專利名稱：一種提高豬體細胞核移植效率的方法
技術領域：
本發明涉及一種動物克隆的方法，具體涉及一種提高豬體細胞核移植效率的方法。
背景技術：
體細胞核移植技術是通過顯微操作和細胞融合技術，將供體細胞移入去核卵母細胞而構成重構胚，激活重構胚后進行培養和移植，最后達到擴繁同基因型種群的目的。自1997年〃Dolly〃羊出生以來，體細胞核移植技術相繼在多種哺乳動物中獲得成功，2000年，Betthauser等優化了豬體細胞核移植的各個步驟，包括卵母細胞來源和體外成熟培養、供體細胞培養、卵的激活、胚胎體外培養和胚胎移植技術，建立了一套相對成熟的豬體細胞核 移植程序。但至今，豬體細胞核移植的效率還很低(出生數/所用卵數約為1%_2%)，克隆豬常出現不健全的異常表型，如畸形、肺部發育不全、大舌頭和早衰等。在核移植中，體細胞核的基因表達模式必須經歷從高度分化的體細胞狀態轉變成全能性胚胎狀態，即表觀遺傳重編程。主要包括DNA去甲基化和從頭甲基化、印記基因模式重編、基因羥甲基化和乙酰化修飾改變等。表觀遺傳調節分子機制主要通過DNA序列甲基化和組蛋白修飾兩大機制來實現。兩者能調控染色質的結構和功能從而影響基因的表達。在自然受精過程中，精子會在卵胞質的作用下進行重編程，啟動其正常發育。體細胞的表觀遺傳構造不同于成熟配子，但在受體卵胞質的作用下可明顯逆轉其高度分化的基因表達模式。檢測克隆胚胎時發現一些與胚胎發育相關的關鍵基因沒有被激活或表達水平過低，胚胎呈現DNA過度甲基化和低乙酰化水平，表明基因組重編程不完全。研究已發現供體核不完全重編程造成基因表達異常，是核移植效率低的主要原因。目前，大量研究采用甲基轉移酶抑制劑5-aza_2’-deoxycytidine或去乙酰化酶抑制劑TSA處理核供體細胞或克隆早期胚胎，但這兩種藥物都具有一定的毒副作用。此法在提高小鼠的體細胞核移植效率上有一定效果，對豬克隆胚胎的發育能力沒有顯著提高。Scriptaid是一種人工合成的低毒性去乙酰化酶抑制劑，已有相關研究發現培養液中添加500nM的Scriptaid處理豬的克隆早期胚胎能顯著提高其體外發育的囊胚率。

發明內容
本發明的發明目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種提高豬體細胞核移植效率的方法。為實現上述發明目的，本發明采用如下技術方案一種提高豬體細胞核移植效率的方法，包括以下步驟SI、選擇和培養卵母細胞；S2、分離和培養供體細胞；S3、采用盲吸法去除成熟卵母細胞核及第一極體，注入一個供體細胞于卵周隙中；電融合重構胚并激活重構胚；
S4、將重構胚置于含有濃度為100-200 μ M的RG108和濃度為100_500ηΜ的Scriptaid的ΡΖΜ-3培養液中培養14-16小時，再將重構胚置于ΡΖΜ-3培養液中培養；本發明篩選到一定濃度的RG108和Scriptaid聯合處理克隆早期胚胎，能顯著提高豬克隆早期胚胎的發育囊胚率和囊胚質量；同時調節存在緊密聯系和協同作用的基因甲基化和乙酰化兩大表觀遺傳修飾，比單獨用Scriptaid處理的效果更好，能調節胚胎早期基因表達趨于正常，最終提高豬體細胞核移植效率。本發明的優選方案，在S2步驟中選取豬耳皮成纖維細胞作為供體細胞；在豬的體細胞核移植中，耳皮成纖維細胞是最為常用的核供體，因為它易于取材和分離，在體外能夠進行相對較長時間的傳代培養。本發明的優選方案，分離豬耳皮成纖維細胞包括以下步驟將豬耳皮組織塊剪碎；用DMEM清洗組織碎末后用胎牛血清重懸并轉移到培養皿中，37°C、5%C02、飽和濕度環境中 培養；5-7h后添加含10%胎牛血清的DMEM培養液；待細胞長至90%匯合時傳代培養；用第3-5代的接觸抑制的耳皮成纖維細胞作為核供體。本發明的優選方案，在S4步驟中，所述RG108的濃度為100-150 μ M。本發明的優選方案，在S4步驟中，所述RG108的濃度為100 μ Μ。本發明的優選方案，在S4步驟中，所述Scriptaid的濃度為100_150ηΜ。本發明的優選方案,在S4步驟中，所述Scriptaid的濃度為ΙΟΟηΜ。本發明的優選方案，在S4步驟中，將重構胚置于含有RG108和Scriptaid的PZM-3培養液中培養14小時，再移入PZM-3培養液中培養。本發明的有益效果，本發明通過在PZM-3培養液添加一定濃度的RG108和Scriptaid聯合處理克隆早期胚胎，能顯著提高豬克隆早期胚胎發育的囊胚率和囊胚內細胞數。研究中對囊胚等級劃分多從輪廓清晰度，細胞質是否致密均勻和形態是否典型來加以評估。囊胚內細胞數多是優質囊胚的一個必備條件。RG108和Scriptaid同時調節存在緊密聯系和協同作用的基因甲基化和乙酰化兩大表觀遺傳修飾，比單獨用Scriptaid處理的效果更好，能調節胚胎早期基因表達趨于正常，最終提高豬體細胞核移植效率。


圖I為注入一個供體細胞于卵母細胞卵周隙示意圖；(A固定針固定卵母細胞及極體的位置；B去核針去除極體及附近的胞質；C注核針吸取供體細胞；D注核針將供體細胞注入卵周隙中)圖2為熒光顯微鏡下觀察一個囊胚的總細胞數。(A囊胚在白光下的圖像；B囊胚的熒光圖像)
具體實施例方式未注明具體方法的實驗，都按照常見的體細胞克隆技術所述的方法進行操作。I :豬卵母細胞的體外成熟培養從屠宰場收集豬卵巢，放入生理鹽水中送回實驗室。用注射器抽吸直徑2_6mm卵泡中的液體。在實體顯微鏡下挑選卵丘致密且包裹3層以上的卵丘細胞-卵母細胞復合體，39°C、5%C02、飽和濕度環境中培養42-44h。采用透明質酸酶去除卵丘細胞，挑選排出第一極體的卵母細胞作為核移植受體。2 :豬耳皮成纖維細胞培養簡要無菌操作如下將豬耳皮組織塊剪碎，用DMEM (Gibco)清洗組織碎末后用適量胎牛血清重懸并轉移到培養皿中，37°C、5%C02、飽和濕度環境中培養。5-7h后添加含10%胎牛血清的DMEM培養液，觀察組織塊周圍細胞爬出情況，待細胞長至90%匯合時傳代培養。用第3-5代的接觸抑制的耳皮成纖維細胞作為核供體。3 :體細胞核移植采用盲吸法去除成熟卵母細胞核及第一極體，注入一個體細胞于卵周隙中(圖I)。150v/mm, 100 μ s, 2DC的直流電脈沖誘導融合并激活重構胚，39 °C，低氧(5%02+5%C02+90%N2)的飽和濕度環境下培養，對照組的胚胎培養于PZM-3中。實驗組則在PZM-3培養液添加Scriptaid，或者同時添加RG108和scriptaid。藥物處理14_16h后換成PZM-3培養。·4 :克隆胚胎發育情況觀察胚胎培養至48h和168h時記錄卵裂數和囊胚數。在發育第7天收集囊胚，放入含10 μ g/mL Hoechst33342的DPBS中染色IOmin后轉移到載玻片上，輕蓋上蓋玻片使囊胚受壓后膨大，用指甲油封片。熒光顯微鏡下觀察囊胚內細胞數，藍色為囊胚內細胞的核(圖2)。采用SAS軟件對實驗數據進行方差分析，比較不同藥物處理組的胚胎早期發育情況，包括其囊胚率和囊胚內細胞數的差異(表I)。表I
組別重構胚數(重復數) 卵裂率(％) 囊胚率(％) 囊胚內細胞數
對照組307(3)80.67±1.23 18.48 土 0.95c 30.67±1.20d—Μ)卿)78.24土L52 26.51 ±0.60b 46.67±0.88c
RG108(200pM)+,bh
318(3)8U4 土 (X60 28.76 ±0.62 52.33 + 1.45
Scriptaid(500nM)
Εβ108(100μΜ)+,aa
P . .,,315(3)80.59±1.21 33.36士0.94a 56.33土0.88a
Scriptaid( I OOnM)注統計分析3次重復試驗的數據，計算其平均值土標準差。同一列中的不同小寫字母代表差異顯著(P < O. 05)。結果表明，使用Scriptaid處理豬克隆胚胎的囊胚率和囊胚內細胞數顯著高于對照組。使用100 μ M RG108和IOOnM Scriptaid同時處理豬克隆胚胎的囊胚率和囊胚內細胞數顯著高于Scriptaid處理組和對照組。使用200 μ M RG108和500nM Scriptaid同時處理胚胎的囊胚率與Scriptaid處理組差異不顯著，但兩組間囊胚內細胞數差異顯著。
權利要求
1.一種提高豬體細胞核移植效率的方法，其特征在于包括以下步驟 S1、選擇和培養卵母細胞； S2、分離和培養供體細胞； S3、采用盲吸法去除成熟卵母細胞核及第一極體，注入一個供體細胞于卵周隙中；電融合重構胚并激活重構胚； S4、將重構胚置于含有濃度100-200μΜ的RG108和濃度100_500ηΜ的Scriptaid的ΡΖΜ-3培養液中培養14-16小時，再將重構胚置于ΡΖΜ-3培養液中培養。
2.如權利要求I所述的提高豬體細胞核移植效率的方法，其特征在于在S2步驟中選取豬耳皮成纖維細胞作為供體細胞。
3.如權利要求2所述的提高豬體細胞核移植效率的方法，其特征在于，選取豬耳皮成纖維細胞包括以下步驟將豬耳皮組織塊剪碎；用DMEM清洗組織碎末后用胎牛血清重懸并轉移到培養皿中，37°C、5%C02、飽和濕度環境中培養；5-7h后添加含10%胎牛血清的DMEM培養液；待細胞長至90%匯合時傳代培養；用第3-5代的接觸抑制的耳皮成纖維細胞作為核供體。
4.如權利要求I所述的提高豬體細胞核移植效率的方法，其特征在于在S4步驟中，所述RG108的濃度為100-150 μ Μ。
5.如權利要求I所述的提高豬體細胞核移植效率的方法，其特征在于在S4步驟中，所述RG108的最佳濃度為100 μ M0
6.如權利要求I所述的提高豬體細胞核移植效率的方法，其特征在于在S4步驟中，所述 Scriptaid 的濃度為 100_150ηΜ。
7.如權利要求I所述的提高豬體細胞核移植效率的方法，其特征在于在S4步驟中，所述Scriptaid的最佳濃度為ΙΟΟηΜ。
8.如權利要求I所述的提高豬體細胞核移植效率的方法，其特征在于在S4步驟中，將重構胚置于含有RG108和Scriptaid的PZM-3培養液中培養14小時，再移入PZM-3培養液中培養。
全文摘要
本發明公開了一種提高豬體細胞核移植效率的方法，包括以下步驟S1、選擇和培養卵母細胞；S2、分離和培養供體細胞；S3、采用盲吸法去除成熟卵母細胞核及第一極體，注入一個供體細胞于卵周隙中；電融合重構胚并激活重構胚；S4、將重構胚置于含有濃度為100-200μM的RG108和濃度為100-500nM的Scriptaid的PZM-3培養液中培養14-16小時，再將重構胚置于PZM-3培養液中培養；本發明能顯著提高豬克隆早期胚胎的發育囊胚率和囊胚質量；同時調節存在緊密聯系和協同作用的基因甲基化和乙酰化兩大表觀遺傳修飾，比單獨用Scriptaid處理的效果更好，能調節胚胎早期基因表達趨于正常，最終提高豬體細胞核移植效率。
文檔編號C12N15/877GK102943093SQ20121047426
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月20日 優先權日2012年11月20日
發明者吳珍芳, 賀曉燕, 許衛華, 石俊松, 周榮 申請人:廣東溫氏食品集團股份有限公司