專利名稱：中成藥中人參dna的pcr檢測方法
技術領域：
本發明屬于中成藥真偽性的鑒定方法，具體地說是利用PCR技術檢測中成藥中人參的DNA的一種方法。
背景技術：
傳統的中成藥的質量控制僅限于對藥品性狀上的鑒別以及化合物的含量測定。中藥材制成中成藥，原藥材經多種制劑工藝制成中成藥時其本身的性狀已難以辨別；而中藥本身成分復雜，一味藥就幾十甚至數百個化合物，一個由多種中藥組成的中成藥，其中化學成分就更多了，目前僅選擇有限的幾種化學成分的鑒定來控制中成藥的質量，就為中成藥造假者提供了很大的空間，對于某種價格昂貴的中藥材，例如人參，在制劑過程中不加入人參藥材，僅加入被列為檢測項目的化合物，或者以含有同樣化合物的其他藥材以假充真，本 方法通過PCR的擴增，對經過打粉、提取、過濾后的中成藥仍可以檢測出其中人參的DNA，克服了現有技術的不足，可以簡便、快速、準確地判斷出中成藥中是否使用人參，保證藥品質量。

發明內容
本發明的目的是提供一種PCR檢測中成藥中人參DNA的方法.本發明上述方法是利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增中成藥中人參特異性的DNA來檢測中成藥中的人參DNA。其中所檢測中成藥為含有拉丁學名為Panax ginseng C. A. Mey.、其別名或其炮制品的中成藥。本發明上述方法包括下列步驟I)中成藥中人參DNA的提取；2) PCR 反應；3) PCR擴增產物分析。上述方法中，步驟I)中對于中成藥藥材以藥材粉末入藥的劑型采用改良的CTAB法提取DNA;對于中成藥藥材以提取液入藥的劑型采用乙醇重結晶的方法提取。其中所述的藥材粉末入藥的劑型包括片劑、膠囊和丸劑；所述的提取液入藥的劑型包括口服液和注射液。上述方法中，步驟2)中對于DNA含量較高的樣本采用普通PCR，對于DNA含量較低的樣本采用巢式PCR。其中所述的普通PCR反應的正向引物和反向引物是以人參ITS2序列區域為模板設計的特異性引物，其目的條帶可在80-224bp ;所述的巢式PCR對總基因組DNA依次進行第一輪PCR和第二輪PCR兩次擴增，第一輪PCR擴增產物的DNA片段可在700-1500bp，第二輪PCR與普通PCR相同。具體地，本發明提供的一種PCR檢測中成藥中人參DNA的方法包括下列步驟I.中成藥中人參DNA的提取
根據不同的劑型可選擇合適的提取方法。藥材粉末入藥的藥物包括片劑、膠囊、丸劑等劑型采用改良的CTAB法提取。①藥材適量在研缽中研磨成細粉取粉末少量(1，5mL EP管的最小刻度O. ImL處)于I. 5mL EP管中，加入65°C預熱的CTAB提取緩沖液700μ 1，充分振蕩混勻，65°C溫浴2h ;②樣品冷卻至室溫后加氯仿-異戍醇(24 ；1)600 μ I,顛倒混勻5分鐘！③7500r. mirT1離心10分鐘，轉移上清液至一新的EP管中；④加入等體積_20°C預冷的異丙醇，混勻，20°C放置30分鐘；⑤10，000r. mirT1離心15分鐘，棄上清液； 沉淀用70 %乙醇、無水乙醇各洗滌一次，10，OOOr. mirT1離心3分鐘，棄上清液，室溫揮干乙醇，無菌高純水溶解DNA，備用。所述CTAB提取緩沖液含有2% CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，IOOmM Tris (pH 8. O), 20mMEDTA (pH
8.O) ,2. 5M NaCl。提取液入藥的包括口服液、注射液等采用乙醇重結晶的方法提取。①IOmL藥液加入 ImL 3M 醋酸鈉(pH=5. 2), 30mL 無水乙醇，30 μ I 糖原(glycogen), _20°C放置 1.5h。②14, OOOr. mirT1離心10分鐘,棄上清。③70%乙醇洗漆，16, OOOr. mirT1離心5分鐘,棄上 清。④揮干乙醇，無菌高純水溶解DNA，備用。2.普通PCR反應體系及條件IOXTaq buffer 5 μ I ； Taq 酶 5 個單位；正向引物ΙμΜ;反向引物 μΜ;dNTPs O. 2mM ；DNA 提取液 I μ I.95 °C解鏈3分鐘；94 V變性30秒，55 °C復性30秒，72 °C延伸30秒，循環30次；72 °C延伸5分鐘，得擴增樣品。3.巢式PCR反應體系及條件第一輪PCR 10 X Taq buffer 5 μ I ； Taq 酶 5 個單位；正向引物O. 25μΜ;反向引物O. 25μΜ;dNTPs O. 2mM ；DNA 提取液 5 μ I.95°C解鏈3分鐘；94°C變性30秒，60°C復性30秒，72°C延伸30秒，循環25次；72°C延伸5分鐘，得擴增樣品。第二輪PCR同普通PCR操作。4. PCR擴增產物分析取5 μ I擴增后的樣品，與I μ I 6倍DNA上樣緩沖液混合，在含有Gelview核酸染料的瓊脂糖膠上進行電泳和顯色，在透射紫外燈下觀察，樣品孔含有一條目的條帶的為含有人參或污染的陽性樣品。本發明原理為通過CTAB法或者乙醇重結晶的方法可以提取出中成藥中植物的DNA, PCR反應試劑管中含有多聚酶鏈式反應試劑，可對試劑管中人參的DNA進行特異的擴增，由于本發明的引物為人參所特有，因此，如果樣品中含有人參，那么它的DNA特異片段在經過擴增后，在含有Gelview核酸染料的瓊脂糖膠上進行電泳和顯色，紫外光檢測就可以探測到一定長度片段的目的條帶，如果沒有人參，則不能擴增到同樣長度片段的目的條帶。本發明具有明顯優于現有技術的優點，其主要優點包括
新穎性。本方法是首次將PCR檢測DNA的方法應用到中成藥的真偽性的鑒別上。快速性。采用本發明方法檢測十分快速，4-6小時即可得知檢測結果。靈敏性。由于DNA本身的穩定性，通過各種制劑工藝的加工之后仍然不會被完全破壞，再通過PCR(聚合酶鏈式反應)指數型的擴增，以及巢式PCR作為輔助手段可以檢測到極微量的DNA。


圖I是具體實施例I檢測結果瓊脂糖膠圖；其中A為陰性對照，B為片劑，C為陽性對照，D為Marker。圖2是具體實施例2檢測結果瓊脂糖膠圖；A為陰性對照，B為注射劑，C為陽性對照，D 為 Marker。
具體實施例方式下面結合附圖，通過實例進一步說明本發明。本領域的技術人員應理解，這些實例僅用于說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。實施例I、檢測人參北芪片中人參的DNA按照以下配方制備人參DNA提取試劑CTAB提取緩沖液2% CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，IOOmMTris (pH 8. O)，20mMEDTA(pH 8. O), 2. 5M NaCl0異丙醇、氯仿、無水乙醇、70%乙醇、滅菌水。按照下列程序進行檢測I.人參對照藥材DNA的提取①藥材適量在研缽中研磨成細粉取粉末少量(I. 5mL EP管的最小刻度O. ImL處)于1.5mL EP管中，加入65°C預熱的CTAB提取緩沖液700μ 1，充分振蕩混勻，65°C溫浴2h ；②樣品冷卻至室溫后加氯仿一異戊醇(24 ；1) 600 μ 1，顛倒混勻5分鐘7500r. mirT1離心10分鐘，轉移上清液至一新的EP管中；④加入等體積-20°C預冷的異丙醇，混勻，20°C放置30分鐘； 10，OOOr. mirT1離心15分鐘，棄上清液； 沉淀用70%乙醇、無水乙醇各洗滌一次，10，OOOr. mirT1離心3分鐘，棄上清液，室溫揮干乙醇，無菌高水溶解DNA，備用。2.人參北芪片中植物DNA的提取(同對照藥材DNA提取方法)3. PCR 擴增正向引物GGGGCGGATAATGGC反向引物ACGACATGAGAAGAGGGCPCR反應體系IOXTaq buffer 5 μ I ； Taq 酶 5 個單位；正向引物ΙμΜ;反向引物ΙμΜ;dNTPs O. 2mM ；DNA 提取液 I μ I ;超純滅菌水將體系補足到50 μ I。并同時設置對照藥材DNA提取液和超純滅菌水分別作為陽性對照、陰性對照。PCR反應條件95 °C解鏈3分鐘；94 V變性30秒，55 °C復性30秒，72 °C延伸30秒，循環30次；72°C延伸5分鐘，得擴增樣品。
4. PCR擴增產物分析將人參對照藥材PCR產物送測序公司測序，序列正確。取5 μ I擴增后的樣品，與I μ I 6倍DNA上樣緩沖液混合，在含有Gelview核酸染料的瓊脂糖膠上進行電泳和顯色，在透射紫外燈下觀察，樣品孔含有一條與陽性對照相同位置的目的條帶說明該藥品中已加入人參藥材。檢測結果瓊脂糖膠圖如附圖I所示。實施例2、檢測參麥注射液中人參的DNA陽性對照的制備以及設置同實例I.按照下列程序進行檢測 I.參麥注射液中人參DNA的提取①IOmL注射液加入ImL 3Μ醋酸鈉(pH=5. 2), 30mL無水乙醇，30 μ I糖原(glycogen)，_20°C放置I. 5h。②14, OOOr. mirT1離心10分鐘,棄上清。③70%乙醇洗漆,16，OOOr. mirT1離心5分鐘，棄上清。④揮干乙醇，無菌高水溶解DNA，備用。2.巢式 PCR第一輪PCR 正向引物CACACC GCC CGT CGC TCC TAC CGA反向引物ACTCGC CGT TAC TAG GGG AAPCR反應體系IOXTaq buffer 5 μ I ； Taq 酶 5 個單位；正向引物O. 25μΜ; 反向引物O. 25μΜ;dNTPs O. 2mM ；DNA 提取液 I μ I ;超純滅菌水將體系補足到50 μ I。并同時設置對照藥材DNA提取液和超純滅菌水分別作為陽性對照、陰性對照。PCR反應條件95°C解鏈3分鐘；94°C變性30秒，60°C復性30秒，72°C延伸30秒，循環25次；72 0C延伸5分鐘，得擴增樣品。第二輪PCR正向引物GGGGCGGATAATGGC反向引物ACGACATGAGAAGAGGGCPCR反應體系10 X Taq buffer 5 μ I ； Taq 酶 5 個單位；正向引物ΙμΜ;反向引物 μΜ;dNTPs O. 2mM ；第一輪 PCR 產物 I μ I ;超純滅菌水將體系補足到50 μ I。并取第一輪中等量的陰性對照和陽性對照同時擴增分別作為陰性對照、陽性對照。PCR反應條件95 °C解鏈3分鐘；94 V變性30秒，55 °C復性30秒，72 °C延伸30秒，循環30次；72°C延伸5分鐘，得擴增樣品。3.巢式PCR擴增及產物分析取5 μ I擴增后的樣品，與I μ I 6倍DNA上樣緩沖液混合，在含有Gelview核酸染料的瓊脂糖膠上進行電泳和顯色，在透射紫外燈下觀察，樣品孔含有一條與陽性對照相同位置的目的條帶說明該藥品中已加入人參藥材。 檢測結果瓊脂糖膠圖如附圖2所示。
權利要求
1.一種中成藥中人參DNA的PCR檢測方法，其特征在于，所述方法是利用PCR擴增中成藥中人參特異性的DNA來檢測中成藥中的人參DNA。
2.根據權利要求I所述的檢測方法，其特征在于所檢測中成藥為含有拉丁學名為Panax ginseng C. A. Mey.、其別名或其炮制品的中成藥。
3.根據權利要求I或2所述的檢測方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟 1)中成藥中人參DNA的提取； 2)PCR反應； 3)PCR擴增產物分析。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟I)中對于中成藥藥材以藥材粉末入藥的劑型采用改良的CTAB法提取DNA;對于中成藥藥材以提取液入藥的劑型采用乙醇重結晶的方法提取。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，其中所述的藥材粉末入藥的劑型包括片齊U、膠囊和丸劑；所述的提取液入藥的劑型包括口服液和注射液。
6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，對于DNA含量較高的樣本采用普通PCR，對于DNA含量較低的樣本米用巢式PCR。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的普通PCR反應的正向引物和反向引物是以人參ITS2序列區域為模板設計的特異性引物，其目的條帶可在80-224bp。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的巢式PCR對總基因組DNA依次進行第一輪PCR和第二輪PCR兩次擴增，第一輪PCR擴增產物的DNA片段可在700-1500bp，第二輪PCR與普通PCR相同。
全文摘要
本發明涉及分析檢測技術領域，公開了一種利用聚合酶鏈式反應(PCR)檢測中成藥中人參的DNA從而鑒定中成藥中人參真偽性的方法。具體包括中成藥中人參DNA的提取、提取核酸的擴增、擴增產物瓊脂糖凝膠檢測、結果判斷等一套檢測操作程序。本發明在普通PCR的基礎上，建立巢式PCR反應方法，可快速、準確、靈敏地檢測中成藥中的人參，為中成藥的質量控制提供簡單快速有效的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102827940SQ20121033870
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月13日 優先權日2012年9月13日
發明者唐卓, 陳蓉 申請人:中國科學院成都生物研究所