專利名稱：一種高細胞密度發(fā)酵制備小球藻的方法
技術領域：
本發(fā)明是一種高細胞密度發(fā)酵制備小球藻的方法，屬生物技術領域。
背景技術：
小球藻作為一種重要的微藻資源，具有極其豐富的營養(yǎng)成分和優(yōu)良的醫(yī)療保健作用。含有豐富的蛋白質、氨基酸、色素、多不飽和脂肪酸等，營養(yǎng)全面，是水產(chǎn)及畜牧養(yǎng)殖理想的飼料原料。其蛋白質含量50% 67%，其中含有人體所必須的20種氨基酸、多種維生素和微量元素，以及亞麻酸、亞油酸、類胡蘿卜素等成分。小球藻中富含小球藻生長因子(CGF)，能迅速恢復養(yǎng)殖動物機體造成的損傷。小球藻中含有的生物活性物質糖蛋白、多糖體以及高達13%的核酸等物質具有顯著的抑瘤抗癌、增強免疫及抗病毒感染的活性。在水產(chǎn)養(yǎng)殖上，單細胞的小球藻可直接作為海水魚育苗的水質調(diào)節(jié)以及輪蟲、鹵蟲等海水魚育苗活餌料的培育餌料，也可以用于海水魚、海參、對蝦等的餌料添加劑，具有很高的經(jīng)濟價值。近二十年來，環(huán)渤海地區(qū)乃至全國的海水養(yǎng)殖發(fā)展迅猛。小球藻作為海水魚、對蝦等苗期生長飼料和水質調(diào)節(jié)的開發(fā)愈顯重要。目前，限制小球藻在海水養(yǎng)殖方面應用的原因概括起來包括藻種營養(yǎng)成分含量偏低、產(chǎn)出成本高、大規(guī)模培養(yǎng)下控制雜菌污染等技術瓶頸尚待突破。時下采用的生產(chǎn)方式大多為跑道式養(yǎng)殖池或袋式光合培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方式受氣候條件(溫度、光照等)的影響比較大，而且易受敵害(輪蟲、纖毛蟲等)的侵襲，養(yǎng)殖產(chǎn)量低且難以穩(wěn)定。日本、韓國等國家海水魚育苗已大量使用發(fā)酵小球藻，而國內(nèi)使用的發(fā)酵小球藻全部依賴進口產(chǎn)品。小球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)(發(fā)酵法)為解決這一問題提供了可能。本專利技術提供了一種自養(yǎng)和異養(yǎng)并行的小球藻制備高細胞密度的發(fā)酵方法。利用異養(yǎng)化技術進行小球藻的高細胞密度培養(yǎng)，克服戶外開放式養(yǎng)殖和光生物反應器培養(yǎng)的諸多缺陷，發(fā)揮異養(yǎng)化培養(yǎng)小球藻具有的生長速度快、能實現(xiàn)純種培養(yǎng)、單位體積產(chǎn)率高、便于自動化控制等優(yōu)勢，為實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)小球藻，且小球藻的營養(yǎng)成分與關照培養(yǎng)方式獲得的小球藻基本持平。為海水養(yǎng)殖提供優(yōu)良的餌料奠定了技術保障。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用自養(yǎng)和異養(yǎng)并行的培養(yǎng)方法高細胞密度發(fā)酵制備小球藻。為了實現(xiàn)這一目的，本發(fā)明采用以下技術方案首先在發(fā)酵罐中安裝防水、防爆照明燈，使得發(fā)酵液在發(fā)酵罐中處于照度為3500LUX的條件；先將含有5mL固體培養(yǎng)基的L管藻種在28°C下活化培養(yǎng)24h，然后在錐形瓶中光照液體搖瓶擴大培養(yǎng)，28°C振蕩培養(yǎng)24h ；再將擴大培養(yǎng)后的藻種接種到帶有光照的全自動液體發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中26-30°C發(fā)酵培養(yǎng)，前8小時采用光照與低速攪拌微通氣的方法進行，通氣量O. 1-0. 3VVM ;第9小時開始采用光照與機械攪拌通氣發(fā)酵培養(yǎng)并行的方法進行；通氣量I. 0-1. 5VVM，直至發(fā)酵結束發(fā)酵24小時后，開始流加補碳和流加補氮，并始終保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在20% ,NH4NO3濃度在15%，發(fā)酵進行至60小時，停止補料；發(fā)酵總時間為72小時；發(fā)酵結束后，將培養(yǎng)液離心，棄去上清，得小球藻；進行小球藻有效成分的檢測；所述固體培養(yǎng)基、錐形瓶用液體培養(yǎng)基和發(fā)酵罐用發(fā)酵培養(yǎng)基成分分別為I)固體培養(yǎng)基成分葡萄糖2g/L、NaNO3 I. 5g/L、MgSO4 · 7H20 O. 075g / UCaCl2 · 2H20 0. 036g/L酵母浸出粉0. 03g / L，瓊脂 0. 05g / L，pH6. 8 ；2)錐形瓶用液體培養(yǎng)基成分葡萄糖2g / UNaNO3 I. 5g / UMgSO4 · 7H20 0. 075g/L、CaCl2 · 2H20 0. 036g/L酵母浸出粉0. 03g/L，pH6. 8 ;3)發(fā)酵培養(yǎng)基成分葡萄糖2g/L、NH4NO3 I. 5g / L、MgSO4 · 7H20 0. 075g / L、CaCl2 · 2H20 0. 036g /L酵母浸出粉0. 05g / L，pH6. 8。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的突出優(yōu)點在于采用光照和機械攪拌通風發(fā)酵培養(yǎng)并行交替的方法進行小球藻發(fā)酵生產(chǎn)，既利用了小球藻的自養(yǎng)生長方式，也利用了小球藻的異養(yǎng)生長方式，發(fā)酵周期短，小球藻營養(yǎng)成分保持完整。避免了目前箱式光照培養(yǎng)易于染菌等諸多不利影響，使在發(fā)酵罐中異養(yǎng)法規(guī)模化生產(chǎn)小球藻成為可能。
具體實施例方式實施例I.前培養(yǎng)是在L-試管中，以無菌操作加入5ml液體培養(yǎng)基，以無菌牙簽接入在固體培養(yǎng)基上的小球藻單藻菌落，280C，140rpm培養(yǎng)24h。將前培養(yǎng)物5ml接種至含有IOOml液體培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，28 °C 150rpm振蕩培養(yǎng)24h。將1600ml錐形瓶培養(yǎng)液，接種于30升光照機械攪拌發(fā)酵罐中的16升滅過菌的發(fā)酵液中，28°C發(fā)酵培養(yǎng)；72小時的發(fā)酵過程中，前8小時采用光照與低速攪拌微通氣的方法進行，通氣量為0. 3VVM，第9小時開始采用光照與機械攪拌通氣發(fā)酵培養(yǎng)并行的方法進行；通氣量I. 2VVM，直至72小時；發(fā)酵至第24小時，開始流加補料保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度為2g/L，NH4N03的濃度為I. 5g / L ;發(fā)酵進行至60小時，停止補料；72小時結束發(fā)酵，取樣檢測，發(fā)現(xiàn)小球藻的色素、蛋白質、氨基酸、多不飽和脂肪酸等成分均達到期望值；小球藻的生長量亦達到期望值。實施例2.前培養(yǎng)是在L-試管中，以無菌操作加入5ml液體培養(yǎng)基，以無菌牙簽接入在固體培養(yǎng)基上的小球藻單藻菌落，280C，140rpm培養(yǎng)24h。將前培養(yǎng)物5ml接種至含有IOOml液體培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，28 °C 150rpm振蕩培養(yǎng)24h。將1600ml錐形瓶培養(yǎng)液，接種于30升光照機械攪拌發(fā)酵罐中的16升滅過菌的發(fā)酵液中，26°C發(fā)酵培養(yǎng)；72小的發(fā)酵過程中，前8小時采用光照與低速攪拌微通氣的方法進行，通氣量為0. 1VVM，第9小時開始采用光照與機械攪拌通氣發(fā)酵培養(yǎng)并行的方法進行；通氣量I. 5VVM，直至72小時結束發(fā)酵。取樣檢測，發(fā)現(xiàn)小球藻的色素、蛋白質、氨基酸、多不飽和脂肪酸等成分均低于期望值；小球藻的生長量為實施例I的30%。實施例3.前培養(yǎng)是在L-試管中，以無菌操作加入5ml液體培養(yǎng)基，以無菌牙簽接入在固體培養(yǎng)基上的小球藻單藻菌落，280C，140rpm培養(yǎng)24h。將前培養(yǎng)物5ml接種至含有IOOml液體培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，28 °C 150rpm振蕩培養(yǎng)24h。將1600ml錐形瓶培養(yǎng)液，接種于30升機械攪拌發(fā)酵罐中的16升滅過菌的發(fā)酵液中，30°C發(fā)酵培養(yǎng)；72小的發(fā)酵過程中，前8小時采用低速攪拌微通氣的方法進行，通氣量為0. 2VVM，第9小時開始采用機械攪拌通氣發(fā)酵培養(yǎng)并行的方法進行；通氣量I. 0VVM，直至72小時結束發(fā)酵，發(fā)酵至第24小時，開始流加補料；保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度為2g / L，NH4NO3的濃度為I. 5g / L ;發(fā)酵進行至60小時，停止補料；72小時結束發(fā)酵，取樣檢測，發(fā)現(xiàn)小球藻的色素極度低下、蛋白質、氨基酸、多不飽和脂肪酸等成分均未達到期望值。小球藻的生長量為實施例I的50%。
權利要求
1.一種高細胞密度發(fā)酵制備小球藻的方法，其特征在于采用光照、機械攪拌通氣發(fā)酵和流加補碳補氮并行方式培養(yǎng)；該方法包括以下步驟首先在發(fā)酵罐中安裝防水、防爆照明燈，使得發(fā)酵液在發(fā)酵罐中處于照度為3500LUX的條件；先將含有5mL固體培養(yǎng)基的L管藻種在28°C下活化培養(yǎng)24h，然后在錐形瓶中光照液體搖瓶擴大培養(yǎng)，28°C振蕩培養(yǎng)24h ；再將擴大培養(yǎng)后的藻種接種到帶有光照的全自動液體發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中26-30°C發(fā)酵培養(yǎng)，前8小時采用光照與低速攪拌微通氣的方法進行，通氣量O. 1-0. 3VVM ;第9小時開始采用光照與機械攪拌通氣發(fā)酵培養(yǎng)并行的方法進行；通氣量I. 0-1. 5VVM，直至發(fā)酵結束；發(fā)酵24小時后，開始流加補碳和流加補氮，并始終保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在20 % ,NH4NO3濃度在15%，發(fā)酵進行至60小時，停止補料；發(fā)酵總時間為72小時；發(fā)酵結束后，將培養(yǎng)液離心，棄去上清，得小球藻；進行小球藻有效成分的檢測；所述固體培養(yǎng)基、錐形瓶用液體培養(yǎng)基和發(fā)酵罐用發(fā)酵培養(yǎng)基成分分別為 1)固體培養(yǎng)基成分葡萄糖 2g/L、NaNO3 I. 5g/L、MgSO4. 7H20 O. 075g/L、CaCl2. 2H20 0. 036g/L酵母浸出粉 0. 03g / L，瓊脂 0. 05g/L, pH 6. 8 ； 2)錐形瓶用液體培養(yǎng)基成分葡萄糖 2g/L、NaNO3 I. 5g/L、MgSO4. 7H20 O. 075g/L、CaCl2. 2H20 0. 036g/L 酵母浸出粉0.03g/L，pH 6.8 ； 3)發(fā)酵培養(yǎng)基成分葡萄糖 2g/L、NH4NO3L 5g/L, MgSO4. 7H2OO. 075g/L, CaCl2. 2H20 0. 036g/L 酵母浸出粉0.05g / L，pH6.8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高細胞密度發(fā)酵制備小球藻的方法。該方法包括以下步驟先在發(fā)酵罐中安裝防水、防爆照明燈；將含有5mL固體培養(yǎng)基的L管藻種活化培養(yǎng)，然后在錐形瓶中光照液體搖瓶擴大培養(yǎng)；再將擴大培養(yǎng)后的藻種接種到帶有光照的全自動液體發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中通氣發(fā)酵培養(yǎng)，期間流加補碳和流加補氮，并始終保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在20％，NH4NO3濃度在15％，發(fā)酵進行至60小時，停止補料；發(fā)酵總時間為72小時；發(fā)酵結束后，將培養(yǎng)液離心，棄去上清，得小球藻。利用本發(fā)明的自養(yǎng)和異養(yǎng)并行的發(fā)酵方法高細胞密度制備小球藻，工藝簡單，發(fā)酵周期短，小球藻營養(yǎng)成分完整，使在發(fā)酵罐中異養(yǎng)法規(guī)模化生產(chǎn)小球藻成為可能。
文檔編號C12N1/12GK102925360SQ20121049132
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月27日 優(yōu)先權日2012年11月27日
發(fā)明者宋存江, 孫楊, 王淑芳, 李強 申請人:南開大學