專利名稱：油菜BnRabGDI3啟動子的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程和生物技術領域，具體涉及一種甘藍型油菜BnRab⑶13基因啟動子(命名SPBnKabeDI3，以下相同)，同時還涉及一種甘藍型油菜BnRab⑶13啟動子的制備方法。本發明還涉及含有該啟動子或其實質同源核苷酸序列的載體和涉及利用該啟動子在油菜及其它植物基因工程中的應用。
背景技術：
植物基因啟動子在基因的表達調控中起著關鍵作用。基因表達的調控是多種因素綜合作用的結果。一般按照一個事件的先后順序，基因的調控分為轉錄水平的調控、翻譯水平的調控以及蛋白質加工水平的調控等?；蚓幋a的蛋白質和RNA及其次級代謝產物對于維持生物體的整個生命活動極其重要。任何基因表達調控的錯誤都會對生命造成嚴重后 果。因此，對于基因表達調控的機理研究一直是分子生物學研究的熱點。轉錄水平的調控最為重要。啟動子是轉錄水平調控的重要元件，也是基因工程表達載體的一個重要組成部分。植物基因啟動子是位于結構基因5’端上游區、含有順式作用元件的一段DNA序列，決定著下游基因轉錄的特異性、方向和效率，是基因轉錄調控機制和表達模式中最關鍵的因子。此外，啟動子在構建能夠高水平表達異源表達載體的過程中起到關鍵作用，它決定了外源基因的基因表達的時空順序、表達強度、轉錄效率和基因的表達水平。所以，研究啟動子的功能序列對于基因表達調控機制以及日漸成熟的植物基因工程具有非常重要的科學意義。通過對多種植物基因啟動子區的分析發現，絕大多數功能蛋白基因的啟動子都具有共同的結構模式，一般由啟動子核心元件和上游元件組成。位于轉錄起始位點上游-20—30bp處的TATA box為啟動子核心元件，是富含有AT的保守序列區，與DNA雙鏈的解鏈有關，并決定轉錄起始點的選擇，是絕大多數植物啟動子正確表達所必需的。TATAbox上游的保守序列稱為啟動子上游元件，包括上游_75bp處的CAAT box和-80—110bp附近的GC box等一般上游啟動子元件及其他特殊的上游元件，如茉莉酸類物質應答元件(JRE)、乙烯響應元件(ERE)等元件(張春曉等，植物基因啟動子研究進展。遺傳學報，2004，31 (12) :1455-1464 ;路靜等，高等植物啟動子及其應用研究進展。自然科學進展，2004，14
(8):856862)。CAAT box是比較保守的序列，與RNA聚合酶的識別和結合有關，對基因轉錄有較強的激活作用。然而有些基因無此框，如禾谷類作物的貯藏蛋白基因中無CAAT框而被CATC框代替。GC box的保守序列是5‘GGGCGG3’，可有多個拷貝，并能以任何方向存在而不影響其功能(路靜，趙華燕，何奕昆，宋艷茹，高等植物啟動子及其應用研究進展。自然科學進展，2004，14 (8):856862 ;夏江東，陳在全，吳渝生，季鵬章，高等植物啟動子功能和結構研究進展。云南農業大學學報，2006，21 (1):714)。只要具有了這些保守的結構框，那么就可以具有相應的啟動下游基因表達的功能。根據植物啟動子的轉錄模式可將其分為組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導型啟動子。組成型啟動子驅動的外源基因在轉基因植株的所有發育時期和組織中穩定表達。對許多雙子葉植物的轉化，通常都使用來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子或來自細菌的胭脂氨酸合成酶nos啟動子的質粒載體，而在單子葉植物轉化中最常用的是含有水稻肌動蛋白Act啟動子，玉米泛素Ubi啟動子及35S啟動子的質粒載體(關麗英等，轉基因植物中外源基因的有效表達及其安全評價。首都師范大學學報，2002，23 (2):52-56)。但是很多時候外源基因在受體植物中的持續高效表達不僅造成生物體內能源的浪費，而且在所有組織中的表達有可能對植株本身具有毒害作用，甚至引起轉基因安全問題(JiaS-R. Environment and food biosafty assessment of transgenic plants. Advanced ofBioengineer· 1997，17:37-42 ;Moris S H，Adley C. C. Irish public perceptions andattitudes to modern biotechnology:an overview with a focus on GM foods. Trendsin Biotechnology. 2001，19:43-48)。因此，誘導型啟動子和組織特異性啟動子的研究和應用日益受到育種工作者的重視。在轉基因植物中鑒定的誘導型啟動子主要包括非生物脅迫誘導型啟動子，生物脅迫誘導型啟動子和激素誘導型啟動子等(聶麗娜等，植物基因啟動子的克隆及其功能研究進展。植物遺傳資源學報，2008,9 (3) : 385-391 )。但是誘導型啟動子的應用也具有一定限制，對受體植物進行的外在條件處理，如熱激，激素處理等可能引起生物 體內一系列的生理生化反應而不利于植株的正常生長。此外，化學調控系統中用作誘導物的甲基脫氫!皮質醇(dex, dexamethasone)、雌二醇(estradiol)和四環素(tetracycline)都對生態環境有害，不宜用于生產實踐。使用植物體內本身的組織特異性啟動子就可以避免這種問題，顯然，外源基因的組織特異性表達必將有效提高轉基因作物的生物安全性。(宋揚等，植物組織特異性啟動子研究。生物技術通報，2007，(4) :21-24).近些年來，關于組織特異性啟動子研究取得了很大的進步，這些組織特異性啟動子主要包括葉片、韌皮部、維管束和根等器官特異表達啟動子和花粉、花器官、果實、種子等生殖器官特異表達啟動子(宋揚等，植物組織特異性啟動子研究。生物技術通報，2007，(4) :21-24)。如Ariizumi等分離了 LTP12, XTH3和PGA4的啟動子并轉化擬南芥，GUS染色表明這3個啟動子為花藥特異表達啟動子，且在不同的時期表達存在差異(Ariizumi et al, Comparative study of promoter activity of three anther-specificgenes encoding lipidtransfer protein, xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase and polygalacturonase in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant CellReport. 2002, 21:90 - 96) 0在芝麻中克隆得到微粒體油酸脫氫酶基因(FAD2)的啟動子，預測分析顯示此啟動子中的E-box和G-box元件與三酰甘油的生物合成有關。通過轉化擬南芥后檢測⑶S基因表達，結果顯示該啟動子在種子中特異表達(Mi Jung Kimetal. Seed-specific expression of sesame microsomal oleic acid desaturase iscontrolled by combinatorial properties between negative cis-regulatory elementsin the SeFAD2promoter and enhancers in the5’-UTR intron. Molecular Genetics andGenomics. 2006,276:351-368)。耿安奇等從白菜型油菜、甘藍型油菜、菜苔、甘藍中分離了 4個啟動子并轉化煙草，GUS染色分析表明其為花器官特異表達的啟動子(Geng etal.Expression analysis of four flower-specific promoters of Brassica spp.in theheterogeneous host tobacco. African Journal of Biotechnology. 2009, 8(20):51935200)。此外，Mariani等將煙草花藥絨氈層特異表達基因啟動子TA29與核酸酶基因Barnase、RnaseTl融合后轉化植物，核酸酶基因在花藥中特異表達，并破壞絨氈層，獲得雄性不育煙草和油菜(Mariani C. etal. Induction of male sterility in plants by a chimaericribonuclease gene. Nature, 1990，347:737741 )。目前 TA29 啟動子已在煙草、玉米、油菜、擬南芥、水稻等植物上應用并獲得成功(宋揚等，植物組織特異性啟動子研究。生物技術通報，2007，(4):2124)。由此可見，即使不同的植物之間的體內環境不同以及基因間存在互作差異，即使是與擬南芥性質差異較大的植物，只要具有保守的核心啟動區域和相應保守的調控元件，就可以在其他不同植物中發揮啟動下游基因表達的生物學功能。近年來，對啟動子的功能研究，大量文獻報道采用的方法通常是先用生物信息學初步預測和分析啟動子序列后，再將啟動子片段與報告基因融合構建表達載體，轉化模式植物擬南芥、煙草、水稻等的離體培養細胞或植物體，再通過檢測報告基因在轉基因個體中的表達情況分析啟動子的功能并加以利用。大量的文獻報道顯示其他植物的啟動子轉化到上述植物中均可正常的行使其生物功能，如在芝麻中克隆的微粒體油酸脫氫酶基因(FAD2)的啟動子，此啟動子中的E-box和G-box元件與三酰甘油的生物合成有關。在轉基因擬南芥和其他轉基因植物中也顯示出了種子特異性的表達(Mi Jung Kim, Heeja Kim, Mi Chung Suh. Seed-specific expression of sesame microsomal oleicacid desaturase is controlledby combinatorial properties between negativecis-regulatory elements in the SeFAD2promoter and enhancers in the5 ' -UTRintron. Molecular Genetics and Genomics. 2006，276 (4) : 351-368)。從玉米中克隆的ZmGLUl基因啟動子，連接⑶S報告基因后轉化至煙草中，檢測分析結果玉米的ZmGLUl啟動子驅動了 GUS基因在煙草根部高效表達(Riliang Gu, Li Zhao, Guoying Wang. Isolationof a maize beta—glucosidase gene promoter and characterization of its activityin transgenic tobacco. Plant Cell Reports. 2006，25 (11) : 1157-1165)。從馬鈴薯中分離的一個與乙醇脫氫酶非常相似的TDF511 (tran-script derived fragment)基因Stgan的啟動子。構建Stgan啟動子-GUS融合表達載體轉化煙草，GUS組織化學染色顯示該啟動子驅動基因在煙草莖結節處特異表達，可能參與塊莖形成過程(Trindade L M, etal. Isolation and functional characterization of a stolon specific promoter frompotato (Solanum tuberosum L.). Gene, 2003, 303:77-84.)。以上這些報道都是利用轉基因技術在不同的植物間進行啟動子功能分析的例子，這些實例表明利用模式植物擬南芥、煙草等作為載體，通過轉基因植株的表達分析證實來自于其他植物的啟動子的功能是被廣泛認可和接受的。油菜作為中國主要的油料作物，在長江流域廣泛種植，對國計民生具有重要影響。隨著轉基因技術的成熟，轉基因油菜必然會面臨轉基因安全風險的輿論。用在油菜種子中完全不表達的啟動子來啟動目的基因的表達是解決這個問題的一個可行方法，既達到既提高油菜各方面品質，又不引起食用油安全風險的目的。因此，本發明開發了一個甘藍型油菜內源啟動子。通過檢測報告基因⑶S的表達特征證明啟動子驅動的基因在根、莖、葉片、角果、種子中不表達，在花藥和花粉粒中高量表達。我們的結果預示著該基因的啟動子在轉基因植物中具有良好的應用前景
發明內容
本發明的第一個目的是在于提供了一種甘藍型油菜PBnKabeDI3啟動子，其優點在于二個方面首先，來源于油菜內源的組織特異性啟動子能夠精確定位所調控的基因，驅動目的基因在轉基因油菜的特定組織或時期表達，避免造成植物自身能源和物質的浪費。其次，提高外源基因在轉基因植物中的表達效率，限制其表達部位。因此，該啟動子可應用于植物的基因工程研究和籽用油菜安全轉基因研究。本發明的第二個目的是在于提供了一種甘藍型油菜PBnKabeDI3啟動子的制備方法。該方法以甘藍型油菜基因組DNA為模板，進行PCR擴增，獲得甘藍型油菜PBnEabeDI3序列。其優點在于操作簡單，結果穩定可靠。本發明的第三個目的是在于提供了一種含有植物高效表達啟動子的重組載體，其含有所述的啟動子核苷酸序列。該載體大小適合，在植物中易與轉化，所帶有的標記基因GUS表達強度高，容易檢測。通過這個載體轉化擬南芥可以獲得GUS基因在植物中高效表達的擬南芥轉基因植株。本發明第四個目的是在于提供了一種甘藍型油菜PBnKabeDI3啟動子在花藥、花粉粒 中的應用。在該啟動子的驅動下，目的基因主要在植株的花藥中精細表達，在其它部位不表達。這一具有組織特異性表達的啟動子在創建不育系、人工創建種質資源等基因工程和轉基因安全(食用、花粉漂流)中具有良好的應用價值。為了完成上述目的，本發明采用如下技術方案為了獲得本發明，發明人對油菜發育過程中的相關基因進行了深入和全面的研究，結果發現一種新的啟動子。該啟動子驅動的內源基因在擬南芥的花藥和花粉粒中高效表達。根據本發明的一個方面，上述目的可以通過提供一種啟動子來實現，所述啟動子能夠特異性驅動下游基因在擬南芥中高效表達，所述啟動子含有SEQ ID No. I核苷酸序列或與SEQ ID No. I實質上同源的核苷酸序列。根據本發明的另一個方面，上述目的可以通過提供含有所述啟動子的核苷酸序列的重組載體來實現。根據本發明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述重組載體轉化的微生物來實現。根據本發明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述微生物轉化的轉基因擬南芥來實現。I 一種甘藍型油菜啟動子PBnEabeDI3的制備方法，其步驟是I. I同源序列法克隆
PBnEabGDI3 序列I. I. I油菜啟動子
PBnEabGDI3 的引物序列根據油菜全基因組測序獲得的BnRab⑶13基因序列信息，在其ATG起始密碼子處上游2kb位置序列設計一對引物進行PCR擴增，此序列包括甘藍型油菜BnRab⑶13基因的起始密碼子和該基因的啟動子序列。采用的引物為PBnRab⑶I3S :5' -(Kpn I)CAGaagcttGAGTAAATACAGAACAGTGTTAC-3'和 PBnRab⑶I3A :5' -(Xba I)GACAtctagaTGTTGCAACCAATCTCTATTATC-3/。所用正向引物PBnRab⑶I3S含有Kpn I酶切位點，反向引物PBnRab⑶I3A含有Xba I酶切位點。I. 2. 2油菜啟動子
PBnEabGDI3 的制備
本發明所用油菜為甘藍型油菜(Brassica napus L.)中雙九號(油料作物研究所王新發副研究員提供，以下相同)。中雙九號播種于大田，正常田間管理。利用SDS裂解法(J.薩姆布魯克.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社，以下相同)提取中雙九號油菜葉片基因組DNA，以此為模板進行PCR擴增，步驟是提取基因組DNA25y 1，以此為模板進行擴增，反應體系為50 μ 1，分別添加IOXEx Taq buffer5y I,dNTP4 μ 1，5，引物 I μ 1，3，引物 I μ I,ExTaqO. 5 μ 1，DNA 模版 I μ I 約 50ng, ddH2037. 5 μ I。引物為根據油菜全基因組測序獲得的BnRab⑶13基因上游2kb序列設計的PBnRab⑶I3S和PBnRab⑶13A (前面已述)。擴增產物大小為2064bp，PCR反應程序為94°C 5分鐘，94°C I分鐘，60。。I分鐘，720C 2分鐘，33個循環，72°C 10分鐘，16°C 3小時，PCR產物經I. 0% (瓊脂糖凝膠/TE溶液質量體積比，以下相同)瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技北京有限公司，以下相同)純化回收后，連接到PMD18-T載體(購自大連寶生物工程有限公司，以下相同)，熱激法(J.薩姆布魯克.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社，以下相同)轉化gold菌株的感受態細胞(購自大連寶生物工程有限公司，以下相同)，涂布于含有氨芐青霉素50μ g/mL (質量體積比，以下相同)的LB固體培養基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解 于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121 °C，6. 859 X 104Pa下高壓消毒20分鐘。分裝到培養皿中，4°C冷藏備用，以下相同)平板上，37°C培養過夜，挑選白斑6個。采用 M13 引物5' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3'和 5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3'，做菌落PCR檢測。菌落PCR具體方法(以下相同)是用滅菌的牙簽挑取少量菌斑做模版，反應體系為 10 μ L 內含:10XTaq buffer (含 MgCl2)ly I, I. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ 1，5’引物(10ymol/L)0. 5μ 1，3，引物(10 μ mol/L) O. 5 μ l,Taq(5U/y 1)0. 5 μ l，ddH206. 5 μ I。反應條件為94°C 5分鐘，94°C I分鐘，550C I分鐘，72°C 2分鐘30秒，33個循環，72°C 10分鐘，擴增大小為2064bp，I. 0%(前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測大小正確后。將PCR檢測大小正確的菌斑接種到含氨芐青霉素50 μ g/mL的液體LB培養基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升，121°C，6. 859X104Pa下高壓消毒20分鐘，以下相同)，37°C下200r/min振蕩培養過夜，小量堿法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社，以下相同)提取質粒，I. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒DNA大小正確后(為2064bp)，采用Kpn I /Xba I酶(2種酶購自TaKaRa公司，以下相同)切對質粒進行雙酶切(以下相同),酶切體系(以下相同)為 10 μ 1，包含質粒 DNA5y I, Kpn I O. 5 μ I, Xba 10. 5 μ l,ddH204y 1，37°C 過夜，
I.0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測。將檢測正確的陽性重組克隆命名為pMD18-PBnEabeDI3(將目的片段PBnKabeDI3連入PMD18-T載體構建而成，以下相同)，為了確保載體中啟動子的序列信息，將pMD18-PBnKabeDI3送上海英駿公司進行測序，分析結果顯示，獲得了一種分離的油菜BnRab⑶13基因全長啟動子，其序列為SEQ ID NO: I所示核苷酸序列。命名為PBnKaM)I3。將所克隆并測序得到的BnRab⑶13上游序列PBnKab_用啟動子核心元件和上游順式作用兀件用預測軟件 PLACE 中的 Signal Scan Search (Higo et al. , Plant cis-actingregulatoryDNA elements(PLACE) database. Nucleic Acids Research. 1999,27:297 300. http ://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/signalscan. html)、PlantCARE (MagaliLescot, Patrice DAehais,Gert Thijs,et al. PlantCARE,a database of plantcis-acting regulatory elements and a portal to tools for in siIico analysis ofpromoter sequences. Nucleic Acids Res, 2002, 30(I):325-327. http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 和 Softberry 的 PlantPromDB (IIhamA. Shahmuradov, Alex J. Gammerman, John M. Hancock, et al. PlantProm:a database ofplant promoter sequences. Nucleic Acids Res.,2003,31 (I):114-117. http://linuxl.softberry.com/berry, phtml topic=pIantprom&group=data&subgroup=pIantprom)這些在線軟件進行BnRabGDI3啟動子核心元件和上游順式作用元件的在線預測分析。結果表明，BnRab⑶13啟動子序列PBnKab_含有真核生物啟動子必須的核心元件TATA-box 和 CAAT-box，與 TATA-box 相距 30bp。與 CAAT-box 相距 60bp 處的 A 為轉錄起始位點，這與真核生物的轉錄起始位點多為A這一規律一致。進一步分析該啟動子序列發現，除了必須的核心元件之外，BnRabGDI3啟動子序列中還存在多種已知的啟動子功能元件(I) P0LLENILELAT52 (AGAAA)、LAT enhancer element (TGTGA)、GTGA-motif (GTGA) 和TTTCT元件，這些是花粉特異啟動子的功能元件；(2 ) CCGTCC-box (CCGTCC )，為分裂組織特異表達元件；(3) Skn-Ijnotif (GTCAT),為胚乳高水平表達的順式調控元件；(4)MBS (TAACTG)，為響應干旱脅迫的MYB蛋白結合位點；(5) TCA_element (GAGAAGAATT)，為水楊酸順式調控元件；(6)CGTCA-motif (CGTCA)，為茉莉酸甲酯響應元件；(7) 02-site(GATGATGTAG)，為代謝調控位點；(8)D0FC0REZM (AAAG)，是Dof轉錄因子的作用位點(BateN,Twell D. Functional architecture of a late pollen promoter:pollen-specifictranscription is developmentalIy regulated by multiple stage-specific andcodependent activator elements.Plant Molecular Biology. 1998, 37, 859 - 869 ；Park, J. I. , Hakozaki, H. , Endo, M. , et al. Molecular characterization of maturepollen-specific genes encoding novelsmalI cysteine-rich proteins inrice (Oryza sativa L·)· Plant Cell Reports,2006, 25 (5):466-474 ；Rogers, H.J. , Bate, N. , Combe, J. , et al.Functional analysis of cis-regulatory elementswithin the promoter of the tobacco late pollen gene glO[J]. PlantMolecularBiology, 2001, 45(5) :577 - 585.)(圖 2)。由此申請人預測 BnRab⑶ 13 的啟動子可能是一個花藥特異啟動子，而且由于多個成熟花粉特異元件和增強子的存在，它可能在花藥的成熟花粉細胞中表達量最高。本發明通過將轉PBnKabeDI3連接報告基因⑶S構建的植物表達載體pBI-PBnKabeDI3轉化擬南芥，對獲得的轉基因植株進行活性檢測的結果表明該啟動子驅動的⑶S基因僅在擬南芥的花藥中高效表達，在種子、葉片、根及莖中均不表達。因此，PBnEabGDI 3具有驅動下游基因在擬南芥花藥中聞效表達，而在種子和其他部位不表達的功能。這一具有組織特異性表達的啟動子在植物基因工程和轉基因安全(食用)中具有良好的應用價值。2、一種甘藍型油菜啟動子PBnKabeDI3在轉基因植株的花藥中的應用，其步驟是2. lPBnEabGDI3植物表達載體的構建和根癌農桿菌菌株EHA105 (購于上海滬尚生物科技有限公司，以下相同)的轉化構建的重組載體是將質粒pBI121(購自TaKaRa公司，以下相同)上的35S啟動子用技術方案I中克隆得到PBnEabeDI3片段替換而來。為完成此目的，首先用Xba Ι/Κρη I(Chen, P. Y. , Wang, C. K. , Soong, S. C. To, Κ. Y. Complete sequence of the binary vectorpBI121and itsapplication in cloning T-DNA insertion from transgenic plants. Mol.Breed. 11，287-293)雙酶切克隆載體pMD18-PBnEaM)I3的啟動子片段，同時用Xba I/Kpn I(前面已述)酶切PBI121質粒。酶切體系(前面已述)為10 μ 1，酶切反應在37度培養箱中進行，約4-6個小時之后，用I. 0% (前面已述)瓊脂糖膠電泳檢測。將克隆載體pMD18-PBnEabeDI3酶切下的大片段(大小為2064bp，和pBI121 (前面已述)酶切下的小片段(約1400bp)用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按pMD18-PBnEabeDI3酶切下的大片段和pBI121 (前面已述)酶切下的小片段(150ng大片段50ng小片段)=3:1的比例(摩爾濃度比)混合樣品，力口入T4DNA連接酶I μ 1，IOX反應緩沖液I μ 1，無菌的ddH20補充體積至10 μ L，16°C連接過夜。熱激法(前面已述)轉化gold菌株的感受態細胞(前面述)后,在含有卡那霉素(50μ g/mL)的固體LB培養基(前面述)平板上篩選，挑取白色菌斑做菌落PCR (前面述)，提取質粒(前面已述)，經酶切驗證大小正確(酶切片段為2064bp)的重組質粒命名為pBI-PBnKabeDI3 (圖3)。利用凍融法(J.薩姆布魯克.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社，以下相同)轉化農桿菌EHA105 (前面已述)步驟如下I :取0. 2ml農桿菌感受態，于冰中緩慢融化。 2 :加入約2 μ g重組質粒DNA，輕輕混勻，冰浴30min后，投入液氮速凍lmin，然后37°C水浴5min，融化細胞。3 :加入800 μ I不含抗生素LB液體培養基(前面已述)，28°C輕搖培養4_5h。4:12000rpm，30s，去上清，細胞重懸于0. 2ml LB液體培養基(前面已述)培養基。5 :將培養物均勻涂布在含Rif (50mg/L),Str (50mgL)和Kan (50mgL)的LB固體培養基(前面已述)雙抗瓊脂板上，280C培養2天，待平板上出現轉化子后挑取單菌落進行菌落PCR檢測驗證(前面已述)。2. 2PBnEabGDI3 的功能分析2. 2. lPBnEabGDI3植物表達載體pBI-PBnEabeDI3在擬南芥中的遺傳轉化及轉基因植株篩選米用花序侵染法(ZhangX. R. et al. Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature, 2006,1:1-6,以下相同)進行擬南芥轉化。制備含有重組載體pBI-PBnEabeDI3的根癌農桿菌EHA105 (前面已述)菌液，在轉化前一天轉入含有卡那霉素50 μ g/ml、利福平50 μ g/ml的LB液體培養基(前面已述)中，28°C過夜培養。第二天，用紫外分光光度計(SPEK0L1300)于276nm納米波長下檢測菌液的吸光值，當菌液的吸光值達到在I. 6-2. O之間時取出。室溫(20-25°C，以下相同)下以4000g離心lOmin，棄上清，沉淀懸浮于等體積的5%蔗糖溶液(蔗糖與蒸餾水的質量體積t匕，以下相同)中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養皿中，轉化前加入終濃度為0. 02% (體積比)的Silwet 1-77 (購自北京五洲元業科貿中心，以下相同)?；靹蚝蟀汛D化的擬南芥整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數15秒，取出植株。轉化后的植株用一個黑色塑料袋包好，放在生長箱培養。第二天將塑料袋揭開，放在光強的地方培養。隔一周再做一次轉化。培養一個月左右收獲種子，種子在培養箱或者日光下干燥3-5天。將轉化收獲的TO代種子用70% (體積比)酒精和0. 1% (質量比)的升汞分別表面消毒3分鐘和10分鐘，然后用蒸餾水洗滌數次(5 7次)，然后均勻地吹打到含有濃度為50mg/L卡那霉素的MS固體篩選培養基(MS大量元素母液100ml ；MS微量元素母液10ml ；MS有機母液10ml ；MS鐵鹽IOml ；肌醇IOml ;蔗糖30g ;用IM NaOH調PH至5. 8，12g瓊脂粉，定容至1L，高壓121度滅菌后備用。加入Sg瓊脂粉可配置成固體培養基。各種母液配方見表I)表面。4°C春化4-6天，放入恒溫培養箱(光周期16 (白天)/8 (黑暗)小時，溫度白天22°C，暗周期20°C)培養，篩選得到的轉化植株，稱Tl代轉化植株(以下相同)。根據表達載體上特有的卡那霉素抗性篩選陽性植株。葉片長到足夠大小時(3-4葉期)，取少許綠苗葉片，提取DNA，進行轉化材料的 PCR 陽性檢測(以下相同)。引物為 NPT II F :5' -GATGGATTGCACGCAGGT-3'和 NPT II R 5 ' -TCAGAAGAACTCGTCAAG-3 '，反應體系為 10 μ I 內含模板 DNA 模板 I μ L (約 50ng)，IOXTaq buffer (含 MgCl2) I μ 1，I. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ 1，5’ 弓丨物(lOymol/L)0. 5μ 1，3，引物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，Taq (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，ddH205. 5 μ I。反應條件為94°C 5分鐘，94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分鐘，32個循環，72°C 10分鐘，擴增大小為800bp(圖4)。結果表明獲得了轉基因陽性植株(含有檢測目的片段的植株稱陽性植株，以下相同)。表IMS培養基母液配方
權利要求
1.一種分離的啟動子PBnRab⑶13，其序列為SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求I所述的一種分離的啟動子，其特征在于所述的啟動子含有重組載體 PBI- PBnRab⑶I3。
3.權利要求I所述的一種甘藍型油菜啟動子PBnRabGDI3的制備方法，其步驟是 (O油菜啟動子PBnRab⑶13的引物序列 根據油菜全基因組測序獲得的Bn Rab⑶13基因上游2kb序列設計一對引物進行PCR擴增，擴增獲得油菜BnRab⑶13的5’上游啟動子序列，所用引物為PBnRab⑶I3S 5丨CAGaagcttGAGTAAATACAGAACAGTGTTAC-3 '和 PBnRab⑶I3A :5' - GACAtctagaTGTTGCAACCAATCTCTATTATC-3 '; (2)油菜啟動子PBnRab⑶13的制備 根據油菜全基因組測序獲得的BnRab⑶13的5’上游2kb序列設計所用的引物PBnRab⑶I3S和PBnRab⑶I3A，利用SDS裂解法提取油菜葉片基因組DNA，以此為模板進行PCR擴增，步驟是提取油菜基因組DNA 25 μ 1，以此為模板進行擴增，反應體系為50 μ I,分別添加 IOXEx Taq buffer 5 μ 1，dNTP 4 μ 1，5’ 引物 I μ 1，3’ 引物 I μ 1，ExTaq0.5 μ 1，DNA模版I yl50ng，ddH20 37. 5μ I,擴增產物大小為2064 bp，PCR反應程序為940C 5分鐘，94°C I分鐘，60°C I分鐘，72°C 2分鐘，33個循環，72°C 10分鐘，16°C 3小時，PCR產物經I. 0%質量體積比瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒純化回收后，連接到PMD18-T載體，熱激法轉化gold菌株的感受態細胞，挑取陽性克隆，PCR檢測陽性和酶切驗證后測序，得到目的基因上游2kb側翼序列，經過生物信息學分析此序列為BnRab⑶13的啟動子全長序列，命名為PBnRab⑶13。
4.權利要求I中所述的一種分離的啟動子PBnRabGDI3在擬南芥花藥中的應用。
5.權利要求I中所述的一種分離的啟動子PBnRabGDI3在擬南芥花粉粒中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種甘藍型油菜BnRabGDI3啟動子的制備方法及應用。其步驟1、獲得啟動子PBnRabGDI3擴增的引物序列根據油菜全基因組測序獲得的PBnRabGDI3基因上游2kb序列設計引物進行PCR擴增；2、利用SDS裂解法提取油菜葉片基因組DNA，進行PCR擴增，凝膠回收試劑盒純化回收后，連接到pMD18-T載體，熱激法轉化gold菌株的感受態細胞，挑取陽性克隆，得到目的基因上游2kb側翼序列，序列為PBnRabGDI3。GUS染色結果表明PBnRabGDI3在油菜花藥、花粉粒中高效表達，在根、莖、葉、角果和種子等組織中不表達。該啟動子在油菜轉基因食用油安全性，提高作物品質和人工創建種質資源等方面，具有良好的應用潛力。
文檔編號C12N15/113GK102965374SQ20121049138
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月27日 優先權日2012年11月27日
發明者劉勝毅, 董彩華, 黃軍艷, 李振波, 劉越英, 程曉輝 申請人:中國農業科學院油料作物研究所