專利名稱：一種兔出血癥病毒“自殺性”dna疫苗及其構建方法
技術領域：
本發明涉及動物病毒學與動物傳染病學技術領域，特別涉及一種兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗及其構建方法。
背景技術：
兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)俗稱“兔痕”,是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種急性高致死性兔傳染病。本病具有病死率高、死亡快，而且傳播迅速等特點，對養兔業的健康發展造成了嚴重威脅，因而被國際獸疫局正式列為“國際動物保健編目” B類傳染病，我國農業部也將之列為二類動物疫病。1984年初，劉勝江等在我國江蘇無錫首次發現兔瘟以后，本病迅即蔓延到我國25省市、自治區，其后，世界各地如墨西哥及
歐洲的許多國家也有類似兔瘟流行，給養兔業造成了巨大經濟損失。RHDV的衣殼蛋白為病毒的主要結構蛋白，稱VP60。該蛋白是RHDV的主要結構蛋白，VP60構成的立體結構衣殼由180個完全相同的亞基組成，亞基之間相互作用然后形成具有三維構象的衣殼。該組裝過程與各個亞基的N端序列有關，因為將該區段缺失后，VP60就再不能裝配成空衣殼。RHDV在宿主細胞中完成一個復制周期后，由VP60組裝的空衣殼將子代RNA包裹形成成熟的病毒粒，然后隨著細胞的裂解釋放出來，侵染其它的敏感細胞。大量研究結果證明RHDV的衣殼蛋白與病毒的致病性和免疫原性密切相關。國內外的學者使用不同的表達系統成功表達了 VP60，用表達產物接種兔子可以誘導產生較強的免疫應答，并能對抗RHDV的攻擊。兔出血癥病毒尚未建立體外組織細胞的培養方法，目前使用的疫苗主要為組織滅活苗。但隨著家兔飼養成本的提高以及非免疫兔的減少，可用于制苗的肝組織日趨減少，使組織滅活苗的成本偏高，加之組織滅活苗可能導致散毒的缺點，近年來人們著眼于兔瘟新型疫苗的研究。Berglund 等(Berglund P, Smerdou C, Fleeton MN, et al. Enhancing immuneresponses usingsuicidal DNAvaccines. Nat Biotech, 1998 ;16 :562-565)于 1998 年率先提出了以甲病毒復制子為基礎的“自殺性”DNA疫苗(suicidal DNAvaccine)的設想，即利用“自殺性’T)NA疫苗的甲病毒進入細胞后能表達出甲病毒的非結構蛋白(nSPs)，在nSPs的作用下甲病毒基因組RNA進行高效復制，在此過程中產生大量的雙鏈RNA(dsRNA)中間體，最終可使轉染的細胞凋亡，基于甲病毒復制子的DNA疫苗可引起轉染的細胞凋亡，也稱“自殺性"DNA疫苗，它比傳統DNA疫苗更安全，無整合到宿主染色體的潛在危險性。自殺性DNA疫苗可引起高水平的體液免疫和細胞免疫，且可打破免疫耐受。在甲病毒基因組高效復制同時，目的抗原在亞基因組啟動子的調控下獲得高效表達，從而可以較低的免疫劑量引起較強的免疫反應。自殺性DNA疫苗的載體是以甲病毒復制子為基礎的復制型DNA載體。病毒復制時結構基因拷貝數高達IO5之多，因此可以利用亞基因組的啟動子使外源基因獲得高效表達。自殺性DNA疫苗由于其具有RNA復制子，大量復制可導致感染細胞的凋亡。該凋亡可能是復制型載體在表達外源基因的過程中產生雙鏈RNA (dsRNA)復制中間體介入的結果。dsRNA能在細胞和體液免疫中起強大的輔助作用。后來，研究者將RNA復制子載體系統改造成以DNA為基礎的、RNA聚合酶依賴的系統。這種載體攜帶了甲病毒復制酶基因和外源基因的重組質粒DNA，缺失了病毒結構蛋白基因。它通過將人巨細胞病毒(CMV)早期增強子/啟動子序列插入到SP6啟動子的上游或替換SP6啟動子啟動轉錄。同時,在多克隆位點下游插入強轉錄終止信號SV40晚期聚A信號序列，正常終止轉錄。該質粒DNA轉染宿主細胞后，利用宿主RNA聚合酶η在細胞核內轉錄，合成甲病毒復制酶，再合成亞基因組RNA及大量外源蛋白，從而大大提高表達效率。因此，從自殺性DNA疫苗的構建上我們可以看出其具有RNA疫苗和DNA疫苗的優點，能自主復制、大量表達。

發明內容
本發明的第一目的在于提供一種兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗，以解決現有技術中現有的RHDV疫苗一般為弱毒苗或滅活苗，弱毒苗存在毒力返強的危險，而滅活苗往往需要多次免疫接種，而且效果不穩定，還經常導致免疫失敗的技術問題。本發明的第二目的在于提供一種兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗的構建方法。本發明的技術方案如下一種兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗，該疫苗由RHDV-VP60基因和甲病毒復制子載體pSCA組成，其中，所述RHDV-VP60基因去掉了氨基端的31個氨基酸，其序列如SEQIDNO 1 所示。一種兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗的構建方法，包括如下步驟I)以發病兔內臟組織為原料進行RHDV病毒總RNA的提取；同時設計如下兩個特異性引物PSCA-VP60F :5，ATTGGATCCfe^ dGCCACCATGGGCGTGGTGGCCGC-3，，PSCA-VP60R :5，AGACCCGGGmTCAGACATAAGAAAAGCC-3，；2)以病毒總RNA為模板，使用反轉錄方法，以PSCA-VP60R為反轉錄引物合成PSCA-VP60的cDNA第一鏈，用特異性引物PSCA-VP60F和PSCA-VP60R進行PCR擴增，得到缺失氨基端31個氨基酸的VP60基因，并用試劑盒純化回收；3)將擴增的RHDV-VP60基因片段重組到甲病毒復制子載體pSCA真核表達質粒中，即得到兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗。優選地，所述步驟I)中，RHDV病毒總RNA的提取方法為將RHDV病毒肌肉注射兩月齡的新西蘭大白兔，待新西蘭大白兔死亡后，取其肝臟制備研磨液，按常規方法提取RHDV病毒總RNA。優選地，所述的反轉錄方法為用反轉錄試劑盒進行轉錄,反轉錄體系為=IOXBuffer 2 μ L、RNA/引物變性溶液
6μ L>2. 5mM dNTP Mixture 2 μ L、RNase Inhibitor 0. 25 μ L> RTaseM-MLV 0·5μ ,加滅菌蒸餾水9. 25 μ L，使反轉錄體系體積為20 μ L，其中所述的RNA/引物變性溶液制備方法為RNA模版5 μ L和特異性引物PSCA-VP60R I μ L在70°C水浴lOmin，冰上冷卻2min ;反轉錄過程為將提取的RHDV-VP6042°C溫浴Ih后，70°C水浴15min，最后置冰上2min，得到的樣品_20°C保存備用；
PCR擴增方法為反應體系為2XPfuPCR MasterMix 12. 5 μ L、特異性引物 PSCA-VP60F O. 5 μ L、特異性引物PSCA-VP60R O. 5 μ L、模版cDNA 2 μ L，加滅菌蒸餾水9. 5 μ L，使反應體系體積為25 μ L ;將上述反轉錄方法得到的樣品瞬間離心混合，采用熱蓋進行PCR擴增反應，過程為94°C預變性3min，然后94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min,30個循環，72°C延伸IOmin后，10°C終止反應，并用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VP60cDNA片段。優選地，PCR擴增后獲得的RHDV-VP60基因片段大小為1647bp。優選地，所述的步驟3)中，將擴增VP60cDNA片段重組到甲病毒復制子載體pSCA真核表達質粒中的過程具體如下A、將擴增RHDV-VP60基因片段和pSCA空載體用BamHI和SmaI進行雙酶切，并用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒純化回收； B、將純化回收的RHDV-VP60和pSCA空載體片段用T4DNA Ligase進行連接，連接體系為10 XBuffer I μ L、T4DNALigase I μ L、RHDV-VP606 μ L、pSCA I μ L，加滅菌蒸餾水I μ L，使連接體系總體積為10 μ L，16°C水浴連接4h，之后將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，混勻，冰浴放置30min，42°C水浴中熱激90S后迅速置冰上2min，然后涂布于氨芐抗性平板中，12h后挑取菌落并搖菌；C、將得到的菌液利用AxyPrep DNA質粒抽提試劑盒抽提質粒,經酶切鑒定和經Invitrogen公司測序顯示，結果完全正確，從而成功構建成兔出血癥“自殺性” DNA疫苗。一種兔出血癥病毒“自殺性’DNA疫苗用于制備預防兔病毒性出血癥的藥物中的用途。與現有技術相比，本發明的有益效果如下I、提純質粒DNA的工藝簡便，因而生產成本較低，且適于大批量生產；2、DNA分子很穩定，可制成DNA疫苗凍干苗，使用時在鹽溶液中可恢復原有活性，因而便于運輸和保存；3、雖然DNA疫苗具有與弱毒疫苗相當的免疫原性，能激活細胞毒性T淋巴細胞而誘導細胞免疫，但由于DNA序列編碼的僅是單一的一段病毒基因，基本沒有毒性逆轉的可能，因此不存在減毒疫苗毒力回升的危險，而且由于機體免疫系統中DNA疫苗的抗原相關表位比較穩定，因此DNA疫苗也不象弱毒疫苗或亞單位疫苗那樣，會出現表位丟失，因此，本發明的“自殺性” DNA疫苗比傳統疫苗更加安全、高效；4、本發明的“自殺性”DNA疫苗在動物體內一過性表達外源基因后，隨細胞凋亡而被機體清除，從而可避免DNA質粒可能整合到宿主細胞染色體或可能造成免疫耐受等隱
串
■/Qi、O當然，實施本發明的任一產品并不一定需要同時達到以上所述的所有優點。


圖I為本發明實施例用RT-PCR方法擴增VP60基因的電泳檢測圖；圖2為本發明實施例pSCA-VP60重組質粒酶切鑒定的電泳檢測圖；圖3為本發明實施例VP60基因在細胞中表達RT-PCR的電泳檢測圖；圖4為本發明實施例VP60基因在細胞中表達Westernblot圖5為本發明實施例VP60基因在細胞中表達后在熒光顯微鏡下的結構圖，其中，a為重組質粒pSCA-VP60轉染400 X ；b為陰性對照；圖6為構建本發明的“自殺性” DNA疫苗PSCA/VP60的策略示意圖；圖7為本發明實施例的兔出血癥病毒“自殺性"DNA疫苗刺激兔子產生特異性抗體后，實驗組與對照組于λ 450nm處測定每孔的OD值的對比圖；圖8為本發明實施例的兔出血癥病毒“自殺性"DNA疫苗刺激白兔T淋巴細胞增殖后，實驗組與對照組于λ 570ηπι處測定OD值的對比圖；圖9為本發明實施例的兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗刺激兔子IFN- Y，實驗組與對照組于λ 450ηπι處測定每孔的OD值的對比圖；圖10為本發明實施例的兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗刺激兔子IL_4，實驗組 與對照組于λ 450nm處測定每孔的OD值的對比圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。本發明提供一種兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗，該疫苗由RHDV-VP60基因和甲病毒復制子載體PSCA組成，如圖6，其中，所述RHDV-VP60基因是RHDV病毒的主要衣殼蛋白，并且去掉了氨基端的31個氨基酸，其序列如SEQ ID NO :I所示。實施例本實施例的兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗的構建方法，參見圖6，具體包括如下步驟I)設計特異性引物和RHDV病毒總RNA的提取及純化設計特異性引物根據NCBI核酸數據庫中的RHDV JX97株(序列登錄號為DQ205345)病毒VP60基因序列，利用Primer5. O軟件自行設計，由上海杰李生物技術有限公司合成以下引物PSCA-VP60F 5，ATTGGATCCfe^ I}GCCACCATGGGCGTGGTGGCCGC-3，， PSCA-VP60R 5，AGACCCGGGm TCAGACATAAGAAAAGCC-3，。RHDV病毒總RNA的提取及純化將RHDV病毒(國家獸醫微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號CVCCAV272)肌肉注射兩月齡的新西蘭大白兔，待新西蘭大白兔死亡后，取其肝臟制備研磨液，按常規方法提取RHDV病毒總RNA，具體為，將死亡后白兔解剖取其肝臟，用剪刀將肝臟剪碎研磨，并加入I %的雙抗，將研磨液反復凍融3次后，用Trizol法提取RNA。2)擴增RHDV-VP60基因，去掉RHDV-VP60氨基端31個氨基酸將步驟I)提取的RNA，去掉RHDV-VP60氨基端31個氨基酸，具體步驟為以病毒總RNA為模板，使用PSCA-VP60R為反轉錄引物合成cDNA第一鏈，用上述特異性引物PSCA-VP60F和PSCA-VP60R進行PCR擴增，即得到缺失氨基端31個氨基酸的VP60基因。所述的RT-PCR擴增，以及克隆得到RHDV-VP60的cDNA基因序列的步驟如下用Takara M-MLV反轉錄試劑盒進行轉錄,反轉錄體系為10XBuffer 2 μ L> RNA/引物變性溶液 6 μ L、dNTP Mixture (2. 5mM) 2 μ L、RNase Inhibitor 0. 25 μ L、RTaseM-MLVO.5 μ L，加滅菌蒸餾水9. 25 μ L，使反轉錄體系體積為20 μ L，其中RNA/引物變性溶液的制備如下將5 μ L提取的RNA和I μ L PSCA-VP60R引物均勻混合，70°C水浴IOmin后，冰上極冷2min，最后離心數秒。反轉錄過程為將提取的RNA在42°C溫浴Ih后，70°C水浴15min，最后在冰上2min，_20°C保存備用；PCR 反應體系為2XPfu PCR MasterMix 12. 5 μ L、PSCA-VP60F O. 5 μ L、PSCA-VP60R0. 5 μ L、模版cDNA 2 μ L，加滅菌蒸餾水9. 5 μ L，使PCR反應體系體積為25 μ L，將反轉錄得到的樣品瞬間離心混合，采用熱蓋進行PCR擴增反應94°C預變性3min，然后94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，30個循環，72°C延伸IOmin后，10°C終止反應，并用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VP60cDNA片段。圖I為VP60基因擴增后的電泳檢測圖，該檢測圖證明獲得RHDV-VP60基因擴增片段大小為1647bp，其序列參見序列表。3)將步驟2)擴增的VP60片段利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VP60cDNA 片段； 4)將步驟3)回收的VP60cDNA片段和pSCA空載體用BamHI和SmaI進行雙酶切，并利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VP60cDNA和pSCA空載體片段；5)將回收的VP60cDNA和pSCA空載體片段用Takara公司的T4DNALigase進行連
接，連接體系如下
f T4 DNA Ligase.1 uuL
10 X BufferI .OiiL
IOuL I \rp<50 基H6JiiL
pSCA空載體IOwL
ιI ^uL連接體系為10uL，16°C水浴連接30min，將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞JM109，混勻，冰浴放置30min，42°C水浴中熱激90S后迅速置冰上2min，然后涂布于氨芐抗性平板中，12h后挑取菌落并搖菌；6)將步驟5)得到的菌液利用AxyPrep DNA質粒抽提試劑盒抽提質粒；7)重組質粒酶切鑒定根據引物中所帶酶切位點，將步驟6)中抽提得到的質粒用BamHI.Sma I進行雙酶切鑒定。酶切反應體系如下
r 重組,猶粒 5uL
10.TO. M
IOwL JBSAO.—HiL
IBaniHI5 IiL
Silli I0,5 L
、.IdH-. O3i L酶切反應體系為10uL，37°C水浴2h，然后用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切鑒定結果，檢測結果如圖2，載體條帶大小為11489bp，目的基因的條帶大小為1647bp，與預期一致，初步判定重組質粒構建成功。8)重組質粒pSCA_VP60經Invitrogen公司測序,顯示結果完全正確。至此，成功將VP60基因重組到甲病毒復制子載體pSCA真核表達載體中，構建了一種兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗-抗RHDV的pSCA-VP60RHDV疫苗。對上述制備的pSCA-VP60RHDV疫苗外源VP60基因體外瞬時表達進行鑒定，包括如下幾個方面I) VP60基因的體外mRNA表達鑒定RT_PCR法檢測將BHK-21細胞在六孔板中生長，當BHK-21細胞在六孔板中長到80%時，進行轉染。轉染過程如下:⑴將5μ g pSCA-VP60質粒和10 μ g脂質體分別加入到兩組250ulOpti-MEM培養液中，輕輕混勻，靜置5min ； (2)將含pSCA_VP60質粒的Opti-MEM培養液加 入到含脂質體的Opti-MEM培養液中，輕輕混勻，靜置20min ； (3)將六孔板中的培養液吸出并棄掉，用PBS (磷酸鹽緩沖液)洗BHK-21細胞3次，然后加入含pSCA_VP60質粒和脂質體的Opti-MEM混合液500ul，再加500ul Opti-MEM于六孔板中，輕輕搖勻；(4)放入37°C，5% CO2培養箱中，5h后換含FBS(胎牛血清)的完全培養液繼續培養，48h后取出BHK-21細胞，PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌3次后胰酶消化，然后離心棄上清，得到的細胞沉淀用于提取RNA，RNA用特異性引物PSCA-VP60R進行反轉錄獲得cDNA，以cDNA為模板，用引物PSCA-VP60F和PSCA-VP60R進行PCR擴增。PCR反應程序為94°C預變性3min，94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min,30個循環，72°C延伸lOmin，得到的PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖3，條帶大小為1647bp，與目的基因大小一樣，成功檢測到mRNA，說明目的基因已經轉入到BHK-21細胞內。2)VP60基因體外表達鑒定Western blot法檢測將BHK-21細胞在六孔板中生長，當BHK-21細胞在六孔板中長到80%時，進行轉染。轉染過程如下:⑴將5μ g pSCA-VP60質粒和10 μ g脂質體分別加入到兩組250ulOpti-MEM培養液中，輕輕混勻，靜置5min ； (2)將含質粒的Opti-MEM培養液加入到含脂質體的Opti-MEM培養液中，輕輕混勻，靜置20min ;(3)將六孔板中的培養液吸出并棄掉，用PBS洗BHK-21細胞3次，然后加入含pSCA_VP60質粒和脂質體的Opti-MEM混合液500ul，再加500ul Opti-MEM于六孔板中，輕輕搖勻；(4)放入37°C，5% CO2培養箱中，5h后換含FBS (胎牛血清)的完全培養液繼續培養，48h后取出BHK-21細胞，反復凍融裂解，跑10%SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠)電泳，最后將電泳分離的細胞總蛋白轉移至PVDF(聚偏氟乙烯)膜，用封閉液(5%脫脂乳配制)37°C封閉30min。加入I : 200稀釋的VP60多抗血清，37°C下孵育lh。用PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液)清洗3次，5min/次。辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(購自北京康為世紀生物科技有限公司)作為二抗與之反應，37°C下孵育50min，用PBST清洗3次最后用DAB顯色試劑盒(購自武漢博士德生物工程有限公司)顯色，如圖4，條帶大小與VP60蛋白大小一致，說明VP60蛋白成功獲得表達。3) VP60基因體外表達鑒定IFA法檢測將BHK-21細胞在六孔板中生長，當BHK-21細胞在六孔板中長到80%時，進行轉染。轉染過程如下(1)將5μ g PSCA-VP60質粒和IOyg脂質體分別加入到兩組250ulOpti-MEM培養液中，輕輕混勻，靜置5min ； (2)將含pSCA_VP60質粒的Opti-MEM培養液加入到含脂質體的Opti-MEM培養液中，輕輕混勻，靜置20min ； (3)將六孔板中的培養液吸出并棄掉，用PBS洗BHK-21細胞3次，然后加入含pSCA_VP60質粒和脂質體的Opti-MEM混合液500ul，再加500ul Opti-MEM于六孔板中，輕輕搖勻；(4)放入37°C，5% CO2培養箱中，5h后換含FBS (胎牛血清)的完全培養液繼續培養，48h后取出BHK-21細胞，用PBS液洗3次，5min/次。將培養的細胞用丙酮甲醇=I I固定液4°C固定15min。用PBST清洗3次，5min/次。用封閉液(5%脫脂乳配制)37°C封閉30min。加入I : 200稀釋的VP60多抗血清，37°C下孵育lh。用PBST清洗3次，5min/次。加入I : 1000稀釋的FITC標記山羊抗兔IgG 二抗(購自北京康為世紀生物科技有限公司)，37°C下孵育40min。PBST清洗3次，IOmin/次。最后置于倒置熒光顯微鏡下觀察并記錄結果，如圖5，pSCA-VP60轉染的BHK-21細胞具有很強的特異性熒光，而未轉染的BHK-21細胞無特異性熒光，說明VP60蛋白獲得表達，且表達產物存在于BHK-21細胞內。對上述得到的pSCA-VP60RHDV疫苗的免疫效果進行檢驗，包括如下幾個方面l)pSCA-VP60RHDV疫苗在兔子內免疫反應的特異性抗體檢測將8只兩月齡兔子隨機分為2組，每組4只，分別免疫pSCA-VP60和PBS，肌肉注射免疫兩次，每次間隔兩周，在第一次免疫后第2周、第二次免疫后第2周，對免疫組PSCA-VP60和對照組PBS的兔子進行耳靜脈采血，血液于37°C靜置lh，再于4°C冰箱中靜置過夜。最后，用5000轉/分鐘的轉速，離心15分鐘，得到血清。用間接ELISA法測定該血清抗體的0D450值，以RHDV-VP60原核表達蛋白為包被抗原(5 μ g/孔)于96孔酶標板上，被檢兔子血清為一抗，過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(購自北京康為世紀生物科技有限公司)為二抗，同時設立不加被檢血清的空白對照，顯色終止后，用酶標儀測定上述各樣品在450nm處的吸光值，并用SAS統計軟件分析，結果如表I和圖7，該結果顯示免疫組與對照組比較差異顯著，免疫組可以獲得好的免疫效果。表I特異性抗體檢測結果
IQP450—
I第一·次免g丨+第二 欠兔ISρΒ€ΑΛΨ6(}H34
PBS__CMSOM
I 空白對麗CUij I 046 —2) pSCA-VP60RHDV疫苗在兔子體內T淋巴細胞增殖檢測將8只兩月齡兔子隨機分為2組，每組4只，分別免疫PSCA-VP60和PBS，肌肉注射免疫兩次，每次間隔兩周，在第一次免疫后第2周、第二次免疫后第2周，對免疫組PSCA-VP60和對照組PBS的兔子進行耳靜脈采血分離淋巴細胞，以含10% FBS (胎牛血清)的DMEM(極限必需培養基)稀釋成I X 10/mL的細胞懸液。于96孔細胞培養板中培養，每孔加入100 μ L細胞懸液，同時設DMEM(極限必需培養基)自身對照，每個樣品設8個重復孔。培養板置37°C、5% CO飽和濕度條件下培養68h后，每孔加10 μ LMTT (4，5-二甲基噻唑-2) (5mg/mL)，孵育4h，加入50ul 二甲基亞砜DMSO溶液終止反應，待藍色沉淀溶解后于λ 570nm處測定OD值，對測得數值進行統計學分析，結果如表2和圖8，該結果顯示免疫組與對照組比較差異顯著，免疫組可以獲得好的免疫效果。表2T淋巴細胞增殖檢測結果
權利要求
1.一種兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗，其特征在于，該疫苗由RHDV-VP60基因和甲病毒復制子載體PSCA組成，其中，所述RHDV-VP60基因去掉了氨基端的31個氨基酸，其序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一種兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗的構建方法，其特征在于，包括如下步驟 1)以發病兔內臟組織為原料進行RHDV病毒總RNA的提取；同時設計如下兩個特異性引物PSCA-VP60F :5，ATTGGATCCteanffl DGCCACCATGGGCGTGGTGGCCGC-3，，PSCA-VP60R :5’ AGACCCGGGuTCAGACATAAGAAAAGCC-3，； 2)以病毒總RNA為模板，使用反轉錄方法，以PSCA-VP60R為反轉錄引物合成PSCA-VP60的cDNA第一鏈，之后用特異性引物PSCA-VP60F和PSCA-VP60R進行PCR擴增，得到缺失氨基端31個氨基酸的VP60基因，并用試劑盒純化回收； 3)將擴增的RHDV-VP60基因片段重組到甲病毒復制子載體pSCA真核表達質粒中，即得到兔出血癥病毒“自殺性” DNA疫苗。
3.根據權利要求2所述的兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗的構建方法，其特征在于，所述步驟I)中，RHDV病毒總RNA的提取方法為將RHDV病毒肌肉注射兩月齡的新西蘭大白兔，待新西蘭大白兔死亡后，取其肝臟制備研磨液，按常規方法提取RHDV病毒總RNA。
4.根據權利要求2所述的兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗的構建方法，其特征在于，所述的反轉錄方法為 用反轉錄試劑盒進行轉錄，反轉錄體系為=IOXBuffer 2 μ L、RNA/引物變性溶液6 μ L>2. 5mM dNTP Mixture 2 μ L、RNase Inhibitor 0. 25 μ L> RTaseM-MLV 0·5μ ,加滅菌蒸餾水9. 25 μ L，使反轉錄體系體積為20 μ L，其中所述的RNA/引物變性溶液制備方法為RNA模版5 μ L和特異性引物PSCA-VP60R I μ L在70°C水浴lOmin，冰上冷卻2min ;反轉錄過程為將提取的RHDV-VP6042°C溫浴Ih后，70°C水浴15min，最后置冰上2min，得到的樣品_20°C保存備用； PCR擴增方法為 反應體系為2XPfu PCR MasterMix 12. 5 μ L、特異性引物 PSCA-VP60F 0.5yL、特異性引物PSCA-VP60R O. 5 μ L、模版cDNA 2 μ L，加滅菌蒸餾水9. 5 μ L，使反應體系體積為25 μ L ;將上述反轉錄方法得到的樣品瞬間離心混合，采用熱蓋進行PCR擴增反應，過程為94°C預變性3min，然后94°C變性Imin，56°C退火Imin，72°C延伸2min，30個循環，72°C延伸IOmin后，10°C終止反應，并用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VP60cDNA片段。
5.根據權利要求4所述的兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗的構建方法，其特征在于，PCR擴增后獲得的RHDV-VP60基因片段大小為1647bp。
6.根據權利要求2所述的兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗的構建方法，其特征在于， 述的步驟3)中，將擴增的VP60cDNA片段重組到甲病毒復制子載體pSCA真核表達質粒中的過程具體如下 A、將擴增的RHDV-VP60基因片段和pSCA空載體用BamHI和SmaI進行雙酶切，并用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒純化回收； B、將純化回收的RHDV-VP60和pSCA空載體片段用T4DNALigase進行連接，連接體系為10XBuffer I μ L、T4DNALigase I μ L、RHDV-VP606 μ L、pSCA I μ L，加滅菌蒸餾水I μ L，使連接體系總體積為10 μ L，16°C水浴連接4h，之后將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，混勻，冰浴放置30min，42°C水浴中熱激90S后迅速置冰上2min，然后涂布于氨芐抗性平板中，12h后挑取菌落并搖菌； C、將得到的菌液利用AxyPrep DNA質粒抽提試劑盒抽提質粒，經酶切鑒定和經invitrogen公司測序顯示，結果完全正確，從而成功構建成兔出血癥“自殺性” DNA疫苗。
7.一種兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗用于制備預防兔病毒性出血癥的藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗及其構建方法。本發明的兔出血癥病毒“自殺性”DNA疫苗，由RHDV-VP60基因和甲病毒復制子載體pSCA組成。該DNA疫苗的構建方法包括RHDV病毒總RNA的提取及純化，設計特異性引物，通過RT-PCR擴增，克隆得到RHDV-VP60的cDNA基因序列，去掉RHDV-VP60氨基端31個氨基酸，最后將純化后的VP60cDNA片段重組到甲病毒復制子載體pSCA真核表達質粒中。與現有技術相比，本發明的疫苗安全高效，并可隨細胞凋亡而被機體清除，從而避免DNA質粒可能整合到宿主細胞染色體或可能造成免疫耐受等隱患，且更長效穩定，操作便捷。
文檔編號C12N15/66GK102935240SQ20121048936
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月26日 優先權日2012年11月26日
發明者劉光清, 程英杰, 孟春春, 陳宗艷, 李傳峰 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所