專利名稱：一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物酶，尤其是涉及一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法。
背景技術：
在眾多的再生性能源中，應用微生物進行有機廢棄物生產再生電力稱為“微生物燃料電池(MFC)”。微生物燃料電池在環境保護、生態平衡及能源危機都有正向幫助， 利用微生物處理污水并同時產電，掀起了環境及能源領域的研究熱潮(BruceE. Logan. Simultaneouswastewater treatment and biological electricity generation[J]. Water Science&Technology, 2005, 52:31-37)。但目前微生物燃料電池仍未能商業化,主要的因素是微生物本身的性能、受分解的有機廢棄物的種類、燃料電池的壽命及功率、操作方式等。過去大部分的MFC均采用混菌培養，但卻面臨混菌之間的競爭生長，在相互爭奪營養物質或代謝產物易產生對抗作用；而且混菌中的厭氧微生物群在受到氧化還原產生的氧氣影響，對其生長較不利。單一純菌的微生物燃料電池是近年研究的熱點。特別是染整業中常用的偶氮染料作為MFC的產電燃料，其性能及去色效果明顯，不僅為有毒有害的偶氮有機物的處理提供了新思路，而且可以回收能量，實現高效低耗的運行。這對于資源和能源都較為短缺的我國具有重要的現實意義。
對于細菌進行偶氮染料的降解還沒有確切的反應機制，但是對于兼性厭氧細菌來說，目前存在兩種模型解釋偶氮脫色過程。其一，是基于純種菌株一鞘氨醇單胞菌的脫色機制在這個模型中，中介物或是特定偶氮染料的代謝物或是磺化的蔥醒類物質、活性炭、 腐殖質等可促進的還原反應速率，這些還原當量通過中介物從細胞膜轉移到電子供體，從而達至丨J偶氮鍵的斷裂(Kudlieh, et al. Localization of the enzyme system involved in anaerobic reduction ofazo dyes by Sphingomonas sp.Strain BN6and effect of artificial redox mediators on the rate ofazo dye reduction. Appl Environ Microbiol 1997，63:3691-3694)，細胞膜在電子轉移中起著重要的橋梁作用。同樣地，對于微生物燃料電池微生物可以依靠其膜上的脫氫酶直接氧化小分子的有機酸，例如甲酸鹽、 乙酸鹽、乳酸鹽等，從有機物中釋放的電子傳遞給膜上的電子載體。另外產電微生物還可以氧化糖類等有機物生成還原力(NADH，FADH2),這些還原力與細胞膜上脫氫酶作用釋放電子到電子傳遞鏈(洪義國，郭俊，孫國萍.產電微生物及微生物燃料電池最新研究進展[J]. 微生物學報，2007，47 (I) :173-177)。微生物細胞膜上蛋白質和酶擔任著電子傳遞鏈的重要角色。
漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，它能利用分子氧作為電子受體氧化多種類型的酚類化合物及非酚類的化合物，將分子氧還原為水。漆酶的底物范圍很寬，被廣泛應用于工業和生物技術方面，如去除含酚的污染物、染料脫色、有機物合成和廢水脫色等，是一種新興的生物修復劑。產漆酶的菌株通常篩選自林區土壤、污水處理廠的活性污泥、河流污水、含有機垃圾的表層土壤、油田的土壤、海水、水稻的根部、染料污染的土壤、紡織工業廢水和木質纖維廢水等(汪春蕾等.產漆酶細菌研究方法進展[J].生物技術，2010，20[4]:92、6)。利用細菌漆酶對染料的脫色研究早已報導HeldC等芽孢漆酶和固定化漆酶對常用的3種紡織染料DBPV200、DFB和靛紅(終濃度均為50mg/L)進行脫色，兩種芽孢均能非常有效地在90min內對染料進行脫色，并且發現用Cl反應橙70或Cl反應藍對漂白的棉花纖維進行染色，漆酶能明顯地干擾染色反應，染色效果不好。(Held C, et al.Biotransformation of phenolics withlaccase containing bacterial spores[J]. Environ Chem Lett, 2005, 3:74-77.)
研究產電微生物在產電的同時降解偶氮染料過程中蛋白質的產生和變化有助于理清微生物產電和降解染料的機理，同時也能弄清產電和偶氮染料降解二者之間的關系， 促進微生物燃料電池的應用。
奇異變形桿菌(Proteus hauseri, CGMCC No. 6746)是一株從臺灣省宜蘭縣礁溪溫泉篩選出來的全新菌株，具有很高的偶氮染料褪色能力，而且能應用在微生物燃料電池中(Bor-Yann Chen, Meng-Meng Zhang, et al. Assessment upon azo dye decolorization andbioelectricity generation by Proteus hauseri[J]. Bioresource Technology, 2010, 101:4737-4741.)。目前，在自然條件中分離的產電微生物主要是變形菌門和厚壁菌門的細菌，變形菌門的很多菌(如希瓦氏菌、鐵還原紅育菌、硫還原桿菌)都能用于直接微生物燃料電池(李穎等.微生物燃料電池中產電微生物的研究進展[J].微生物學通報，2009, 36(9) : 1404-1409)。奇異變形桿菌屬于變形菌門的兼性厭氧細菌，是產電和厭氧褪色優勢菌種。挖掘此株菌與產電和褪色相關蛋白、酶及探究其作用，對產電和降解偶氮染料機理研究有一定促進作用。發明內容
本發明的目的是提供一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法。
本發明包括以下步驟
I)將奇異變形桿菌(Proteus hauseri)培養后,第I次離心,吸取部分上清得胞外蛋白，沉淀的菌體去離子水重新懸浮菌體后第2次離心，再懸浮，如此反復3次洗滌的菌體， 即得全細胞，取洗滌后的部分菌體經超聲破碎后第3次離心，收集上清可得到胞內蛋白；
2)十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離胞外蛋白和全細胞蛋白將 30 μ L樣品與10 μ L四倍蛋白上樣緩沖液，混合均勻后，于100°C加熱5min，點樣后進行電泳分析，以0. 025%考馬斯亮藍溶液染色lh，使用7%醋酸與40%甲醇溶液脫色洗滌二次，每次半小時，最后拍照記錄實驗數據；
3)切割蛋白電泳膠片上蛋白分子量介于3(T65kDa，胞外蛋白目的條帶需肉眼能夠清晰看到的膠條，胞內蛋白目的條帶取顏色最深的膠條，置于干凈的離心管中，加去離子水浸泡備用；
4)用胰酶酶解法處理目的膠條后，樣品經基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜 (MALTI-T0F-MS/MS)分析得到相應的肽質指紋圖譜，然后搜索Mascot數據庫鑒定蛋白質身份，將數據與美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫進行對比后確定蛋白身份；
5)將所得蛋白質信息及NCBI數據庫設計漆酶和孔蛋白基因的引物
(I) 5，ATGCCGCTGTGGCTGGA ；
(2)5’ TTTAATCCAGATCAGGGTTGCC ；
(3) 5’ ATGATGAAACGCAATCTG ；
(4) 5’ TAATTGATAAGTCAGACCC ；
利用菌落PCR技術分別對兩功能性基因進行擴增；
6)將所擴增的基因片段連接于PMD-19T載體，進行基因測序；
7)所得核酸序列利用VectorNTI 10. O軟件翻譯成氨基酸序列，與相近物種彭氏變形桿菌漆酶和孔蛋白氨基酸序列進行對比；
8)將經前培養的奇異變形桿菌接種于LB液體培養基培養，分別添加不同濃度的硫酸銅溶液進行誘導培養，培養至24h收獲菌體，將菌體洗滌兩次后，在pH 3. O以2mmol/ LABTS為底物，測全細胞及胞內漆酶酶活；
9)利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析添加硫酸銅誘導和未誘導奇異變形桿菌全細胞，經考馬斯亮藍溶液染色后，比較差異蛋白；
10)利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析比較添加硫酸銅誘導和未誘導奇異變形桿菌胞內蛋白條帶，將30 μ L樣品與10 μ L非變性蛋白上樣緩沖液，混合均勻后，于冰上冰浴5min，點樣后進行電泳分析，整個過程電泳槽置于冰水混合物中，將電泳完成后的凝膠取出，以2mmol/L，pH 3. O的ABTS溶液浸泡凝膠，放入37°C的反應槽中搖動IOmin取出，即可以見到有深綠色的條紋為漆酶酶活所在處，進行第I次拍照記錄實驗數據；再將膠片重新以O. 025%考馬斯亮藍溶液染色lh，使用7%醋酸與40%甲醇溶液脫色洗滌二次，每次半小時，進行第2次拍照記錄實驗數據。
在步驟I)中，所述奇異變形桿菌(Proteus hauseri)已于2012年10月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No. 6746，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所；所述奇異變形桿菌 (Proteus hauseri)篩選自臺灣省宜蘭縣礁溪溫泉；所述培養的時間可為16h,所述第I次離心的條件可為8000rpm離心IOmin ;所述第3次離心的條件可為14000rpm離心5min。
在步驟2)中，所述四倍蛋白上樣緩沖液的配方可為(O. 8 l)g十二烷基磺酸鈉， (2.5 2.6)mL β -巰基乙醇，(2 2. 2)mL Tris-HCl 緩沖液(pH 6. 8)，5mL 甘油，5mg 溴酚藍。
在步驟8)中，所述前培養的時間可為12h，所述接種的條件可為按1%接種量接種， 150rpm，30°C培養2h ;所述不同濃度的硫酸銅溶液的濃度分別為O、I、I. 5、2、2. 5、3mmol/L。
在步驟10)中，所述非變性蛋白上樣緩沖液的配方可為(2.5 2. 6)mL β-巰基乙醇，(2. 0 2· 2) mLTris-HCl 緩沖液(pH 6. 8)，5mL 甘油，5mg 溴酚藍。
本發明從自然環境中篩選出一株高效降解偶氮染料的奇異變形桿菌(Proteus hauseri)(篩選自臺灣省宜蘭縣礁溪溫泉),并且從中發現二個全新的蛋白質對應最高相似度的蛋白身份為彭氏變形桿菌ATCC 35198的漆酶(氨基酸相似度87. 8%)及彭氏變形桿菌 ATCC35198的孔蛋白F(氨基酸相似度84. 4%)。在加入2. 5mmol/L硫酸銅誘導后生產出的漆酶具有最高活性為269. 2U/g-DCff,比較添加和未加硫酸銅誘導的奇異變形桿菌胞內蛋白電泳圖譜，發現在120kDa位置多出一條條帶，經質譜鑒定此蛋白質為銅誘導型的運輸ATP酶， 在非變性蛋白電泳圖上硫酸銅誘導的奇異變形桿菌胞內蛋白的泳道出現綠色活性條帶，而未經誘導的樣品在其泳道沒有顯示活性條帶。


圖I為實施例2中對奇異變形桿菌胞外及全細胞的蛋白質電泳分析。在圖I中，泳道I為胞外蛋白，泳道M為標記蛋白質(分子量分別為170、130、100、70、55、40及35kDa)， 泳道2為全細胞蛋白。
圖2為實施例9及實施例10中在銅離子誘導下奇異變形桿菌全細胞或胞內蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
圖3為實施例9及實施例10中在銅離子誘導下奇異變形桿菌全細胞或胞內蛋白的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。
圖4為實施例9及實施例10中在銅離子誘導下奇異變形桿菌全細胞或胞內蛋白的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳酶譜分析，紅色箭頭是銅誘導型的運輸ATP酶與漆酶的位置。
在圖2 4中，泳道1，7，10為未添加銅離子誘導的胞內蛋白分析；泳道2，3，6，9為添加2. 5mmol/L銅離子誘導的胞內蛋白分析,泳道4，5，8為蛋白質分子量標準品。
具體實施方式
為了易于進一步理解本發明，下列實施例將對本發明作進一步的闡述。
實施例I :奇異變形桿菌(Proteus hauseri)培養
I)固體培養
LB培養基組成胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L及瓊脂15g/L， PH7. 0，將分離及篩選所得的奇異變形桿菌劃線接種于固體培養基以30°C培養16h。
2)液體培養
首先以接種環自LB瓊脂平板中勾取單一菌落接種于含50mL，LB培養液的250mL 錐形瓶中以30°C，150rpm下進行培養12h。
3)干重分析
將培養12h的菌體懸浮液傾入裝有O. 22 μ m濾膜的玻璃過濾組，安裝前對50°C干燥濾膜秤重，將抽氣管連接抽氣過濾機，過濾組蓋上培養皿蓋防灰塵入侵，連續抽氣直到菌液部份脫水，再加入去離子水至菌液中以溶去非生物質，而后刮取濾膜上的菌體至玻璃培養皿并置入110±5°C烘箱中干燥。干燥過程中每24h樣品秤重一次，直到重量不再變化為止。奇異變形桿菌的干菌重為O. 973±0. 035g-DCW/L。
實施例2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析
于小燒杯中配制10%分離膠，小心將凝膠溶液加入模具內，避免氣泡產生，在室溫聚合30min。再配制5%積層膠溶液，混合均勻后加入已配制好的分離膠上方，馬上插入梳子于積層凝膠內，在室溫放置Ih聚合，拔出梳子形成樣品孔。將整組膠體放入電泳槽內，加入電泳緩沖液(O. 025mol/L三羥甲基氨基甲烷、O. 192mol/L甘氨酸、O. 1%十二烷基磺酸鈉， pH 8. 3)，將30 μ L樣品與10 μ L四倍蛋白上樣緩沖液混合均勻后，于100°C加熱5min，小心加入到樣品孔中進行電泳分析。調電壓至120V，進行電泳分離約1.5h，取出膠片以O. 025% 考馬斯藍染色lh，再用7%醋酸與40%甲醇溶液脫色脫色液洗滌二次，每次半小時。結果如附圖1，其中選定蛋白A、B、C、D，切割膠條放入I. 5mL離心管中進行下一步實驗。
實施例3 :串聯式質譜鑒定蛋白質身份
I)胰酶酶解
脫色向離心管中加100 μ L50mmol/L NH4HCO3/乙睛(I I)考染膠脫色液，37°C 保溫20min，再移去其中的溶液，重復洗滌直至膠條變為無色透明狀。
干膠用移液器將離心管中的NH4HCO3和乙睛吸盡后，再加入100 μ L 100%乙腈， IOmin后移去乙腈，然后放入37°C烘箱中5 10min確保完全干膠。
酶解加入5 10 μ L濃度為12. 5mg/L的胰酶溶液，4°C冰箱中約30min，以確保膠粒能很好地吸收酶液，取出后在37°C烘箱中酶解過夜。
肽段提取加入60 μ L 50%乙腈和O. 1%三氟乙酸混合液，3(T40min后，將溶液轉移到新的96孔板內，重復加樣2 3次，最后將肽段溶液在N2流下吹干濃縮，以備用于質譜鑒定。
2)串聯式質譜分析
以質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(MALDI-T0F-T0F)分析得各小片段之分子量及氨基酸進行由N端至C端之定序，最后將所有小片段的數據，包括分子量及序列，與現有蛋白質數據庫進行比對，獲得目的蛋白質的鑒定結果(見表I)。
表IMascot蛋白質身份鑒定與性質分析
權利要求
1.一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于包括以下步驟 1)將奇異變形桿菌(Proteushauseri)培養后,第I次離心,吸取部分上清得胞外蛋白，沉淀的菌體去離子水重新懸浮菌體后第2次離心，再懸浮，如此反復3次洗滌的菌體，即得全細胞，取洗滌后的部分菌體經超聲破碎后第3次離心，收集上清可得到胞內蛋白； 2)十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離胞外蛋白和全細胞蛋白將30μ L樣品與10 μ L四倍蛋白上樣緩沖液，混合均勻后，于100°C加熱5min，點樣后進行電泳分析，以O. 025%考馬斯亮藍溶液染色lh，使用7%醋酸與40%甲醇溶液脫色洗滌二次，每次半小時，最后拍照記錄實驗數據； 3)切割蛋白電泳膠片上蛋白分子量介于3(T65kDa，胞外蛋白目的條帶需肉眼能夠清晰看到的膠條，胞內蛋白目的條帶取顏色最深的膠條，置于干凈的離心管中，加去離子水浸泡備用; 4)用胰酶酶解法處理目的膠條后，樣品經基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALTI-TOF-MS/MS)分析得到相應的肽質指紋圖譜，然后搜索Mascot數據庫鑒定蛋白質身份，將數據與美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫進行對比后確定蛋白身份； 5)將所得蛋白質信息及NCBI數據庫設計漆酶和孔蛋白基因的引物(1)5，ATGCCGCTGTGGCTGGA ；(2)5’TTTAATCCAGATCAGGGTTGCC ；(3)5’ATGATGAAACGCAATCTG ；(4)5’TAATTGATAAGTCAGACCC ； 利用菌落PCR技術分別對兩功能性基因進行擴增； 6)將所擴增的基因片段連接于PMD-19T載體，進行基因測序； 7)所得核酸序列利用VectorNTI10. O軟件翻譯成氨基酸序列，與相近物種彭氏變形桿菌漆酶和孔蛋白氨基酸序列進行對比； 8)將經前培養的奇異變形桿菌接種于LB液體培養基培養，分別添加不同濃度的硫酸銅溶液進行誘導培養，培養至24h收獲菌體，將菌體洗滌兩次后，在pH 3. O以2mmol/LABTS為底物，測全細胞及胞內漆酶酶活； 9)利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析添加硫酸銅誘導和未誘導奇異變形桿菌全細胞，經考馬斯亮藍溶液染色后，比較差異蛋白； 10)利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析比較添加硫酸銅誘導和未誘導奇異變形桿菌胞內蛋白條帶，將30 μ L樣品與10 μ L非變性蛋白上樣緩沖液，混合均勻后，于冰上冰浴5min，點樣后進行電泳分析，整個過程電泳槽置于冰水混合物中，將電泳完成后的凝膠取出，以2mmol/L，pH 3. O的ABTS溶液浸泡凝膠，放入37°C的反應槽中搖動IOmin取出，即可以見到有深綠色的條紋為漆酶酶活所在處，進行第I次拍照記錄實驗數據；再將膠片重新以O. 025%考馬斯亮藍溶液染色lh，使用7%醋酸與40%甲醇溶液脫色洗滌二次，每次半小時，進行第2次拍照記錄實驗數據。
2.如權利要求I所述的一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于在步驟I)中，所述奇異變形桿菌(Proteus hauseri)已于2012年10月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCCNo. 6746。
3.如權利要求I所述的一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于在步驟I)中，所述培養的時間為16h。
4.如權利要求I所述的一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于在步驟I)中，所述第I次離心的條件為8000rpm離心lOmin。
5.如權利要求I所述的一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于在步驟I)中，所述第3次離心的條件為14000rpm離心5min。
6.如權利要求I所述的一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于在步驟2)中，所述四倍蛋白上樣緩沖液的配方為(0. 8 l)g十二烷基磺酸鈉，(2. 5 2. 6) mL β-巰基乙醇，(2 2. 2) mL Tris-HCl緩沖液，Tris-HCl緩沖液的pH 6. 8，5mL甘油，5mg溴酚藍。
7.如權利要求I所述的一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于在步驟8)中，所述前培養的時間為12h。
8.如權利要求I所述的一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于在步驟8)中，所述接種的條件為按1%接種量接種，150rpm，30°C培養2h。
9.如權利要求I所述的一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于在步驟8)中，所述不同濃度的硫酸銅溶液的濃度分別為0、1、1. 5、2、2. 5、3mmol/L。
10.如權利要求I所述的一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，其特征在于在步驟10)中，所述非變性蛋白上樣緩沖液的配方為(2. 5 2. 6) mL β-巰基乙醇，(2. (Γ2. 2)mLTris-HCl緩沖液，Tris-HCl緩沖液的pH 6. 8，5mL甘油，5mg溴酚藍。
全文摘要
一種產電微生物酶的篩選及鑒定方法，涉及一種微生物酶。由蛋白質組學分析獲得基因組訊息，并設計隨機引物進行基因克隆，從而獲得兩個全新的蛋白質，經比對為彭氏變形桿菌ATCC 35198的漆酶與孔蛋白F，其氨基酸相似度分別為87.8%與84.4%。報道了產電變形桿菌的漆酶及其酶活特征，以及漆酶與孔蛋白基因；并發現以2.5mmol/L的硫酸銅對漆酶的誘導生產可得269.2U/g-DCW的酶活，是未誘導的30.6倍。該發明提供產電微生物的新穎酶的篩選及蛋白質鑒定方法，有望應用于緩解石化燃料日漸短缺的危機及減少二氧化碳排放。
文檔編號C12Q1/34GK102925535SQ20121048890
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月26日 優先權日2012年11月26日
發明者吳意珣, 陳博彥, 盧英華, 鄭雪松, 池小琴 申請人:廈門大學