟動子的轉基因油菜0XY235基因組DNA為研究模型，利用相同濃度非轉基因油菜基因組DNA稀釋至不同含量，以IOOng的混和油菜基因組DNA為模板，進行突光定量PCR反應并建立標準曲線；⑤定量體系的精確性驗證以標準曲線為參照測定含有0XY235基因組DNA的混和油菜基因組DNA樣品中CaMV 35S啟動子的量。工作機理本檢測方法的建立必須包括特異性分析、靈敏度分析以及將待測樣品的Ct值代入已知濃度DNA建立的標準曲線，根據標準曲線計算出待測樣品Ct值對應的拷貝數來進行精確性驗證，本方法均有涉及并且經實驗驗證，具有很高的精確度。二、應用應用于含有CaMV 35S啟動子的轉基因作物的定量檢測已經實驗驗證的可進行定量檢測的轉基因作物包括轉基因油菜0XY235和Topasl9/2 ;轉基因水稻科豐6號和克螟稻；轉基因大豆A2704-12和A5547-127。
與現有CaMV 35S啟動子檢測方法相比，本發明具有下列優點和積極效果I、避免了現有一些CaMV 35S啟動子檢測方法存在的檢測引物/探針與檢測靶標序列不完全匹配的問題；2、避免了現有一些CaMV 35S啟動子檢測方法存在的兩側引物結合位點數不同而引起的多條擴增產物的問題；3、適用于含有CaMV 35S啟動子的轉基因油菜、水稻、大豆等轉基因作物的定量檢測。


圖I是CaMV 35S啟動子增強子序列的保守區序列結構圖；圖2是本方法定量檢測引物探針及其位置圖； 圖3是本方法檢測不同濃度轉基因油菜0XY235定量擴增曲線圖；圖4是本方法檢測不同濃度轉基因油菜0XY235定量擴增標準曲線圖；圖5是本方法檢測轉基因油菜0XY235定量擴增曲線圖；圖6是本方法檢測轉基因油菜Topasl9/2定量擴增曲線圖；圖7是本方法檢測轉基因水稻科豐6號定量擴增曲線圖；圖8是本方法檢測轉基因水稻克螟稻定量擴增曲線圖；圖9是本方法檢測轉基因大豆A2704-12定量擴增曲線圖；圖10是本方法檢測轉基因大豆A5547-127定量擴增曲線圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明詳細說明一、定量檢測方法I、準備工作利用SDS法提取轉基因作物DNA模板先將20%SDS 預熱到 65° C，取 15ml SDS 抽提 buffer(0. ITrisHCl, O. 05MEDTA, IMNaCl pH8. O)加入到50ml離心管，再加入2. 5 μ I β巰基乙醇，混勻；液氮研磨3g左右的轉基因油菜0XY235葉片和Topasl9/2葉片；轉基因水稻科豐6號種子和克螟稻種子；轉基因大豆A2704-12種子和A5547-127種子，將粉末轉至50ml含抽提buffer的50ml離心管中，在振蕩器上振蕩混勻，加入2ml預熱的20%SDS，混勻，65° C水浴至少30分鐘，其間要輕輕搖動試管；水浴后，迅速將離心管置于冰上，加入3ml 3MKAc，混勻，在冰上放置30分鐘；4° C 5000g離心5min ;將上清轉移到新的50ml離心管中，加入2/3體積的異丙醇，混勻，-20° C放置30min以上；6000g，4° C離心15min，倒掉上清，用75%乙醇洗一遍，真空干燥，用超純水溶解DNA，溶解后，將溶液轉移到15ml的離心管中；按DNA溶解體積的1%加蛋白酶K, 55° C水浴30min ;加入等體積苯酹,混勻，輕搖30min,8000g離心IOmin ;轉移上清至新的tube中，加等體積的苯酹-氯仿-異戍醇(25 24 1),輕搖20min, 8000g離心15min ;轉移上清至新的tube中，加等體積的氯仿-異戍醇(24:1 )，輕搖20min, 8000g離心15min ;吸取上清，每管加入5μ I RNase,混勻，37° C水浴Ihr降解RNA ;用等體積的苯酚抽提一次，輕搖20min, 8000g離心15min ;轉移上清至新的離心管中，加等體積的氯仿-異戍醇(24:1),輕搖20min,8000g離心15min ;吸上清加入1/10體積3MNaAC,混勻，加入等體積異丙醇，-20° C放置30min，沉淀DNA ;6000g，4° C離心15min，倒掉上清，用75%乙醇洗2遍，離心去掉75%乙醇，真空干燥；干燥后，用超純水溶解DNA備用。2、具體操作收集GMDD所公布的不同轉化事件來源的CaMV 35S啟動子序列，通過其序列比對結果，以其增強子序列的保守區，如圖I所示，為檢測靶標合成引物，合成引物序列如下35SEnhF187 :5’ CATCATTGCGATAAAGGAAAGGC 3’ 和 35SEnhR311 :5’ TGCTTTGAAGACGTGGTTGGA3’ ；合成 TaqMan 探針序列如下35SEnhFP230 :5’ FAM — CCGACAGTGGTCCCAAAGATGG — BHQ13，；利用本發明中所提供序列設計的CaMV 35S啟動子定量PCR檢測方法合成引物序列如下35SEnhF187:5’ CATCATTGCGATAAAGGAAAGGC 3’ 和35SEnhR311 :5’ TGCTTTGAAGACGTGGTTGGA 3’。合成 TaqMan 探針序列如下35SEnhFP230 5’ FAM — CCGACAGTGGTCCCAAAGATGG — BHQ13’。 針對CaMV 35S啟動子增強子保守區的序列設計引物、探針組合用于熒光定量PCR分析。突光定量 PCR 分析在一臺 CFX96Real_Time System (Bio-Rad, Hercules, USA)上進行，檢測及分析軟件為 CFX Manager Version I. 6 (Bio-Rad, Hercules, USA)。轉基因油菜0XY-235基因組DNA被相同濃度非轉基因油菜DNA稀釋至不同含量，以IOOng的混和油菜基因組DNA為模板，進行熒光定量PCR反應。不同稀釋倍數，分別含100,20,4,0.8,0. 16ng 0XY235基因組DNA的混和DNA樣品被用于建立標準曲線。所有的熒光定量反應都重復4次。CaMV 35S啟動子定量檢測反應體積25 μ 1，含模板DNAl μ 1，其他組分含量為lx TaqMan Universal Master,引物 35SEnhF187 和 35SEnhR311800μ Μ,探針35SEnhFP230400μ Μ。TaqMan反應條件為95° C 2分鐘預變性以后，進行50次PCR循環95° C15秒變性，60° C I分鐘退火及延伸，收集熒光信號。根據標準曲線優化的結果，利用與建立標準曲線相同的PCR反應條件，以標準曲線為參照測定含有0XY-235基因組DNA的混和油菜基因組DNA樣品中0XY-235基因組DNA的量。取IOOng基因組DNA為模板，利用不同含量標準樣品做標準曲線，根據獲得的標準曲線和轉基因樣品的Ct值，計算CaMV 35S啟動子基因組DNA的質量，從而計算出CaMV 35S啟動子在樣品中的含量。所有突光定量反應都重復4次。二、定量檢測方法的應用上述，可進行定量檢測的轉基因作物包括轉基因油菜0XY235和Topasl9/2 ;轉基因水稻科豐6號和克螟稻；轉基因大豆A2704-12和A5547-127。實驗方法 針對CaMV 35S啟動子增強子保守區的序列設計引物引物35SEnhF187和35SEnhR311、探針35SEnhFP230組合用于熒光定量PCR檢測。轉基因油菜0XY235和Topasl9/2 ;轉基因水稻科豐6號和克螟稻；轉基因大豆A2704-12和A5547-127的初始模板濃度均稀釋為20ng/l·! I。CaMV 35S啟動子定量檢測反應體積25 μ I，含模板DNAl μ I，其他組分含量為lx TaqMan Universal Master,引物 35SEnhF187 和 35SEnhR311800μ Μ,探針35SEnhFP230400μ Μ。TaqMan反應條件為95° C 2分鐘預變性以后，進行50次PCR循環95° C15秒變性，60° C I分鐘退火及延伸，觀察擴增情況。所有熒光定量反應都重復4次。三、實驗結果I) CaMV 35S 啟動子 PCR 擴增利用引物35SEnhF187和引物35SEnhR311擴增出約125bp的片段。2)利用本發明中所提供序列設計的CaMV 35S啟動子定量PCR檢測方法利用如圖2所示的引物探針組合，進行熒光定量PCR反應。根據梯度稀釋模板，4次重復獲得的熒光曲線信息，如圖3所示。
為了驗證本研究中建立的定量方法的精確性，我們使用了從標準轉基因油菜0XY-235產品中提取的基因組DNA用非轉基因油菜基因組DNA稀釋至一定含量，并以不含轉基因油菜0XY-235基因組DNA的相同量基因組DNA做對照，作為實時熒光定量PCR反應的模板，并根據相同條件下獲得針對CaMV 35S啟動子的特異性熒光定量PCR反應的標準曲線，計算不同樣品中轉基因油菜基因組DNA的含量。如圖4所示，其R2值為O. 993，表明外源基因的拷貝數與熒光強度都具有良好的對應關系，適合用于外源基因的精確定量。以不含轉基因植物的非轉基因植物基因組DNA為模板，沒有擴增產物被檢測到。對于混和實驗樣品，用本研究中建立CaMV 35S啟動子熒光定量檢測方法來檢測，都和理論值非常接近，誤差小于15%。以轉基因油菜0XY235和Topasl9/2 ;轉基因水稻科豐6號和克螟稻；轉基因大豆A2704-12和A5547-127這六種含有CaMV 35S啟動子的基因組DNA為模板，都有擴增曲線被觀察到，如圖5-10所示，其熒光定量擴增Ct值均處于陽性的范圍內，如下表所示，說明本方法在轉基因檢測領域具有廣泛應用性。
權利要求
1. 一種通用CaMV 35S啟動子定量檢測方法，其特征在于 ①收集CaMV35S啟動子增強子保守區序列 收集 GMDD (GMO Detection Method Database,轉基因檢測方法數據庫,http://gmdd.shgmo. org/)所公布的不同轉化事件來源的CaMV 35S啟動子序列,通過其序列比對結果，以其增強子序列的保守區為檢測靶標，其序列特征是 由來源于野生型CaMV 35S啟動子第7018至7344個堿基組成，如圖I所示 ②利用該序列特征設計引物探針 a、合成引物序列如下35SEnhF187 : 5’ CATCATTGCGATAAAGGAAAGGC 3’ 和 35SEnhR311:5’ TGCTTTGAAGACGTGGTTGGA 3’ ； b、合成TaqMan探針序列如下35SEnhFP230 :5’ FAM — CCGACAGTGGTCCCAAAGATGG — BHQ13’ ； ③PCR擴增 提取樣品總DNA，分別利用上述引物35SEnhF187/35SEnhR311和探針35SEnhFP230組合進行熒光定量PCR擴增； ④建立標準曲線 以含有CaMV 35S啟動子的轉基因油菜0XY235基因組DNA為研究模型，利用相同濃度非轉基因油菜基因組DNA稀釋至不同含量，以IOOng的混和油菜基因組DNA為模板，進行熒光定量PCR反應并建立標準曲線； ⑤定量體系的精確性驗證 以標準曲線為參照測定含有0XY235基因組DNA的混和油菜基因組DNA樣品中CaMV35S啟動子的量。
全文摘要
本發明公開了一種通用的CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動子定量檢測方法，涉及分子生物學及轉基因檢測技術領域。本定量檢測方法是①收集CaMV35S啟動子增強子保守區序列；②利用該序列特征設計引物探針；③PCR擴增；④建立標準曲線；⑤定量體系的精確性驗證。本發明避免了現有一些CaMV35S啟動子檢測方法存在的檢測引物/探針與檢測靶標序列不完全匹配的問題；避免了現有一些CaMV35S啟動子檢測方法存在的兩側引物結合位點數不同而引起的多條擴增產物的問題；適用于含有CaMV35S啟動子的轉基因油菜、水稻、大豆等轉基因作物的定量檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102965435SQ20121045703
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者吳剛, 李偉, 李曉飛, 張麗 申請人:中國農業科學院油料作物研究所