專利名稱：一種大鼠腎小管上皮細胞缺血后處理的細胞模型的建立方法
技術領域：
本發明涉及一種大鼠腎小管上皮細胞缺血后處理的細胞模型的建立方法，適用于大鼠腎小管上皮細胞缺血再灌注損傷的保護研究。
背景技術：
缺血再灌注損傷是指組織缺血一段時間，當血流重新恢復后，組織的損傷程度較缺血時進一步加重、器官功能進一步惡化的綜合征。在缺血性疾病搶救和治療過程中，醫學 家們漸漸發現，對組織造成損傷的主要因素，不是缺血本身，而是恢復血液供應后，過量的自由基攻擊這部分重新獲得血液供應的組織內的細胞造成的。缺血預處理是一種可以減輕組織缺血再灌注損傷的方法，雖然這種方法對缺血再灌注損傷有強力的保護作用，但是由于在臨床工作中，患者組織器官發生缺血缺氧的不可預見性，使得其臨床應用受到了很大的限制。近年來，有研究者提出另外一種內源性腎臟保護形式——缺血后處理，是指在腎臟較長時間缺血后再灌注時，首先給予腎臟數次短時間的再灌注缺血循環，然后才給予腎臟充分的再灌注。雖然缺血后處理與缺血預處理能夠取得相似的保護作用，但與缺血預處理不同的是，缺血后處理具有更好的臨床應用前景。國內外的許多研究結果顯示，缺血后處理可以減輕大鼠(Liu X, Chen H, Zhan B, et al. Attenuation of reperfusioninjury by renal ischemic postconditioning: the role of NO. Biochem Biophys ResCommun. 2007; 359: 628-34.)、兔(鄒平，龔明，張春燕等；缺血后處理對腎缺血-再灌注損傷兔血液流變學及腎組織細胞凋亡的影響.2010，37(19))、犬(Jiang BT，Liu XH,Chen H, Ischemic postconditioning attenuates renal ischemic/reperfusion injuryin mongrel dogs[J]· Urology, 2010，76: 1519. el-1519. e7.)缺血再灌注動物模型的腎臟損傷。目前，關于腎臟缺血后處理的研究大部分是在動物模型上實現的。借助于動物模型的研究，可以有意識地改變那些在自然條件下不可能或不易排除的因素，以便更準確地觀察模型的實驗結果并與人類腎臟缺血再灌注的結果進行比較研究，有助于更方便、更有效地認識人類腎臟缺血再灌注的發生發展規律，研究防治措施。國外許多大鼠缺血后處理的動物模型研究中發現，單次后處理時間過長、后處理循環次數過少都有可能限制其腎臟保護作用的發揮。我們的前期研究結果顯示，缺血后處理對大鼠(Chen H，Xing BZ, LiuXH, et al. Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after renal ischemia/reperfusion injury in rat[J]. Transplant International, 2008，21:364-371.)、狗(Jiang BT, Liu XH, Chen H, Ischemic postconditioning attenuates renal ischemic/reperfusion injury in mongrel dogs [J]. Urology, 2010, 76: 1519. el-1519. e7.)的腎臟缺血再灌注均有保護作用。結果還顯示，采用反復6次恢復血供10 s -阻斷血供10 s的后處理方法，與其他相比，其腎功能指標明顯改善，細胞凋亡明顯降低。
由于很多因素的限制，動物模型很難精確地模擬臨床上腎臟缺血后處理的情況。缺血后處理的細胞模型與動物模型相比有許多優勢，其中最突出的是，細胞模型提供了一個單一的環境，在這個環境里特定的刺激可以被分離、控制，同時我們可以評價它們對于缺血再灌注損傷病理生理方面的貢獻和作用。國外研究報道關于心肌細胞(Sun HY, WangNP， Halkos Mj et al. Postconditioning attenuates cardiomyocyte apoptosis viainhibition of JNK and p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathways.Apoptosis. 2006; 11: 1583-93) (Sun HYj Wang NP，Kerendi F，et al. Hypoxicpostconditioning reduces cardiomyocyte loss by inhibiting ROS generation andintracellular Ca2+ overload. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005; 288:H1900-8) (Wang HCj Zhang HF， Guo WYj et al. Hypoxic postconditioning enhancesthe survival and inhibits apoptosis of cardiomyocytes following reoxygenation:role of peroxynitrite formation. Apoptosis. 2006; 11: 1453-60.)單純缺氧后處理模型的應用，其缺點是單純考慮缺氧復氧導致的損傷，不能模擬缺血再灌注損傷過程中除缺氧外還有PH值、二氧化碳分壓、血清、糖等能量供給，因而不能全面模擬體內缺血過程，更不能較好模擬后處理過程中各種養分的緩慢恢復的過程。關于腎小管上皮細胞缺血再灌注損傷的細胞模型，已有國外學者實現(Sauvant C，Schneider Rj Holzinger H，et al.　Implementation of an in vitro Model System for Investigation of ReperfusionDamage after Renal Ischemia [J]. Cellular Physiology and Biochemistry,2009, 24:567-576.)，但是在此基礎上的缺血后處理細胞模型，國內外暫無相關報道。近年來，國內外學者都在積極尋求發展一種模擬腎臟缺血后處理的體外細胞模型，這個模型可以讓科學家在沒有混雜因素影響的情況下研究腎小管上皮細胞缺血后處理的保護機制。此模型同樣適用于其它易受缺血再灌注損傷器官如肝、腦及心的相應細胞系的研究。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種大鼠腎小管上皮細胞缺血后處理的細胞模型的建立方法，該細胞模型適用于所有關于大鼠缺血后處理對再灌注損傷的研究，能清楚的顯示在細胞水平下特定處理對于缺血再灌注損傷的直接作用與影響。為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案。一種大鼠腎小管上皮細胞缺血后處理的細胞模型的建立方法，是通過二氧化碳培養箱、三氣培養箱、完全培養液、對照緩沖液、缺血緩沖液、CO2及N2模擬動物體內實驗的缺血后處理過程，依次包括如下步驟
(1)接種于35mm規格的培養皿的NRK-52E細胞同步化24h后，將培養皿中的液體更換為缺血緩沖液并置于含O. 5% O2和5% CO2的三氣培養箱中，于飽和濕度、37°C培養3小時，模擬缺血過程；
(2)向培養皿中添加O.5ml新鮮的完全培養液,置于二氧化碳培養箱(空氣氧濃度、5%CO2、飽和濕度、37°C)中培養lOmin，模擬再灌注過程；再將培養皿置于三氣培養箱(O. 5%O2,5% CO2、飽和濕度、37°C)中培養lOmin，模擬缺氧過程；
此20min為一個循環,記為HPl組,完成兩個循環記為HP2組,完成三個循環記為HP3
組；(3)最后培養皿中的液體更換為完全培養液2mL在二氧化碳培養箱中(空氣氧濃度、5%CO2、飽和濕度、37°C)培養至指定的時間點，以完成整個缺血后處理的細胞模型。在本發明的一個優選方案中，在每個再灌注開始之前，保留原有的缺血緩沖液，在此基礎上加入O. 5mL (少于原有缺血緩沖液)的新鮮完全培養液，使缺血緩沖液緩慢變換為接近正常的完全培養液。在本發明的一個優選方案中，缺血緩沖液應用bicarbonate — MES緩沖的林格氏液，每 IL 中含有 NaHCO3 O. 378g, Na2HPO4 O. 114g, NaH2PO4 O. 024g, NaCl 6. 201g, KCl0. 402g, CaCl2 0. 133g, MgCl2 0. 076g, MES3. 9g,用 I mmol/L 的 NaOH 調整 pH 至 6. 6。本發明與現有的動物模型技術相比具有以下優點和效果
1、更加精確的模擬缺血后處理的微環境；
2、造模速度快，缺血后處理三個循環的時間為一個小時，加上模擬缺血的時間三小時，整個缺血及后處理的時間僅為四個小時；
3、方法步驟簡單，易于操作；
4、可同時進行高層次的機制研究；
5、可同樣適用于其它易受缺血再灌注損傷器官的細胞水平研究。


圖I Hoechst檢測結果，其中A :正常組，B :缺血再灌注組，C :缺血后處理組。圖2 BAX、BCL-2 的 western 表達結果。圖 3 Cleaved_Caspase3、Caspase-3、Caspase-8 的 western 表達結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明要求保護的范圍，下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規條件如D.L.斯佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗指南。實施例I大鼠腎小管上皮細胞缺血后處理細胞模型所需條件的組成
A).儀器及耗材二氧化碳培養箱(ThermoForma)、三氣培養箱(長沙華曦電子科技有限公司)、培養瓶(表面積25cm2, Costar)、培養皿(直徑35mm, Costar)
B).試劑組成胎牛血清(賽默飛世爾生物化學制品有限公司)、DMEM高糖培養基(杭州吉諾生物醫藥技術有限公司)、青鏈霉素(杭州吉諾生物醫藥技術有限公司)、凋亡檢測試劑盒(聯科生物)、Hoechst 33258 (碧云天)、Caspase-3 抗體(Cell Signaling Technology)、Caspase-8 Jfl {φ (Ce 11 Signaling Technology)、Cleaved-Caspase_3 抗體(Cell SignalingTechnology)、BAX 抗體(Cell Signaling Technology)、BCL -2 抗體(Cell SignalingTechnology)；
C).實驗細胞大鼠腎小管上皮細胞株(NRK-52E)來自于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。D).對照緩沖液bicarbonate — HEPES緩沖的林格氏液，每IL中含有NaHCO3
2.016g, Na2HPO4 0. 114g, NaH2PO4 0. 024g, NaCl 5. 06g, KCl 0. 402g, CaCl2 0. 133g, MgCl2O.076g, HEPES 4. 76g，GlucoseO. 9g，用 I mmol/L 的 NaOH 調整 pH 至 7· 4，在 37°C、正常氧分壓下保存。E).缺血緩沖液bicarbonate—MES緩沖的林格氏液，每IL中含有NaHCO3O. 378g, Na2HPO4 O. 114g, NaH2PO4 O. 024g, NaCl 6. 201g, KCl 0. 402g, CaCl2 0. 133g, MgCl20. 076g，MES3. 9g，用I mmol/L的NaOH調整pH至6· 6，在37°C、低于1%02的條件下保存。F).自備試劑及氣體PBS、氮氣、二氧化碳。G).實驗分組正常組，缺血再灌注組，后處理組1，后處理組2，后處理組3。實施例2用大鼠腎小管上皮細胞缺血后處理細胞模型觀察后處理對再灌注損傷的保護效果。A). NRK-52E培養于培養瓶中，待細胞長到一定數量后平均接種于培養皿，實驗前 用無血清培養液培養24h，使細胞同步化，然后將細胞培養皿隨機分為5組正常組，缺血再灌注組，后處理組I (HP1)，后處理組2 (HP2)，后處理組3 (HP3)。B).正常組同步化24h后換對照緩沖液lmL，3h后再次更換完全培養液lmL，后常規培養24h。C).缺血再灌注組同步化24h后，用pH 7. 4的無血清DMEM培養液ImL沖洗已匯合成片的大鼠腎小管上皮細胞，接著用PH 7. 4的無糖DMEM培養液ImL沖洗細胞，再用無血清、無糖的缺血培養液ImL在缺氧條件下(O. 5%02+5% C02+94. 5% N2、37°C)培養3h，再灌注時換用完全培養液lmL，在正常條件下(5% C02+95%空氣、37°C)培養至指定的時間點。D).缺血后處理組同步化24h后，更換缺血緩沖液lmL，并在缺氧條件下(O. 5%的02、5%的CO2、飽和濕度)條件下培養3h。然后添加O. 5ml新鮮的完全培養液，在正常條件下(空氣氧濃度、5%C02、飽和濕度、37°C )培養lOmin，模擬再灌注環境，再在缺血條件下(0. 5%的02、5%的CO2、飽和濕度)培養lOmin，模擬缺氧環境，此20min為一個循環，記為HPl組，若完成兩個循環記為HP2組，三個循環記為HP3組。最后添加完全培養液2mL在正常條件下(空氣氧濃度、5%C02、飽和濕度、37 °C )培養至指定的時間點。E).培養結束后,用流式細胞儀、hoechst檢測細胞凋亡，Western Blot檢測凋亡相關基因 BCL-2、BAX、Cleaved-Caspase 3、Caspase 3、Caspase 8。流式細胞儀檢測4次，檢測結果見表I。SPSS17. O統計分析顯示，正常組與缺血再灌注組、HPl組相比，差異有統計學意義，P <Q. 05。缺血再灌注組與HPl組、HP2組、HP3組相比，差異有統計學意義，/7 <0.05。即1、即2、即3三組相比，即3凋亡率顯著低于即1，P >0.05。說明三個循環的后處理對于缺血再灌注損傷的保護效果較好。
表I流式細胞儀檢測凋亡結果
權利要求
1.一種大鼠腎小管上皮細胞缺血后處理的細胞模型的建立方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)接種于35mm規格的培養皿的NRK-52E細胞同步化24h后，將培養皿中的液體更換為缺血緩沖液并置于含O. 5% O2和5% CO2的三氣培養箱中，于飽和濕度、37°C培養3小時，模擬缺血過程； (2)向培養皿中添加O.5ml新鮮的完全培養液，置于含空氣氧濃度、5% CO2 二氧化碳培養箱中，于飽和濕度、37°C培養lOmin，模擬再灌注過程；再將培養皿置于前述的三氣培養箱中培養IOmin,模擬缺氧過程； 此20min為一個循環,記為HPl組,完成兩個循環記為HP2組,完成三個循環記為HP3組； (3)最后培養皿中的液體更換為完全培養液2mL在前述的二氧化碳培養箱中培養至指定的時間點，以完成整個缺血后處理的細胞模型。
2.根據權利要求I所述的細胞模型的建立方法，其特征是，在每個再灌注開始之前，保留原有的缺血緩沖液，在此基礎上加入O. 5mL新鮮完全培養液。
3.根據權利要求I所述的細胞模型的建立方法，其特征是，缺血緩沖液應用bicarbonate—MES 緩沖的林格氏液，每 IL 中含有 NaHCO3 O. 378g, Na2HPO4 O. 114g, NaH2PO4O. 024g, NaCl 6. 201g, KCl 0. 402g, CaCl2 0. 133g, MgCl2 0. 076g, MES3. 9g，用 I mmol/L 的NaOH 調整 PH 至 6· 6。
全文摘要
本發明公開了一種對大鼠腎小管上皮細胞缺血再灌注損傷有保護作用的缺血后處理細胞模型，能最大限度的模擬動物體內缺血后處理。利用該缺血后處理細胞模型減輕大鼠腎小管上皮細胞缺血再灌注損傷的方法，以及經該缺血后處理細胞模型在大鼠腎小管上皮細胞缺血再灌注損傷保護中的應用均為世界首創。該模型可有效方便地對大鼠腎小管上皮細胞缺血再灌注損傷進行保護以及對細胞水平的缺血后處理保護機制進行探討研究。
文檔編號C12N5/071GK102943062SQ20121047450
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月21日 優先權日2012年11月21日
發明者翁小東, 王磊, 陳暉 , 劉修恒, 陳志遠, 汪志順, 刑變枝 申請人:武漢大學