專利名稱：Stc細胞生產高效豬偽狂犬病活疫苗工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及獸用生物制品技術領域。
背景技術：
豬偽狂犬病是威脅養豬業的兩大傳染病之一，我國主要通過預防接種偽狂犬活疫 苗來控制該病。目前國內各獸用生物制品企業生產豬偽狂犬病活疫苗均采用雞胚成纖維原 代細胞。而雞胚成纖維原代細胞往往采用水解乳蛋白培養基培養，水解乳蛋白中含有很多 未知的動物蛋白成分，在臨床應用中有很多過敏反應發生。另外，雞胚成纖維細胞繁殖的偽 狂犬病毒含量多在106_°TCID5(i/0. lml左右。國外已采用豬睪丸(ST)傳代細胞生產豬偽狂 犬病活疫苗，國內還沒有生物制品企業采用傳代細胞生產豬偽狂犬病活疫苗。ST細胞對培 養基和牛血清要求比較嚴格，所以培養比較困難。很多科研機構都在篩選適應于病毒株的 細胞株，以用于科研或生產。

發明內容
將ST細胞進行多次克隆，最后篩選了 STC細胞克隆株。該細胞株易于培養，且對 豬偽狂犬病毒(Batha K/61gI_株)高度敏感，用于生產高效豬偽狂犬病活疫苗。


圖1 ST (A)、STC (B)培養24小時細胞形態圖2 PRV接種ST (A)和STC (B)細胞后24小時細胞病變圖3 ST細胞生長曲線圖4 PRV在克隆STC細胞的生長曲線圖5 STC細胞外源病毒檢測結果M :標準分子且 2000bp DNA Ladder ;Lane 2\4\6\8 :STC 克隆細胞；Lanel :DNA 病毒PCV1 PCR產物，分子量大小413bp ；Lane3 RNA病毒BVDV RT-PCR產物，分子量大小 290bp ；Lane5 :RNA 病毒 EMCV RT-PCR 產物，分子量大小 186bp ；Lane7 :RNA 病毒 HCV RT-PCR 產物，分子量大小375bp ；Lane 9 :陰性對照。圖6支原體檢驗結果(A :支原體陽性對照
具體實施例方式1.對PRV Batha K/61gI_株敏感的ST細胞系的篩選1) ST母細胞的連續有限稀釋將保存的ST母細胞株稀釋成單個細胞鋪于96孔細胞 板，10天左右觀察孔內細胞克隆數，將單個克隆繼續稀釋成單個細胞，即亞克隆，經三次亞 克隆后，挑單克隆株進行擴大培養，并接毒、觀察細胞病變，檢測其對PRV Batha K/61gI_株的易感性如何，將篩選得到的PRV Batha K/61g1-株易感的ST細胞株命名為STC。2)用測定TCID5tl方法對ST的單克隆株進行篩選將ST細胞克隆株接種于96孔細胞培養板內，待細胞長滿單層接種PRV Batha K/61g1-株(實驗室保存)，于36. 5°C 37. 5°C 3% 5% CO2培養72h，觀察細胞病變，計算TCID5tl。3)高滴度PRV Batha K/61gI_株培養細胞ST克隆株的獲得挑選TCID5tl最高的ST細胞克隆株進行傳代并冷凍保存。2. ST細胞系的特性研究2.1細胞形態研究分別取等量的ST母細胞、克隆株STC細胞接種于6孔板中，24h后待細胞長滿單層觀察其形態差異(圖1，A和B);分別于兩株細胞接種等量病毒(100TCID5(l/ml)，接種后于24h (圖2，A和B)觀察細胞病變。2. 2細胞生長速度研究取約I X IO5個細胞接種于6孔板中培養，分別于第8、16、24、32、48、56、64和72小時取其中I孔細胞進行染色、計數，每個孔做3個重復，該實驗重復3次。表I細胞生長速度(個/ml)
權利要求
1.STC細胞的特點及用途 ST細胞為豬睪丸細胞，體外培養呈貼壁生長、并可進行連續傳代培養。ST細胞培養比較困難，對營養要求較高。克隆的STC細胞株易于培養。PRV可在STC細胞上繁殖，產生CPE,因此可用于生產豬偽狂犬病活疫苗。
2.根據I所述的STC細胞克隆株，是通過以下方法獲得的 DST母細胞的連續有限稀釋將保存的ST母細胞株稀釋成單個細胞鋪于96孔細胞板，10天左右觀察孔內細胞克隆數，將單個克隆繼續稀釋成單個細胞，即亞克隆，經三次亞克隆后，挑單克隆株進行擴大培養，并接毒、觀察細胞病變，檢測其對PRV Batha K/61gl_株的易感性如何，將篩選得到的PRV Batha K/61 gl_株易感的ST細胞株命名為STC ; 2)用測定TCID50方法對ST的單克隆株進行篩選將ST細胞單克隆株接種于96孔細胞培養板內，待細胞長滿單層接種PRV BathaK/61 gl_株(實驗室保存)，于36. 5°C 37. 5°C 3% 5% C02培養72h，觀察細胞病變，計算TCID50 ； 3)高滴度PRVBatha K/61 gl_株培養細胞ST克隆株的獲得挑選TCID50最高的ST細胞克隆株進行傳代并冷凍保存。
3.對1、2中篩選保存的STC細胞的特性進行鑒定 鑒定內容包括細胞形態、細胞生長曲線、對PRV Batha K/61 gl_株敏感性的穩定性檢測、TCID50測定、病毒生長曲線及外源微生物的檢測。
全文摘要
本發明涉及獸用生物制品技術領域。STC細胞生產高效豬偽狂犬病活疫苗工藝的研究包括高滴度偽狂犬病毒(Batha K/61 gI-株)敏感的ST培養細胞克隆株的建立、篩選和鑒定。為獲得能穩定且產生高滴度偽狂犬病毒(Batha K/61 gI-株的ST細胞系，對ST母細胞進行有限稀釋后進行了連續的細胞克隆，獲得1株對PRV具有高敏感性的STC細胞系。接種100TCID50/ml PRV，測定STC和ST細胞繁殖的PRV病毒滴度分別為108.5TCID50、107.0TCID50，并且PRV病毒在STC細胞中產生和積累的速度要快于ST母細胞，從而表明STC細胞系對PRV更為敏感，可用于生產高效豬偽狂犬病活疫苗。
文檔編號C12N5/071GK103060262SQ20121035173
公開日2013年4月24日 申請日期2012年9月21日 優先權日2012年9月21日
發明者尹秀鳳, 陳念劬, 徐凱 申請人:南京天邦生物科技有限公司