專利名稱：豬偽狂犬病毒、疫苗組合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一株豬偽狂犬病毒、疫苗組合物及其應用。
背景技術：
豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus)屬于抱疫病毒科中抱疫病毒亞科豬抱疫病毒I型，能引起急性傳染的豬偽狂犬病(Aujeszky' s disease)。豬偽狂犬病在世界范圍內大流行，對全球的養豬業危害極大，造成巨大的經濟損失。豬發生偽狂犬病以后，其臨床癥狀取決于感染豬的年齡、病毒株的毒力、感染的劑量和途徑。成年豬一般呈隱性感染，懷孕母豬可導致流產、死胎、木乃伊和種豬不育等綜合癥候群。15日齡以內的仔豬發病死亡率可達100%，斷奶仔豬發病率40%，死亡率20%左右；對成年肥豬可引起生長停滯，增重緩慢等。目前本病被認為是威脅養豬生產和引起死亡的主要疾病之一。·
疫苗接種是有效防制豬偽狂犬病最經濟、有效的方法。我國目前預防豬偽狂犬病的疫苗主要Bartha -K61株和BUK株等基因缺失弱毒活疫苗，弱毒疫苗免疫效果好沿用多年，至今在偽狂犬病的防制中仍起著重要作用。但是在實際生產中該病并沒有得到很好的控制，其中存在的問題引起疫苗研究者的重視。首先，弱毒疫苗可引起潛伏感染，并有散毒的危險，部分接種豬盡管血清中存在中和抗體，但排毒期仍可持續數年。其次，弱毒疫苗株在動物體內可能會與野毒或不同的基因缺失疫苗株之間發生基因重組從而變成強毒株成為新的傳染源。再次，未經充分致弱或過度致弱的疫苗株不僅不能誘導足夠的免疫保護反應，反而可能引起疾病及免疫抑制。對仔豬來說，其體內的母源抗體一定程度上影響了弱毒活疫苗的免疫效果。所以，豬偽狂犬滅活疫苗比弱毒疫苗能更有效地預防和控制偽狂犬病。但是，現有技術中存在的豬偽狂犬滅活疫苗的免疫效果、抗體持續期都不理想。

發明內容
本發明的目的是提供一株豬偽狂犬病毒PRV-JS株，該毒株對目前流行的豬偽狂犬病毒有很好的免疫原性。本發明的另一目的是提供一種疫苗組合物，該疫苗組合物免疫豬抗體水平較高，持續期長。本發明還提供豬偽狂犬病毒PRV-JS株在制備預防由豬偽狂犬病毒所致疾病藥物中的應用。本發明的目的采用如下技術方案實現
豬偽狂犬病毒PRV-JS株，其微生物保藏號是=CGMCC NO. 6604。豬偽狂犬病毒PRV-JS株的保藏信息如下
生物材料(株)=PRV-JS
分類命名豬皰疹病毒I型
拉丁文學名Pseudorabies virus
保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所 保藏日期2012年9月24日 保藏編號CGMCC NO. 6604.
一種疫苗組合物，包括滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株和獸藥學上可接受的佐劑。該疫苗組合物還包括獸藥學上可接受載體。所述疫苗組合物的制備方法，包括如下步驟
制備水相將吐溫-80與滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株病毒液按體積比4 96混合均勻，得到水相；
制備油相將司本-80與注射用白油按照體積比為6 94混勻，得到油相；
乳化將油相和水相按照體積比為3 1混合并乳化，獲得所述疫苗組合物。 本發明還提供豬偽狂犬病毒PRV-JS株在制備預防由豬偽狂犬病毒所致疾病藥物中的應用。所述疾病為豬偽狂犬病毒引起的仔豬神經癥狀、母豬繁殖障礙及種豬不育癥。該疫苗組合物還包括獸藥學上可接受載體。本發明從各地豬場分離的豬偽狂犬病流行毒株中篩選出豬偽狂犬病毒PRV-JS株，該毒株具有良好的免疫原性，可作為滅活疫苗生產毒株及檢驗用毒種。本發明提供的疫苗組合物免疫后，豬產生的抗體水平較高，持續期長。采用本發明制備的疫苗組合物可用于預防豬偽狂犬病毒引起的母豬繁殖障礙、種豬不育癥及其它豬的偽狂犬病。


圖I接種了含毒材料的BHK21細胞的照片。圖2正常BHK21細胞的照片。圖3斷奶仔豬攻毒后的體溫變化。圖4是發病豬各組織PCR鑒定的電泳圖，其中泳道I-陰性對照，泳道2-腦，泳道3-淋巴，泳道4-肺，泳道5-腎，泳道6-脾，泳道7-2000 DNA Maker。圖5仔豬免疫豬偽狂犬病滅活疫苗后的ELISA抗體水平。圖6顯示攻毒后仔豬的體溫變化。圖7豬偽狂犬病滅活疫苗免疫后備母豬ELISA抗體消長規律。
具體實施例方式實施例I豬偽狂犬病毒的獲得和特性測定 I.病毒分離
采集我國江蘇南京地區某一養豬場發病仔豬的脾、肺、腎、淋巴組織作為含毒材料。先將含毒材料無菌操作置于乳缽中，然后加入滅菌生理鹽水5ml，反復磨細；在每毫升處理過的含毒材料中加入青霉素200U和鏈霉素200U，混勻，將其放入-20 1冰箱內反復凍融3次，每次快凍快融以使病毒能從破碎的細胞中釋放出來；12000 r/min離心lOmin，取上清接種至BHK21細胞(購買自ATCC，即美國模式培養物集存庫)培養。培養2天后，與正常BHK21細胞(圖2)相比，含毒材料接種的BHK21細胞出現明顯拉網樣病變(圖I)。將培養物凍融2次后，獲得病毒液。
2.病毒鑒定
提取本實施例標題I中所獲病毒液中的DNA，具體步驟如下取病毒液400 μ L，加入12. 5 μ L蛋白酶K和50 μ L、濃度為10%的SDS溶液，混勻，56°C作用30min ;依次加入200 μ L氯仿和200 μ L苯酚，劇烈振蕩15s，室溫放置5min ；4°C，12000轉離心IOmin ;取上清，加入等體積的氯仿混勻，室溫放置5min ；4°C, 12000轉離心IOmin ;取上清加入2倍體積的無水乙醇和I / 10體積、濃度為3M的乙酸鈉溶液，_20°C放置30min ；4°C, 12000轉離心IOmin ；棄上清，加入75%的乙醇1000 μ L洗滌；4°C，7500轉離心5min ;棄上清，干燥IOmin ;加入15 μ L雙蒸水溶解沉淀并作為模板進行PCR擴增。設計一對gE蛋白基因區域引物進行PCR鑒定，上游引物PRV-F (SEQ ID NO: I):CCCTGGACGCGAACGGCACGATG ;下游引物 PRV-R (SEQ ID NO:2): GGGTGGCACGCGGTCTCGAAGCA。PCR 擴增的反應體系(50ul):模板 5 μ L, GC Buffer 25 μ L, Mg2+ 3 μ L, dNTP2 μ L, PRV-F I μ L, PRV-R I μ L, Taq DNA 聚合酶 O. 5 μ L，H2O 12. 5 μ L。 PCR 反應程序94°C 預變性 5min ;進入循環94°C 60s，68°C 60s, 72°C 60s, 35個循環；72°C延伸IOmin。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將PCR擴增出的目的片段進行測序，結果顯示片段為850bp，具體序列如SEQ ID NO: 3所示。在NCBI進行BLAST分析，發現測序的片段與豬偽狂犬病毒基因相似率達到98%以上(結果見表1)，證明此毒株為豬偽狂犬病毒。表I目的片段序列分析比對
序列號 [SII相似
__￥_
AY683136.I SuidherpesvirusIstrainSHglycoproteingl(US7)andglycoproteingE(US8)genes, partialcds99%
AF171937.I Suidherpesvirusl(strainEa)glycoproteingE(gE)gene, completecds99%
AY249861.I PseudorabiesvirusgIycoproteingE(gE)andIIkDaprote ingenes, completecds;and28kDaproteingene, partialcds98%
AY170318.I PseudorabiesvirusstrainMin-AglycoproteinE(gE)gene, completecds98%
AF306511.I PseudorabiesvirusEaglycoproteinI(gl)gene, completecds99%
AY173124.I PseudorabiesvirusstrainLAglycoproteinE(gE)gene, completecds99%
GQ926932.I SuidherpesvirusIstrainLXB6glycoproteinEgene, completecds99%
EF552427.I SuidherpesviruslstrainGDSHglycoproteingE(gE)gene, completecds99%
所有酶和試劑盒均購自TaKaRa公司。將本實施例步驟I所得病毒液中含有的病毒命名為豬偽狂犬病毒PRV-JS株，并送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，其微生物保藏號是CGMCC NO. 6604。3、病毒培養
將BHK21細胞接種至含10% FCS (胎牛血清)的DMEM培養液(Gibco公司)培養，當BHK21細胞生長覆蓋率達80%，去培養液。按感染復數為O. 005接種本實施例標題I所得病毒液，加入維持液于37°C培養。培養36-48h，顯微鏡下觀察，細胞達80%CPE (細胞病變)時，凍融收獲。連續傳代2代，收獲豬偽狂犬病毒PRV-JS株病毒液(縮寫為PRV-JS株病毒液)。所述維持液為含有2%FBS的DMEM液(Gibco公司)。4、病毒檢測
取本實施例標題3所得PRV-JS株病毒液進行下述檢測
(O無菌檢驗取PRV-JS株病毒液接種T. G小管及G. A斜面各2支，每支接種量為
O.2ml，接種后的T.G小管和G. A斜面分別取I支置37°C培養，其它則置于25°C培養，觀察3-5日。無菌生長為合格。培養5日后觀察均無細菌、霉菌生長，證明分離到的PRV-JS株中不含有細菌和霉菌。(2)病毒含量將PRV-JS株病毒液用DMEM液作10倍系列稀釋，取10_5、10'10_7三個稀釋度，每個稀釋度分別接種至生長良好的BHK21細胞培養板(96孔)，每孔接種量為
O.Iml，然后向各孔分別加入O. Iml含2% (體積濃度)小牛血清的DMEM液，同時設立DMEM液陰性對照孔，37°C下培養，觀察細胞病變(CPE)，計算TCID5tlt5結果顯示該病毒的滴度為每
O.I 毫升彡 IO6-5TCID500(3)家兔致病力試驗將PRV-JS株病毒液頸部肌肉接種家兔。接種PRV-JS株病毒的家兔36-42小時內死亡，接種部位暴露出紅色肌肉組織，四肢呈角弓反張狀態。對照組兩只家兔健康無異常。
(4)仔豬致病力試驗將PRV-JS株病毒液頸部肌肉注射接種2頭斷奶仔豬，接種劑量為2. O mL /頭。被攻毒斷奶仔豬分別編號為攻毒-I和攻毒_2。同時設對照組，包括兩頭斷奶仔豬，分別編號為對照-I和對照-2，均不接種。如圖3所示，攻毒后I天，被攻毒豬體溫升高，對照豬正常。觀察5日，攻毒豬精神沉郁，發抖，嘔吐、腹瀉，其中I頭豬有神經癥狀，攻毒后第4天死亡。剖檢，腎臟有針尖大的出血點，腦膜充血、出血病變。分別將發病豬腦、肺、脾、腎和淋巴組織進行PCR擴增，結果各組織均擴增約850bp的目的基因片段(見圖4)。實施例I結果表明分離到的毒株為豬偽狂犬病毒，接種BHK21細胞具有很高的病毒滴度，對家兔及斷奶仔豬具有很強的致病力。實施例2制備含滅活豬偽狂犬病毒PRV-JS株的疫苗組合物 UBHK21細胞種子繁殖及擴大培養
從液氮罐中取出凍存的BHK21細胞管，迅速置37°C水浴融化，將細胞移入裝有IOmlDMEM培養基的離心管中，IOOOrpm離心5分鐘。棄上清液，用生長液懸浮細胞，之后加入細胞培養瓶中，于37°C、5%C02條件下培養。當細胞覆蓋率達100%時，用O. 1%胰酶-EDTA液消化細胞。按體積比I :3傳代培養。所述生長液為含10%FBS (新生牛血清)的DMEM液。2、病毒培養
將細胞生長覆蓋率達80%的BHK21細胞培養物，去生長液。按感染復數為O. 5%接種PRV-JS株病毒液，加入含2%FBS的DMEM液，37°C培養。當顯微鏡下觀察到細胞達80% CPE時，收獲病毒液，連續傳代3代。當病毒含量達到107_°TCID5(i/0. Iml為合格。3、病毒液的滅活
在病毒含量合格的病毒液中加入甲醛，使甲醛的終濃度達到O. 1% (體積濃度)，于37°C作用24小時,其間每隔I小時攪拌或振搖一次,獲得滅活后的病毒液。滅活結束后置2-8°C,可保存I個月。4、滅活檢驗
將滅活后的病毒液用DMEM液I :10稀釋后，接種生長致密的BHK21細胞培養板(6孔)，接種量為每孔O. Imlo另外每孔加入含2%小牛血清的DMEM液2ml，同時設立陰性對照孔，37 °C下培養，觀察細胞病變(CPE )。盲傳3代，如果無細胞病變(CPE )則表明滅活完全。5、制備含滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株的疫苗組合物
制備水相將吐溫-80與滅活病毒液按體積比4 96混合均勻，即得到水相。
油相將司本-80與注射用白油按照體積比為6 94混勻均勻，即得到油相。乳化將油相和水相按照體積比為3 1進行混合并乳化，得到含滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株的疫苗組合物。乳化質量需要達到規定的質量標準。含滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株的疫苗組合物(簡稱為豬偽狂犬病滅活疫苗)用于預防偽狂犬病毒引起的母豬繁殖障礙、種豬不育癥及其它豬的偽狂犬病。本疫苗的接種途徑是頸部肌肉注射。實施例3豬偽狂犬病滅活疫苗的安全檢驗
檢驗按照實施例2方法制備的豬偽狂犬病滅活疫苗的安全性。每批疫苗用偽狂犬抗體陰性的30-35日齡健康仔豬和健康懷孕母豬各5頭，每頭肌肉注射2頭份(4ml)豬偽狂犬病滅活疫苗，另設置不接種疫苗的同類型豬作對照組。
接種后觀察14天，所有試驗豬觀察指標包括體溫、精神、食欲等局部和全身反應，結果見表2。通過表2可以看出所有試驗豬精神、體溫、食欲等均未見異常。疫苗接種仔豬未見疫苗接種引起的異常反應；疫苗接種懷孕母豬正常妊娠，無流產發生(每批中對照組的結果一致，所以未在表中列出)。因此該豬偽狂犬病滅活疫苗是安全的。表2滅活疫苗安全檢驗結果
權利要求
1.豬偽狂犬病毒PRV-JS株，其微生物保藏號是=CGMCCNO. 6604。
2.一種疫苗組合物，其特征在于包括滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株和獸藥學上可接受的佐劑。
3.根據權利要求2所述疫苗組合物，其特征在于該疫苗組合物還包括獸藥學上可接受載體。
4.權利要求2所述疫苗組合物的制備方法，包括如下步驟 制備水相將吐溫-80與滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株病毒液按體積比4 96混合均勻，得到水相； 制備油相將司本-80與注射用白油按照體積比為6 :94混合均勻，得到油相； 乳化將油相和水相按照體積比為3 1混合并乳化，獲得所述疫苗組合物。
5.豬偽狂犬病毒PRV-JS株在制備預防由豬偽狂犬病毒所致疾病藥物中的應用。
6.根據權利要求5所述豬偽狂犬病毒PRV-JS株在制備預防由豬偽狂犬病毒所致疾病藥物中的應用，其特征在于所述疾病為豬偽狂犬病毒引起的仔豬神經癥狀、母豬繁殖障礙及種豬不育癥。
全文摘要
本發明提供豬偽狂犬病毒、疫苗組合物及其應用，屬于生物技術領域。本發明的豬偽狂犬病毒PRV-JS株，其微生物保藏號是CGMCCNO.6604。本發明還提供疫苗組合物，包括滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株和獸藥學上可接受的佐劑。該疫苗組合物還包括獸藥學上可接受載體。本發明從各地豬場分離的豬偽狂犬病流行毒株中篩選出豬偽狂犬病毒PRV-JS株，該毒株具有良好的免疫原性，可作為滅活疫苗生產毒株及檢驗用毒種。本發明提供的疫苗組合物免疫后，豬產生的抗體水平較高，持續期長。采用本發明制備的疫苗組合物可用于預防豬偽狂犬病毒引起的母豬繁殖障礙、種豬不育癥及其它豬的偽狂犬病。
文檔編號C12R1/93GK102952785SQ20121046748
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月19日 優先權日2012年11月19日
發明者唐波, 張道華, 張雪花, 侯繼波 申請人:江蘇省農業科學院