一種豬瘟、豬偽狂犬病活疫苗在制備治療或預防豬瘟和豬偽狂犬病的藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種豬瘟、豬偽狂犬病活疫苗在制備治療或預防豬瘟和豬偽狂犬病的藥物中的應用，其中，該豬瘟活疫苗、豬偽狂犬病活疫苗滴鼻免疫仔豬。該豬瘟和豬偽狂犬活疫苗在有效預防仔豬的豬瘟和豬偽狂犬病的同時，顯著降低了豬呼吸道疾病，能有效預防呼吸道綜合征的發生。
【專利說明】一種豬瘟、豬偽狂犬病活疫苗在制備治療或預防豬瘟和豬 偽狂犬病的藥物中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種豬瘟、豬偽狂犬病活疫苗的應用。

【背景技術】
[0002] 豬癌（Classical Swine fever,簡稱 CSF)，又稱為豬霍亂（Hog cholera)，是一 種豬只急性或超急性發熱的病毒傳染性疾病，臨床上的特征是散播迅速、發燒，解剖檢驗 時可看到典型的出血病變。豬瘟可感染各種年齡的豬只，一年四季流行，發病率和死亡 率均高，對豬只危害極大。該病是威脅養豬業最重要的傳染病之一，世界動物衛生組織 (OIE)將豬瘟列為A類16種法定傳染病之一，中國則定為一類烈性傳染病。豬偽狂犬病 (Pseudorabies，PR)是多種動物共患的傳染病，是能引起家畜和野生動物急性致死性的傳 染病，以發熱、奇癢和腦脊髓炎為主要癥狀，豬是其自然易感宿主，主要引起妊娠母豬流產、 死胎和木乃伊胎，仔豬感染主要是神經癥狀，成年豬則以隱性感染為主，該病已成為種豬繁 殖障礙綜合癥的主要病因。
[0003] 免疫接種是豬瘟和豬偽狂犬病防制的重要措施，目前市場上有豬瘟活疫苗和豬偽 狂犬病活疫苗單苗出售，為有效預防豬瘟和豬偽狂犬病的發生，需單獨免疫上述兩種活疫 苗。目前，我國豬癌活疫苗推薦的免疫時間為斷奶前后，一般為4?6周免疫；而豬偽狂犬 活疫苗推薦的免疫時間為斷奶后，一般為6?10周免疫。由于豬瘟活疫苗和豬偽狂犬病活 疫苗免疫時間比較晚，不能阻止這兩種病毒早期（2?5周）感染仔豬，從而導致這兩種疫 病的發生。另外，豬瘟活疫苗和豬偽狂犬病活疫苗的免疫途徑為肌肉免疫，不能刺激仔豬的 粘膜免疫應答，因此不能有效阻止這兩種病毒通過呼吸道感染，同時亦不能阻止其他豬呼 吸道綜合征病原的感染，從而導致豬呼吸道綜合征的發生。
[0004] 專利申請CN101690808A公開了使用豬瘟、偽狂犬病二聯活疫苗防治這兩種疫病， 并詳述了二聯疫苗的制備方法，但未公開二聯疫苗的免疫效果。然而，該專利申請中制備的 疫苗未公開具體的應用方法，而目前，我國豬瘟活疫苗推薦的免疫時間為斷奶前后，一般為 4?6周免疫；而豬偽狂犬活疫苗推薦的免疫時間為斷奶后，一般為6?10周免疫。由于 豬瘟活疫苗和豬偽狂犬病活疫苗免疫時間比較晚，不能阻止這兩種病毒早期（2?5周）感 染仔豬，從而導致仔豬中這兩種疫病的發生。
[0005] 碩士論文《豬瘟和豬偽狂犬病二聯苗免疫干擾現象的研究》（賀衛潔，2010年）公 開了二聯活疫苗不同時間免疫仔豬對免疫效果的相互影響，但疫苗免疫方式為肌肉注射， 仔豬日齡為斷奶前后。由于豬瘟活疫苗和豬偽狂犬病活疫苗的免疫途徑為肌肉免疫，不能 刺激仔豬的粘膜免疫應答。因此不能有效阻止這兩種病毒通過呼吸道感染，同時亦不能阻 止其他豬呼吸道綜合征病原的感染，從而導致豬呼吸道綜合征的發生。
[0006] 此外，豬瘟疫苗和豬偽狂犬疫苗采用肌肉途徑接種仔豬后，在母源抗體存在的情 況下，病毒將中和保護性抗體，降低疫苗的免疫保護。當免疫途徑為肌肉免疫時，將干擾疫 苗抗體的產生，從而降低疫苗免疫效果。 現有技術中公開的豬偽狂犬活疫苗基因缺失或弱毒株有：SA215株（CCTCC，保藏編號 V200002)、HB-98 株、Bartha 株、Bartha-K61 株、Bucharest 株、BUK 株、H 株（GCMCC，保藏號 為 No. 5013)和 C 株（CCTCC,保藏編號 V201114)。 其中，HB-98株、Bartha株、Bartha_K61株、Bucharest株、BUK株均為商業上可以獲得 的菌株。 SA215株的保藏編號為V200002,保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，公開于中國 專利申請 CN101186902A。 豬偽狂犬病毒H株的保藏編號為No. 5013,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心CGMCC，公開于中國專利申請CN102344912A。 豬偽狂犬病毒C株的保藏編號為V201114,保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，公 開于中國專利申請CN102399755B。


【發明內容】

[0007] 為解決現有技術的不足，本發明提供了一種豬瘟、豬偽狂犬病活疫苗的應用，所述 豬瘟和豬偽狂犬活疫苗在有效預防仔豬的豬瘟和豬偽狂犬病的同時，顯著降低了豬呼吸道 疾病，能有效預防呼吸道綜合征的發生。
[0008] 本發明的主要目的在于提供一種豬瘟、豬偽狂犬病活疫苗在制備治療或預防豬瘟 和豬偽狂犬病的藥物中的應用，其中，所述豬瘟活疫苗、豬偽狂犬病活疫苗滴鼻免疫仔豬。
[0009] 優選地，所述豬癌活疫苗為豬癌兔化弱毒株疫苗，豬偽狂犬活疫苗為基因缺失或 弱毒疫苗。
[0010] 所述豬瘟兔化弱毒株購自中國獸醫藥品監察所，保藏號為AV1412。
[0011] 所述豬偽狂犬活疫苗基因缺失株SA215株，保藏于中國典型培養物保藏中心， 保藏日期為2000年3月28日，保藏地址為中國武漢?武漢大學，保藏編號為CCTCC No : V200002,公開于專利 CN101186902。
[0012] 更優選地，所述豬瘟活疫苗為脾毒適應株，中國獸醫藥品監察所保藏，保藏號為 AV1412,所述豬偽狂犬活疫苗基因缺失或弱毒株為SA215株（CCTCC，保藏編號V200002)、 HB-98 株、Bartha 株、Bartha-K61 株、Bucharest 株、BUK 株、H 株（GCMCC，保藏號為 No. 5013) 和C株（CCTCC，保藏編號V201114)的一種或任意幾種的組合。
[0013] 優選地，所述豬瘟和豬偽狂犬活疫苗為二聯苗，仔豬的日齡為0?10天，免疫劑量 均為0.5?2.0頭份/頭。
[0014] 優選地，豬瘟和豬偽狂犬活疫苗同時免疫仔豬，仔豬的日齡為0?10天，免疫劑量 均為0.5?2.0頭份/頭。
[0015] 根據權利要求1所述的應用，其中，豬瘟和豬偽狂犬活疫苗同時免疫仔豬，仔豬的 日齡為0?10天，免疫劑量均為0.5?2.0頭份/頭。
[0016] 更優選地，仔豬的日齡為0?3天，免疫劑量均為I. 0頭份/頭。
[0017] 本發明通過將豬瘟活疫苗和豬偽狂犬病活疫苗于0?10天（優先0?3天）滴 鼻免疫仔豬，解決目前這兩種疫苗免疫時間和方式不妥造成的問題，阻止這兩種病毒早期 (2?5周）感染仔豬，從而阻止這兩種疫病的發生；同時有效阻止這兩種病毒通過呼吸道 感染仔豬，亦阻止其他豬呼吸道綜合征病原的感染，從而阻止豬呼吸道綜合征的發生；另 夕卜，可突破母源抗體的干擾，保證疫苗的免疫效果。

【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人 員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0019] 本發明實施例以豬瘟兔化弱毒株、豬偽狂犬病毒基因缺失株SA215株說明本發 明。
[0020] 實施例1豬瘟、豬偽狂犬病二聯活疫苗的制備
[0021] 1.豬瘟、豬偽狂犬病毒抗原的制備
[0022] I. 1生產用毒種的制備
[0023] 豬瘟兔化弱毒株的制備：將豬瘟兔化弱毒株（購自中國獸醫藥品監察所，保藏號 為AV1412)用病毒稀釋液（無血清的DMEM培養基）作適當稀釋，按感染復數（Μ. 0.1)為 〇. 1接種于ST細胞單層（購自CCTCC，編號⑶C0060)培養，37°C吸附30min，加入含3% (v/ v)犢牛血清的DMEM細胞維持液，37°C培養3?5日，凍融2?3次，收獲病毒，病毒效價 彡 106· 5TCID5cZml。
[0024] 豬偽狂犬病毒基因缺失株（SA215株）的制備：將豬偽狂犬病毒基因缺失株 (SA215株，為TK_/gE7gr三基因缺失，公開于中國專利CN101186902,該毒株以保藏編號 V200002保藏于CCTCC)用病毒稀釋液（無血清的DMEM培養基）作適當稀釋，按感染復數 (Μ. 0. I)為0. 1接種于ST細胞（購自CCTCC，編號⑶C0060)培養，37°C吸附30min，加入含 3% (v/v)犢牛血清的DMEM細胞維持液，37°C培養2?4日，凍融2?3次，收獲病毒，病毒 效價彡 Kf 5TCID5cZml。
[0025] 1. 2病毒液的培養制備
[0026] 豬瘟兔化弱毒株病毒液的制備：用轉瓶細胞培養法。將長滿單層的ST細胞，倒去 細胞培養液，將毒種液按Μ. 0. I = 0. 1的接種量接種于ST細胞上，輕輕旋轉細胞瓶2周， 37°C吸附30min，加入細胞維持液，置37°C旋轉（10?12轉/小時）培養。每日觀察1? 2次，細胞生長良好，37°C培養3?5日收獲細胞和細胞液，凍融3次，置-20°C以下保存。
[0027] 豬偽狂犬病毒基因缺失株（SA215株）病毒液的制備：用轉瓶細胞培養法。將長 滿單層的ST細胞，倒去細胞培養液，將毒種液按Μ. 0. I = 0. 1的接種量接種于ST細胞上， 輕輕旋轉細胞瓶2周，37°C吸附30min，加入細胞維持液，置37°C旋轉（10?12轉/小時） 培養。每日觀察1?2次，細胞生長良好，37°C培養2?4日收獲細胞和細胞液，凍融3次， 置-20°C以下保存。
[0028] 1. 3病毒液的處理
[0029] 豬瘟兔化弱毒株病毒液的處理：將病毒液用中空纖維濾柱（孔徑ΙΟμπι與 0. 45 μ m)過濾，除去細胞碎片。
[0030] 豬偽狂犬病毒基因缺失株病毒液的處理：將病毒液用中空纖維濾柱（孔徑10 μ m 與0. 45 μ m)過濾，除去細胞碎片。
[0031] 1.4含量測定
[0032] I. 4. 1豬癌兔化弱毒株病毒含量測定
[0033] 將病毒用含2%羊血清細胞維持液作10倍梯度系列稀釋，從KT1到10'每個稀釋 度接種8個孔，同時設立陰性不接毒對照，放入5% CO2溫箱中37 °C培養48?72h，80% (v/ v)丙酮固定，用間接免疫熒光抗體（IFA)方法測定每個稀釋度含有豬瘟病毒陽性細胞（綠 色熒光）的孔數，根據Reed-Muench法計算病毒TCID 5tl，結果為病毒的含量彡IO6 5TCID5tl/ ml 〇
[0034] 1. 4. 2豬偽狂犬病毒基因缺失株（SA215株）病毒含量測定
[0035] 將收獲的病毒液做10倍系列稀釋，取10'10'10'10'1(Γ95個稀釋度，分別接 種ST細胞單層的96孔細胞培養板上，每個稀釋度接種8個孔，同時設立陰性不接毒對照， 放入5% CO2溫箱中37°C培養48?72h，觀察細胞病變（CPE)，根據Reed-Muench法計算病 毒TCID 5tl，結果為病毒的含量彡108_ 5TCID5Q/ml。
[0036] 1. 4. 3抗原含量測定結果
[0037] 按上述的方法生產了豬瘟兔化弱毒株和豬偽狂犬病毒基因缺失株（SA215株）病 毒抗原，根據Reed-Muench法計算，結果豬瘟兔化弱毒株病毒液含量為10 6_ 7TCID5(l/ml，根據 Reed-Muench法計算，豬偽狂犬病毒基因缺失株（SA215株）病毒液含量為IO8 7TCID5tZml。
[0038] 2.配苗
[0039] 2. 1豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒二聯疫苗配制
[0040] 將豬瘟病毒（病毒含量為I. ox 104_°TCID5Q/頭份）和豬偽狂犬病毒（病毒含量為 I. OXIO6 qTCID5q/頭份），混合后于同一容器內，按I : 1(V/V)比例加入凍干保護劑（含 5%乳糖、10%脫脂牛奶水溶液），充分搖均，定量分裝，分裝后迅速進行冷凍真空干燥后即 得疫苗成品，制備出豬瘟、豬偽狂犬病二聯疫苗（即豬瘟、豬偽狂犬病二聯活疫苗）（批號為 試 Z001)。
[0041] 實施例2豬瘟、豬偽狂犬活疫苗不同免疫方式對仔豬的安全性試驗
[0042] 1.材料
[0043] 豬瘟活疫苗（兔弱毒化株）和豬偽狂犬病活疫苗（Bartha_K61株）購至普萊柯 生物工程股份有限公司（批號分別為1207035和1202001B)，豬瘟、豬偽狂犬病二聯活疫苗 (批號為試Z001)為實施例1制備。
[0044] 2.動物試驗設計
[0045] 選剛出生3日齡仔豬105頭，分為5組，第1?4組為試驗組，25頭/組，第1組仔 豬左側鼻腔滴鼻接種豬瘟活疫苗2. Oml (2頭份/頭），右側鼻腔滴鼻接種豬偽狂犬病活疫 苗2. Oml (2頭份/頭）；第2組仔豬左側頸部肌肉注射豬瘟活疫苗2. Oml (2頭份/頭），右 側頸部肌肉注射豬偽狂犬病活疫苗2. Oml (2頭份/頭），第3組仔豬左側鼻腔滴鼻接種豬 瘟、豬偽狂犬病二聯活疫苗4. Oml (2頭份/頭，每個鼻腔2ml)，第4組仔豬左側頸部肌肉注 射豬瘟、豬偽狂犬病二聯活疫苗4. Oml (2頭份/頭）第5組為對照組（5頭）。在疫苗免疫 后14天，測定仔豬的體溫，觀察仔豬的精神和食欲狀況。
[0046] 仔豬副反應結果判定標準：仔豬在疫苗免疫后4小時，出現躺臥、嘔吐、呼吸困難、 休克、死亡等副反應，賦值2分，仔豬無副反應賦值0分。
[0047] 仔豬體溫結果判定標準：仔豬在疫苗免疫后3天內，體溫升高至40. (TC的時間24 小時以上，賦值2分，仔豬無體溫升高賦值0分。
[0048] 仔豬精神狀況結果判定標準：仔豬在疫苗免疫后14天內，出現精神萎靡、食欲下 降等臨床癥狀，賦值2分，仔豬無任何臨床癥狀賦值0分。
[0049] 3.試驗結果
[0050] 試驗結果如表1。從疫苗的副反應結果比較來看，疫苗滴鼻免疫仔豬后，組1為 1/25仔豬出現了副反應，而肌肉注射后組2有4/25仔豬出現了副反應，組3沒有仔豬出現 副反應，組4有3/25仔豬出現了副反應；從疫苗免疫后體溫結果比較來看，疫苗滴鼻免疫 仔豬后，組1無仔豬出現了副反應，而肌肉注射后組2有3/25仔豬出現了體溫升高，組3沒 有仔豬出現副反應，組4有3/25仔豬出現了副反應；疫苗免疫后14天的精神狀況結果比 較來看，組1疫苗滴鼻免疫仔豬后，僅1頭仔豬出現了精神異常，而肌肉注射后組2有4/25 仔豬出現了精神異常，組3為僅1頭仔豬出現了精神異常，組4有3/25仔豬出現了精神異 常。通過t-test檢驗表明，疫苗滴鼻組和疫苗肌肉注射組存在顯著差異，因此，豬瘟活疫苗 和豬偽狂犬病活疫苗同時免疫時以及采用豬瘟偽狂犬二聯活疫苗，采用滴鼻免疫方式，能 顯著降低疫苗免疫后的不良影響，比疫苗肌肉注射安全、有效。
[0051] 表1疫苗不同免疫方式對仔豬的安全性試驗結果
[0052]

【權利要求】
1. 一種豬瘟、豬偽狂犬病活疫苗在制備治療或預防豬瘟和豬偽狂犬病的藥物中的應 用，其中，所述豬瘟活疫苗、豬偽狂犬病活疫苗滴鼻免疫仔豬。
2. 根據權利要求1所述的應用，其中，所述豬瘟活疫苗為豬瘟兔化弱毒株疫苗，豬偽狂 犬活疫苗為基因缺失或弱毒疫苗。
3. 根據權利要求2所述的應用，其中，所述豬瘟活疫苗為脾毒適應株，中國獸醫藥品監 察所保藏，保藏號為AV1412,所述豬偽狂犬活疫苗基因缺失或弱毒株為SA215株（CCTCC，保 藏編號 V200002)、HB-98 株、Bartha 株、Bartha-K61 株、Bucharest 株、BUK 株、Η 株（GCMCC， 保藏號為No. 5013)和C株（CCTCC，保藏編號V201114)的一種或任意幾種的組合。
4. 根據權利要求1所述的應用，其中，所述豬瘟和豬偽狂犬活疫苗為二聯苗，仔豬的日 齡為0?10天，免疫劑量均為0. 5?2. 0頭份/頭。
5. 根據權利要求1所述的應用，其中，所述豬瘟和豬偽狂犬活疫苗同時免疫仔豬，仔豬 的日齡為0?10天，免疫劑量均為0. 5?2. 0頭份/頭。
6. 根據權利要求4或5所述的應用，其中，仔豬的日齡為0?3天，免疫劑量均為1. 0 頭份/頭。
【文檔編號】A61K39/245GK104288761SQ201310304316
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月18日 優先權日:2013年7月18日
【發明者】張許科, 孫進忠, 田克恭 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司