專利名稱：一種定點突變的耐高溫植酸酶基因tp及其表達載體和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學飼料添加劑領域，具體涉及一種定點突變的耐高溫植酸酶基因TP及其表達載體和應用。
背景技術：
植酸(肌醇六磷酸)是植物中磷的主要儲存形式，植酸及其鹽類是谷物、豆類及油料等作物中磷的主要貯存形式。由于單胃動物的胃內缺乏相應的酶而不能水解利用植酸，這造成了磷源的浪費，而且不能被利用的植酸中的磷被直接排出體外，造成了土壤及水域的磷污染。另外，植酸還能與礦質元素及蛋白質螯合，使這些營養元素不能被有效利用，導致了植物性飼料營養價值的降低，因此植酸也被普遍認為是飼料中的一種抗營養因子。 植酸酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，目前實際應用的植酸酶均來源于微生物。天然微生物中植酸酶含量太低，難以大量獲得廉價的植酸酶產品，不能滿足飼料工業發展的要求。目前利用基因工程菌來獲得高表達量的植酸酶，對植酸酶的廣泛應用及降低生產成本發揮了重要作用。目前已經有多種微生物來源的植酸酶基因得到分離，如黑曲霉、芽孢桿菌、大腸桿菌等。根據研究對比，來源于大腸桿菌的植酸酶(appA植酸酶)是迄今所知的分解植酸能力最強的植酸酶。1985年首次克隆出了大腸桿菌植酸酶編碼基因appA ；1990年對該基因進行了序列分析；1992年通過定點突變的方法實現了 appA基因的過量表達。目前，植酸酶制劑在應用上的一個關鍵問題即酶的熱穩定性始終沒有得到很好地解決，制粒高溫對植酸酶酶活產生極大的破壞，雖然研究者已從不同的方面對植酸酶的耐熱性進行了許多富有成效的研究，如通過篩選產耐熱植酸酶的菌株、運用蛋白質工程、改進生產工藝等方法來獲得耐熱植酸酶，但是獲得的植酸酶耐熱效果仍然不理想。

發明內容
本發明提供了一種定點突變的耐高溫植酸酶基因TP及其表達載體和應用，本發明通過定點突變大腸桿菌的植酸酶(appA植酸酶)氨基酸序列，來提高植酸酶的熱穩定性，并按照畢赤酵母密碼子偏好性改造其基因，以獲得植酸酶突變體的高效表達。為實現上述發明目的，本發明采用下述技術方案予以實現本發明提供了一種定點突變的耐高溫植酸酶基因TP，其堿基序列如SEQ ID No 4所示；所述對應的耐高溫植酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID No 5所示。本發明還提供了含有所述的耐高溫植酸酶基因TP的載體，具體所述載體為PPIC9K-TP。本發明提供了所述的耐高溫植酸酶在作為飼料添加劑中的應用，所述耐高溫植酸酶的用量為100-200克/噸飼料。與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是為提高植酸酶熱穩定性，本發明選擇了迄今所知的分解植酸能力最強的植酸酶-大腸桿菌植酸酶(appA植酸酶)，先將植酸酶氨基酸序列中特定區域的氨基酸突變成脯氨酸(P)和精氨酸(R)，使植酸酶具有特殊的穩定蛋白質結構，后將植酸酶氨基酸序列反方向翻譯獲得基因序列，在對植酸酶氨基酸序列的部分區域進行定點突變的同時對其基因序列按畢赤酵母菌密碼子偏好性、GC含量對其基因序列進行優化，同時按照畢赤酵母密碼子偏好性人工合成植酸酶基因后，將其克隆到真核載體PPIC9K中，構建了重組質粒pPIC9K-TP。將重組質粒pPIC9K_TP線性化后經電擊轉化法轉到畢赤酵母GS115中，將篩選獲得陽性轉化子進行誘導表達獲得耐高溫且表達量高的植酸酶。用分光光度法檢測植酸酶的酶活性，并在不同反應溫度條件下檢測植酸酶的酶活比率。經實驗證明，由畢赤酵母表達后獲得的植酸酶可以耐受85°C以上的高溫制粒，存留率達到85%。本發明通過改造氨基酸序列獲得的植酸酶突變體具有很好的耐熱性，在畢赤酵母中獲得高表達量。這種植酸酶的推廣應用，不僅對我國飼料畜牧業的發展產生可觀的經濟效益和社會效益，同時也可產生巨大的生態效益。結合附圖閱讀本發明的具體實施方式
后，本發明的其他特點和優點將變得更加清
λ·Μ
/E. ο


圖I是本發明中重組質粒PUC18-T-TP的PCR鑒定電泳圖譜，M表示DL2000 DNAmarker ；1 表示質粒 pUC18_T_TP 的 PCR 產物。圖2是本發明中重組表達質粒pPIC9K-TP的PCR鑒定電泳圖譜，M表示DL2000 DNAmarker ；1表示質粒pPIC9K_TP的PCR產物。圖3是本發明中植酸酶突變體蛋白SDS-PAGE的凝膠圖譜，圖中M表示蛋白麗Marker ;1表示重組菌株GS115/pPIC9K_TP表達上清；2表示重組菌株GS115/pPIC9K誘導上清。圖4是本發明中改造后植酸酶在不同反應溫度條件下植酸酶酶活圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明的技術方案作進一步詳細的說明。實施例I一、大腸桿菌植酸酶(appA植酸酶)蛋白質突變體基因的獲得I、選擇大腸桿菌菌株Escherichia coli str. K-12中的植酸酶基因序列如SEQ IDNo 2所示，appA植酸酶氨基酸序列如SEQ ID No 1所示,植酸酶的活性位點保守序列為RHGXRXP。NCBI中植酸酶氨基酸序列(SEQ IDNo 1)QSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWPTWPVKLGWLTPRGGELIAYLGHYQRQRLVADGLLAKKGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILSRAGGSIADFTGHRQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESCSLTQALPSELKVSADNVSLTGAVSLASMITEIFLLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFYLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRD
KTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSLNCBI中植酸酶堿基序列(SEQ IDNo 2)CAGAGTGAGCCGGAGCTGAAGCTGGAAAGTGTGGTGATTGTCAGTCGTCATGGTGTGCGTGCTCCAACCAAG |GC Cl· ACGCMCTGATGCAGGATGTCACCCCAGACGCATGGCCAACCTGGCCGGTA —|AAA| 丨 CTGGGTTGGCTGACACCGCGCGGTGGTGAGCTAATCGCCTATCTCGGACATTACCAACGCCAGCGTCTGGTAGCCGACGGATTGCTGGCGAMAAGGGCTGCCCGCAGTCTGGTCAGGTCGCGATTATT |GCT|' GATGTCGACGAGCGTACCCGTAMACAGGCGAAGCCTTCGCCGCCGGGCTGGCACCTGACTGTGCAATAACCGTACATACCCAGGCAGATACGTCCAGTCCCGATCCGTTATTTAATCCTCTAAAAACTGGCGTTTGCCAACTGGATAACGCGAACGTGACTGACGCGATCCTCAGCAGGGCAGGAGGGTCAATTGCTGACTTTACCGGGCATCGGCAAACGGCGTTTCGCGAACTGGAACGGGTGCTTAATTTTCCGCAATCAAACTTGTGCCTTAAACGTGAGAAACAGGACGAAAGCTGTTCATTAACGCAGGCATTACCATCGGAACTCAAGGTGAGCGCCGACAATGTCTCATTAACCGGTGCGGTAAGCCTCGCATCAATGCTGACGGAGATATTTCTCCTGCAACAAGCACAGGGAATGCCGGAGCCGGGGTGGGGAAGGATCACCGATTCACACCAGTGGAACACCTTGCTAAGTTTGCATAACGCGCAATTTTATTTGCTACAACGCACGCCAGAGGTTGCCCGCAGCCGCGCCACCCCGTTATTAGATTTGATCAAGACAGCGTTGACGCCCCATCCACCGCAAAAACAGGCGTATGGTGTGACATTACCCACTTCAGTGCTGTTTATCGCCGGACACGATACTAATCTGGCAAATCTCGGCGGCGCACTGGAGCTCAACTGGACGCTTCCCGGTCAGCCGGATAACACGCCGCCAGGTGGTGAACTGGTGTTTGAACGCTGGCGTCGGCTAAGCGATAACAGCCAGTGGATTCAGGTTTCGCTGGTCTTCCAGACTTTACAGCAGATGCGTGATAAAACGCCGCTGTCATTAAATACGCCGCCCGGAGAGGTGAAACTGACCCTGGCAGGATGTGAAGAGCGAAATGCGCAGGGCATGTGTTCGTTGGCAGGTTTTACGCAAATCGTGAATGAAGCACGCATACCGGCGTGCAGTTTGTAA2、對apppA植酸酶氨基酸序列進行定點突變耐熱酶蛋白中亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、谷氨酸(E)和精氨酸(R)含量均高于常溫菌所產植酸酶。其中脯氨酸結構熵小而易折疊，且一經折疊后則需要很高的能量才能解開，從而提高蛋白質穩定性。所以通過定向突變技術，將植酸酶鄰近活性中心的部分氨基酸突變為脯氨酸，能有效提高植酸酶的熱穩定性。由于脯氨酸易形成β折疊，從而使構象更穩定牢固，在穩定蛋白質結構和提高酶熱穩定性方面具有不可忽視的作用。精氨酸比帶同樣電荷的氨基酸有更大的側鏈，側鏈所提供的疏水作用及離子間互相作用能提高蛋白質的穩定性。因此本發明在植酸酶成熟蛋白氨基酸序列中的第25位、第87位的丙氨酸(A)對應的密碼子突變成脯氨酸(P)的密碼子，第43位氨基酸賴氨酸(K)對應的密碼子突變為精氨酸(R)的密碼子，由獲得的堿基序列根據畢赤酵母密碼子偏好性，將其堿基序列進行密碼子改造，后經畢赤酵母表達獲得耐高溫、高表達量的植酸酶。突變后的植酸酶堿基序列如SEQ IDNo :3所示，突變并優化后的植酸酶堿基序列如SEQ ID No :4所示，突變后植酸酶氨基酸序列如SEQ ID No 5所示。突變后的植酸酶基因序列如下所示(SEQ ID No :3)，下劃線部分為活性位點保守序列對應的基因序列。方框部分堿基分別對應第25、43和87位氨基酸。CAGAGTGAGCCGGAGCTGAAGCTGGAAAGTGTGGTGATTGTCAGTCGTCATGGTGTGCGTGCTCCAACC
aag|cca]acgcaactgatgcaggatgtcaccccagacgcatggccaacctggccggta.|aga|'CTGGGTTGGCTG
ACACCGCGCGGTGGTGAGCTAATCGCCTATCTCGGACATTACCAACGCCAGCGTCTGGTAGCCGACGGATTGCTGGCGAAAAAGGGCTGCCCGCAGTCTGGTCAGGTCGCGATTATT |C C Af GATGTCGACGAGCGTACCCGTAAAACAGGCGAAGCCTTCGCCGCCGGGCTGGCACCTGACTGTGCAATAACCGTACATACCCAGGCAGATACGTCCAGTCCCGATCCGTT
ATTTAATCCTCTAAAAACTGGCGTTTGCCAACTGGATAACGCGAACGTGACTGACGCGATCCTCAGCAGGGCAGGAG
GGTCAATTGCTGACTTTACCGGGCATCGGCAAACGGCGTTTCGCGAACTGGAACGGGTGCTTAATTTTCCGCAATCA
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GACTTTACAGCAGATGCGTGATAAAACGCCGCTGTCATTAAATACGCCGCCCGGAGAGGTGAAACTGACCCTGGCAG
GATGTGAAGAGCGAAATGCGCAGGGCATGTGTTCGTTGGCAGGTTTTACGCAAATCGTGAATGAAGCACGCATACCG
GCGTGCAGTTTGTAA優化后的植酸酶基因序列如下所示(SEQ ID No 4) CAATCTGAACCAGMTTGAAGTTGGAATCTGTTGTTATCGTTTCTAGACACGGTGTTAGAGCTCCAACTAAGCCAACTCAATTGATGCAAGACGTTACTCCAGACGCTTGGCCAACTTGGCCAGTTAGATTGGGTTGGTTGACTCCAAGAGGTGGTGAATTGATCGCTTACTTGGGTCACTACCAAAGACAAAGATTGGTTGCTGACGGTTTGTTGGCTAAGAAGGGTTGTCCACAATCTGGTCAAGTTGCTATCATCCCAGACGTTGACGAAAGAACTAGAAAGACTGGTGAAGCTTTCGCTGCTGGTTTGGCTCCAGACTGTGCTATCACTGTTCACACTCAAGCTGACACTTCTTCTCCAGACCCATTGTTCAACCCATTGAAGACTGGTGTTTGTCAATTGGACAACGCTAACGTTACTGACGCTATCTTGTCTAGAGCTGGTGGTTCTATCGCTGACTTCACTGGTCACAGACAAACTGCTTTCAGAGAATTGGAAAGAGTTTTGAACTTCCCACAATCTAACTTGTGTTTGAAGAGAGAAAAGCAAGACGAATCTTGTTCTTTGACTCAAGCTTTGCCATCTGAATTGAAGGTTTCTGCTGACAACGTTTCTTTGACTGGTGCTGTTTCTTTGGCTTCTATGTTGACTGAAATCTTCTTGTTGCAACAAGCTCAAGGTATGCCAGAACCAGGTTGGGGTAGAATCACTGACTCTCACCAATGGAACACTTTGTTGTCTTTGCACAACGCTCAATTCTACTTGTTGCAAAGAACTCCAGAAGTTGCTAGATCTAG AGCTACTCCATTGTTGGACTTGATCAAGACTGCTTTGACTCCACACCCACCACAAAAGCAAGCTTACGGTGTTACTTTGCCAACTTCTGTTTTGTTCATCGCTGGTCACGACACTAACTTGGCTAACTTGGGTGGTGCTTTGGAATTGAACTGGACTTTGCCAGGTCAACCAGACAACACTCCACCAGGTGGTGAATTGGTTTTCGAAAGATGGAGAAGATTGTCTGACAACTCTCAATGGATCCAAGTTTCTTTGGTTTTCCAAACTTTGCAACAAATGAGAGACAAGACTCCATTGTCTTTGAACACTCCACCAGGTGAAGTTAAGTTGACTTTGGCTGGTTGTGAAGAAAGAAACGCTCAAGGTATGTGTTCTTTGGCTGGTTTCACTCAAATCGTTAACGAAGCTAGAATCCCAGCTTGTTCTTTGTAA突變后氨基酸序列如下所示(SEQ ID No 5)QSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKPTQLMQDVTPDAWPTWPVRLGWLTPRGGELIAYLGHYQRQRLVADGLLAKKGCPQSGQVAIIPDVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILSRAGGSIADFTGHRQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESCSLTQALPSELKVSADNVSLTGAVSLASMLTEIFLLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFYLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSL3、將獲得的植酸酶基因序列送生物公司合成，合成好的植酸酶基因克隆到PUC18-T載體上。
二、重組質粒pPIC9K_TP的構建所采用的酵母表達載體為pPIC9K，構建載體的宿主細胞是大腸桿菌DH5 α。I、設計引物根據新合成的植酸酶基因序列設計上下游引物FI、R1，所述引物均由上海生工公司合成，所述引物的序列如下，下劃線部分堿基代表相應酶切位點表I :PCR擴增所用弓丨物
權利要求
1.一種定點突變的耐高溫植酸酶基因TP，其堿基序列如SEQ ID Νο:4所示。
2.一種耐高溫植酸酶,其氨基酸序列如SEQ ID Νο:5所示。
3.重組載體，其含有權利要求I所述的耐高溫植酸酶基因ΤΡ。
4.根據權利要求3所述的重組載體，其特征在于所述載體為PPIC9K-TP。
5.根據權利要求2所述的耐高溫植酸酶在作為飼料添加劑中的應用。
6.根據權利要求5所述的耐高溫植酸酶在作為飼料添加劑中的應用，其特征在于所述耐高溫植酸酶的用量為100-200克/噸飼料。
全文摘要
本發明提供了一種定點突變的耐高溫植酸酶基因TP及其表達載體和應用，本發明先將植酸酶氨基酸序列中特定區域的氨基酸突變成脯氨酸和精氨酸，使植酸酶具有特殊的穩定蛋白質結構，同時對其基因序列按畢赤酵母菌密碼子偏好性、GC含量對其基因序列進行優化合成植酸酶基因，構建重組質粒，并將重組質粒轉到畢赤酵母中，篩選獲得陽性轉化子進行誘導表達獲得耐高溫植酸酶。經實驗證明，由畢赤酵母表達后獲得的植酸酶可以耐受85℃以上的高溫制粒，存留率達到85%。所述耐高溫植酸酶的推廣應用，不僅對我國飼料畜牧業的發展產生可觀的經濟效益和社會效益，同時也可產生巨大的生態效益。
文檔編號C12N9/16GK102943083SQ20121048905
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月27日 優先權日2012年11月27日
發明者張大偉, 王希輝 申請人:青島根源生物技術集團有限公司